现代生物技术在发酵中的应用.ppt

现代生物技术在发酵中的应用现在学习的是第1页，共37页 生物技术的内容大致分为两个方面：直接型生物细胞的利用技术和模拟型生物细胞的利用技生物技术的内容大致分为两个方面：直接型生物细胞的利用技术和模拟型生物细胞的利用技术。以现代前沿技术来说，一般认为有四方面：即基因操作技术；细胞融合技术；细胞大量培养术。以现代前沿技术来说，一般认为有四方面：即基因操作技术；细胞融合技术；细胞大量培养技术和生物反应器技术。可概括为基因工程，细胞工程，发酵工程和酶工程，与生化工程关系也技术和生物反应器技术。可概括为基因工程，细胞工程，发酵工程和酶工程，与生化工程关系也很密切，也可并入，构成五大工程。很密切，也可并入，构成五大工程。生物技术的应用，已经取得相当大的成果，特别是在医药方面，已经开发展生物技术的应用，已经取得相当大的成果，特别是在医药方面，已经开发展出了不少的新药，见表出了不少的新药，见表1 1。生物技术中，当前人们最感兴趣的是基因工程和细胞工程，它们是生物技术的主导领生物技术中，当前人们最感兴趣的是基因工程和细胞工程，它们是生物技术的主导领域，也是热点。形成独特产业的发酵工程和酶工程等也是生物技术中的重要组成部分。这域，也是热点。形成独特产业的发酵工程和酶工程等也是生物技术中的重要组成部分。这几方面的内容是相互联系和互相促进的。几方面的内容是相互联系和互相促进的。基因工程和细胞工程常常是发酵工程和酶工程的基础，基因工程和细胞工程常常是发酵工程和酶工程的基础，所以现代发酵工程包括整个生物工艺过程所以现代发酵工程包括整个生物工艺过程。作为发酵工业来说，除了传统的利用天然微生物发酵作为发酵工业来说，除了传统的利用天然微生物发酵生产初级代谢产物和次级代谢产物外，由于生物技术的出现，发酵工业所涉及的范围得到扩大，生产初级代谢产物和次级代谢产物外，由于生物技术的出现，发酵工业所涉及的范围得到扩大，生产技术得到改造，因而发酵生产能力和控制水平大为提高。生产技术得到改造，因而发酵生产能力和控制水平大为提高。现在学习的是第2页，共37页DNADNA重组技术获得的部分药品重组技术获得的部分药品药物名称药物名称适应性适应性胰岛素胰岛素 糖糖尿病尿病生长激素生长激素侏儒症侏儒症血清白蛋白血清白蛋白外科外科休克休克烧伤烧伤蛋白因子蛋白因子血友病血友病尿激酶尿激酶心脏病发作、中风心脏病发作、中风组织血纤维蛋白溶酶原活化剂组织血纤维蛋白溶酶原活化剂血栓症血栓症干扰素干扰素癌症癌症病毒感染病毒感染淋巴激活素淋巴激活素癌症癌症自动免疫病自动免疫病感染感染白细胞介素白细胞介素是一种淋巴因子具多种功能是一种淋巴因子具多种功能肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子(TNF)抗李斯特菌致死攻击、血管生成等抗李斯特菌致死攻击、血管生成等心钠素心钠素（ANP）具有强利尿、扩张血管和降压作用等具有强利尿、扩张血管和降压作用等现在学习的是第3页，共37页 像像基基因因工工程程所所获获得得的的工工程程菌菌一一样样，许许多多哺哺乳乳动动物物的的基基因因克克隆隆在在大大肠肠杆杆菌菌等等宿宿主主中中能能够够得得到到表表达达等等等等。使使用用小小鼠鼠体体内内法法生生产产单单克克隆隆抗抗体体，产产品品常常含含有有毒毒性性杂杂质质和和不不易易大大量量生生产产等等缺缺点点，目目前前也也采采用用同同微微生生物物发发酵酵一一样样的的发发酵酵罐罐的的生生物物反反应应器器来来进进行行催催化化反反应应，获获得得所所需需的的产产物物。酶酶工工程程中中的的固固定定化化细细胞胞（或或酶酶）也也可可用用类类似似发发酵酵罐罐的的生生物物反反应应器器来来进进行行催催化化反反应应，获获得得所所需需的的产产物物。这这些些事事实实都都说说明明它它们们之之间间的的密密切切关关系系，也也说说明明发发本本酵酵（或或类类似似发发酵酵）技技术在制得产品中的地位。另外，计算机技术用于发酵控制也已趋于广泛。术在制得产品中的地位。另外，计算机技术用于发酵控制也已趋于广泛。一一.工程菌的发酵工程菌的发酵1.1.工程菌的来源和应用工程菌的来源和应用 基因工程是在生物体外对基因工程是在生物体外对DNADNA分子进行重新组合，然后克隆到适合的宿分子进行重新组合，然后克隆到适合的宿生细胞，进行增殖和表达的遗传操作。所得重组体菌株即是工程菌。获得它生细胞，进行增殖和表达的遗传操作。所得重组体菌株即是工程菌。获得它的基本过程如图。的基本过程如图。基因工程的关键问题在于目的基因在宿主细胞中能否表达，即基因工程的关键问题在于目的基因在宿主细胞中能否表达，即DNADNA在宿在宿 主细胞中能否转录和翻译，表达形成的产物在胞内不被分解，并能分泌到胞主细胞中能否转录和翻译，表达形成的产物在胞内不被分解，并能分泌到胞外。而基因表达过程是多层次的，因此影响基因表达的因素也是多方面的。外。而基因表达过程是多层次的，因此影响基因表达的因素也是多方面的。现在学习的是第4页，共37页现在学习的是第5页，共37页比较理想的、能够成为工业使用的基因工程菌应具备下列条件：比较理想的、能够成为工业使用的基因工程菌应具备下列条件：1 1）发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，当然也是分泌型菌株；）发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，当然也是分泌型菌株；2 2）菌株能利用常用的碳源（如糖蜜、淀粉等），并可进行连续培养；）菌株能利用常用的碳源（如糖蜜、淀粉等），并可进行连续培养；3 3）菌株是不致病的，也不产生内毒素；）菌株是不致病的，也不产生内毒素；4 4）发酵所产生的热量和需氧量都较低，发酵温度也适当；）发酵所产生的热量和需氧量都较低，发酵温度也适当；5 5）代谢控制容易进行；）代谢控制容易进行；6 6）能进行适当的重组）能进行适当的重组DNADNA，并且稳定，重组的，并且稳定，重组的DNADNA不易丢失。不易丢失。基基因因工工程程技技术术已已趋趋于于成成熟熟，所所得得工工程程菌菌已已得得到到应应用用，并并已已开开发发出出不不少少产产品品投投入入市市场场如如胰胰岛岛素素、干干扰扰素素、生生长长激激素素和和乙乙型型肝肝炎炎疫疫苗苗等等，还还有有几几十十种种可可能能成成为为药药物物的的产产品品正正在在开开发发中中。在在氨氨基基酸酸工工程程菌菌组组建建上上，也也获获得得了了成成功功，如如高高产产的的苏苏氨氨酸酸工工程程菌菌。在在抗抗生生素素生生物物合合成成上上，在在分分析析和和分分离离生生物物合合成成基基因因结结构构特特点点和和表表达达调调节节的的基基础础上上，已已成成功功地地把把基基础础因因工工程程技技术术用用于于提提高高抗抗生生素素的的产产量量上上，如如将将头头孢孢菌菌素素生生物物合合成成的的限限制制性性扩扩环环酶酶基基因因克克隆隆到到产产生生菌菌中中，使使头头孢孢菌菌素素C C的的产产量量提提高高了了15%15%。我我国国在在基基因因工工程程研研究究开开发发上上，也也取取得得了了不不少少成成就就：已已获获得得青青霉霉素素酰酰化化酶酶基基因因工工程程菌，并中试成功，达菌，并中试成功，达195u/ml195u/ml水平；利用工程菌也中试成功人水平；利用工程菌也中试成功人a a型干扰素等。型干扰素等。现在学习的是第6页，共37页2 2、工程菌的培养、工程菌的培养（1 1）基因重组细胞的种类）基因重组细胞的种类 宿宿主主细细胞胞可可以以采采用用原原核核的的大大肠肠杆杆菌菌和和枯枯草草杆杆菌菌、真真核核细细胞胞的的酵酵母母菌菌和和哺哺乳乳动动物物细细胞胞等等。所所以以，生生产产基基因因重重组组产产物物就就有有不不同同的的菌菌体体或或细细胞胞。但但当当前前生生产产上上使使用用多多的的仍仍以以大大肠肠杆杆菌菌为为主主，因因为为在在大大肠肠杆杆菌菌中中，多多种种哺哺乳乳动动物物和和其其他他微微生生物物的的蛋蛋白白基基因因能能够够得得到到高高效效表表达达，产产物物能能得得到到过过量量生生产产、产产量量可可达达大大肠肠杆杆菌菌菌菌体体总总蛋蛋白白的的50%50%（如如人人胰胰岛岛素素）。这这就就为为生生产产多多种种蛋蛋白白药药物物（如如白白细细胞胞介介素素-2-2，人人生生长长激激素素、干干扰扰素素等等），提提供供了了基基础础。但但大大肠肠杆杆菌菌不不具具备备分分泌泌系系统统，产产生生的的产产物物以以包包含含体体（inclusion inclusion bodybody）形形式式存存在在于于细细胞胞质质中，这给分离纯化造成了困难。因此，人们才研究能分泌蛋白的酵母系统和枯草杆菌系统中，这给分离纯化造成了困难。因此，人们才研究能分泌蛋白的酵母系统和枯草杆菌系统（2 2）工程菌的培养）工程菌的培养 工工程程菌菌的的培培养养与与普普通通微微生生物物的的好好气气培培养养无无大大差差异异，但但有有其其特特点点。从从培培养养工工程程来来看看，其其主主要要因因素素有有：营营养养源源（碳碳源源、氮氮源源、氨氨基基酸酸、溶溶解解氧氧等等）浓浓度度的的控控制制和和有有毒毒代代谢谢产产物物的的排排除除。在在生生物物学学上上还还应应考考虑虑：质质粒粒的的稳稳定定性性、质质粒粒拷拷贝贝数数的的控控制制、转转录录效效率率的的提提高高与与控控制制、翻翻译译效效率率的的提提高高以以及及菌菌体体向向外外分分泌泌产产物物等等因因素素。因因此此，工工程程菌菌的的开开发发研研究究仍仍须须重重视视培培养养技技术，才能获得大量产物。术，才能获得大量产物。现在学习的是第7页，共37页 培养装置培养装置 在在进进行行以以工工业业化化为为目目的的DNADNA重重组组实实验验，以以及及为为生生产产异异种种基基因因产产物物而而培培养养重重组组菌菌，应应采采用用简简便便易易行行的的培培养养系系统统。以以大大肠肠杆杆菌菌为为主主的的宿宿生生的的培培养养多多使使用用一一般般的的通通气气搅搅拌拌罐罐。基基因因重重组组动动物细胞的培养，实际上与过去动物细胞培养一样，所用的培养装置和措施与微生物培养并不相同。物细胞的培养，实际上与过去动物细胞培养一样，所用的培养装置和措施与微生物培养并不相同。工工程程菌菌的的基基础础实实验验仍仍使使用用常常规规的的培培养养皿皿、试试管管、玻玻璃璃瓶瓶等等培培养养器器。实实验验者者应应按按实实验验准准则则的的要要求求，谨谨慎慎进进行行操操作作，应应使使用用移移液液抢抢处处理理重重组组体体，操操作作应应在在安安全全柜柜（或或室室）中中进进行行，目前已有规定的细则，以防止工程菌外漏和扩散。目前已有规定的细则，以防止工程菌外漏和扩散。中中间间试试验验或或大大量量提提纯纯产产物物时时，必必须须进进行行重重复复性性好好的的稳稳定定培培养养。要要取取得得大大量量培培养养液液或或培培养养数数据据，要要用用带带各各种种传传感感器器的的培培养养罐罐，以以测测定定和和控控制制pHpH值值、溶溶解解氧氧、底底物物浓浓度度等等参参数数。许许多多培培养养数数据据还还可可通通过过联联机机取取得得，或或经经自自动动分分析析记记录录下下来来，这这样样自自动动化化系系统统能能有有效效地地减减少少实实险险操操作作者者与与基基因因重重组组体体的的接接触触机机会会。密密闭闭型型通通气气搅搅拌拌培培养养罐罐按按采采用用高高压压蒸蒸气气灭灭菌菌。工工程程菌菌的的培培养养装装置置既既要要防防止止外外界界微微生生物物侵侵入入罐罐内内，污污染染杂杂菌菌，又又必必须须不不使使重重组组体体外漏。这是与沿用的通气搅拌式培养罐的区别所在。外漏。这是与沿用的通气搅拌式培养罐的区别所在。现在学习的是第8页，共37页 培养基和高密度发酵培养基和高密度发酵 微生物生产的蛋白质类产物，常是一种粗品，因此可以使用各种复杂培养基。微生物生产的蛋白质类产物，常是一种粗品，因此可以使用各种复杂培养基。但工程菌的产物多属于人或畜体内蛋白质，需要有很高的纯度，否则，不能在体但工程菌的产物多属于人或畜体内蛋白质，需要有很高的纯度，否则，不能在体内使用，所以，发酵生产须要有严格的要求。内使用，所以，发酵生产须要有严格的要求。工程菌发酵有两条基本要求，首先是工程菌发酵有两条基本要求，首先是要使菌体生长良好，获得高浓度菌体（即高密度发酵），这样才能得到最多的产物；要使菌体生长良好，获得高浓度菌体（即高密度发酵），这样才能得到最多的产物；其次是发酵所用培养基的成分必须保持尽可能的简单，以便分离产物。其次是发酵所用培养基的成分必须保持尽可能的简单，以便分离产物。据报道，培养大肠杆菌最高可得干重菌体据报道，培养大肠杆菌最高可得干重菌体125g/L125g/L，酿酒酵母可得，酿酒酵母可得145 g/L145 g/L。枯草杆。枯草杆菌大概可得干菌体菌大概可得干菌体20-40 g/L20-40 g/L。这些数值还不是工程菌培养的结果。这些数值还不是工程菌培养的结果。我国对人我国对人a a1 1型干型干扰素工程菌（大肠杆菌扰素工程菌（大肠杆菌K K1212系系BMH71-18BMH71-18株），进行高密度发酵，得到株），进行高密度发酵，得到100.25 g/L100.25 g/L的菌体。的菌体。这与培养非工程菌的菌量相接近。这与培养非工程菌的菌量相接近。大肠杆菌、其他细菌和酵母菌在合成培养中都能良好地生长。工程菌发酵所使用大肠杆菌、其他细菌和酵母菌在合成培养中都能良好地生长。工程菌发酵所使用的培养基也是合成培养基，包括葡萄糖、铵盐和无机盐等。其组成必须满足获得高浓的培养基也是合成培养基，包括葡萄糖、铵盐和无机盐等。其组成必须满足获得高浓度菌体的要求，发酵中间过程还必须补加碳源和氮源，也用氨水来调节控制发酵度菌体的要求，发酵中间过程还必须补加碳源和氮源，也用氨水来调节控制发酵pHpH。其他的培养条件，如搅拌转速（与剪切力有关）、溶解氧、培养温度、培养其他的培养条件，如搅拌转速（与剪切力有关）、溶解氧、培养温度、培养pHpH、接种龄、接种龄和接种量等条件，对菌体生长和产物产量都有影响。和接种量等条件，对菌体生长和产物产量都有影响。现在学习的是第9页，共37页 从安全性来考虑菌体营养源的问题，培养工程菌的外界条件至少要遵守物理密封（从安全性来考虑菌体营养源的问题，培养工程菌的外界条件至少要遵守物理密封（P P1 1P P4 4）方法中的）方法中的P P1 1级规定。从生物安全性来考虑，常采用维生素或氨基酸营养缺陷型的级规定。从生物安全性来考虑，常采用维生素或氨基酸营养缺陷型的工程菌。工程菌。维生素缺陷型仅需极少量维生素，过量也无影响。在培养氨基酸缺陷型菌株达到高浓维生素缺陷型仅需极少量维生素，过量也无影响。在培养氨基酸缺陷型菌株达到高浓度菌体之前，培养一开始就要加入必需量的氨基酸，这样就会因过量氨基酸而抑制菌的生长。为度菌体之前，培养一开始就要加入必需量的氨基酸，这样就会因过量氨基酸而抑制菌的生长。为此，可采用调节此，可采用调节pHpH的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法，使整个培养期间葡萄的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法，使整个培养期间葡萄糖和氨基酸的浓度几乎保持恒定，培养大肠杆菌糖和氨基酸的浓度几乎保持恒定，培养大肠杆菌C600C600菌株时获得菌株时获得60 g/L60 g/L干菌体。菌干菌体。菌体对葡萄糖及氨基酸的收得率因培养条件不同而不同。以葡萄糖、苏氨酸、亮氨酸、组氨体对葡萄糖及氨基酸的收得率因培养条件不同而不同。以葡萄糖、苏氨酸、亮氨酸、组氨酸、色氨酸为营养源时，平均每克所得菌体量（干重）分别为酸、色氨酸为营养源时，平均每克所得菌体量（干重）分别为0.30.3、2.52.5、1515、4040、40g40g。以。以获得获得1g1g菌体所需要营养源的价格进行比较，苏氨酸的费用最高，因此要避免用苏氨酸菌体所需要营养源的价格进行比较，苏氨酸的费用最高，因此要避免用苏氨酸缺陷型作基因重组用的宿主菌，最好使用维生素缺陷型菌株。缺陷型作基因重组用的宿主菌，最好使用维生素缺陷型菌株。菌株和质粒的稳定性菌株和质粒的稳定性 在在工工业业发发酵酵运运行行中中，菌菌株株必必须须具具有有很很好好的的稳稳定定性性。对对工工程程菌菌发发酵酵来来说说，细细胞胞中中的的质质粒粒稳稳定定性性和和质质粒粒内内在在稳稳定定性性同同样样重重要要。质质粒粒保保存存率率高高，相相应应地地就就会会得得到到高高浓浓度度的的产产物物。在在进进行行摇摇瓶瓶试试验验时时，因因菌菌体体浓浓度度低低，无无须须考考虑虑质质粒粒稳稳定定性性的的问问题题，但但在在研研究究工工业业化化生生产产时时，这这是是一一个个极极为为重重要要的的课题。在含有抗生素抗性标记相应的培养基中进行培养，保持选择压力。课题。在含有抗生素抗性标记相应的培养基中进行培养，保持选择压力。现在学习的是第10页，共37页 有关质粒保持和稳定性的遗传和环境的影响因素，研究的比较多。有人报道，有关质粒保持和稳定性的遗传和环境的影响因素，研究的比较多。有人报道，大肠杆菌大肠杆菌RRIRRI中的中的pBR322pBR322质粒可以维持约质粒可以维持约6060代。以这样稳定的细胞，代。以这样稳定的细胞，1 1个细胞可以分裂足够个细胞可以分裂足够多的次数，产生细胞密度为多的次数，产生细胞密度为10g/L10g/L的培养液达的培养液达11500L11500L。在。在2424（或少于（或少于2424）小时，就能产）小时，就能产生出象胰岛素、生长激素、干扰素等蛋白质。因此就不需要利用抗生素耐药性来保持稳定生出象胰岛素、生长激素、干扰素等蛋白质。因此就不需要利用抗生素耐药性来保持稳定性，而且另外的方法，如调节温度，使得在相当短的时间内，得到很高水平的基因表达。性，而且另外的方法，如调节温度，使得在相当短的时间内，得到很高水平的基因表达。3.3.安全问题安全问题(1)(1)重重组组DNADNA实实验验准准则则 19741974年年，提提出出了了DNADNA重重组组实实验验具具有有潜潜在在生生物物危危险险的的问问题题。后后来来就就制制订订了了在在实实验验室室中中构构建建工工程程菌菌及及使使用用工工程程菌菌的的实实验验应应遵遵循循的的准准则则，以以保保证证实实验验的的安安全全和和推推动动重重组组DNADNA的的研研究究。这这些些准准则则是是采采用用物物理理密密封封（P P1 1P P4 4）和和生生物物学学密密封封（B B1 1B B2 2）两种方法。）两种方法。物物理理密密封封是是将将重重组组菌菌封封闭闭于于设设备备内内，以以防防止止传传染染给给实实验验人人员员和和向向外外界界扩扩散散。实实验验规规模模在在20L20L以以下下时时，物物理理密密封封由由密密封封设设施施、实实验验室室设设计计和和实实验验注注意意事事项项所所组组成成。密密封封程程度度分分为为P P1 1、P P2 2、P P3 3和和P P4 4级级，数数字字越越大大，密密封封水水平平越越高高。生生物物学学密密封封要要求求用用只只有有在在特特殊殊培培养养条条件件下下才才能能生生存存的的宿宿主主，同同时时用用不不能能转转移移至至其其它它活活细细胞胞的的载载体体，通通过过这这样样组组合合的的宿宿主主载载体体系统，可以防止重组菌向外扩散。系统，可以防止重组菌向外扩散。现在学习的是第11页，共37页 企业中进行重组菌培养的设备标准有企业中进行重组菌培养的设备标准有LS-1LS-1和和LS-2LS-2。LS-2LS-2相当严格，相当严格，工工业生产应在业生产应在LS-1LS-1的设备标准下培养。的设备标准下培养。LS-1LS-1标准要点是：标准要点是：a.a.使用防止重组体外漏、能在密闭状态下进行内部灭菌和培养装置；使用防止重组体外漏、能在密闭状态下进行内部灭菌和培养装置；b.b.培养装置的排气由除菌器排出；培养装置的排气由除菌器排出；c.c.使用易产气溶胶的设备时，要安装可收集气溶胶的安全箱等。使用易产气溶胶的设备时，要安装可收集气溶胶的安全箱等。设计用于基因重组菌的培养装置时，不仅要考虑外部杂菌侵入，还要防止设计用于基因重组菌的培养装置时，不仅要考虑外部杂菌侵入，还要防止重组菌的外漏。此外，培养后的菌体分离、破碎等处理也必须在安全柜内进重组菌的外漏。此外，培养后的菌体分离、破碎等处理也必须在安全柜内进行，或是采用密闭型的设备。行，或是采用密闭型的设备。(2)(2)防止基因重组菌外漏的措施防止基因重组菌外漏的措施 在普通通气搅拌培养罐培养菌体时，可能发生外漏的部分和操作有：在普通通气搅拌培养罐培养菌体时，可能发生外漏的部分和操作有：A A 排气；排气；b b 机械密封；机械密封；c c 取样；取样；d d 培养后的灭菌；培养后的灭菌；e e 接种；接种；f f 放罐。这些部放罐。这些部分和操作均应采取一些措施，以防止重组菌外漏。分和操作均应采取一些措施，以防止重组菌外漏。有关负压洁净室级别分类技术标准和有关负压洁净室级别分类技术标准和 P1P1P4 P4 级实验室适用工况范围见级实验室适用工况范围见下页表。下页表。现在学习的是第12页，共37页负压洁净室级别分类技术标准负压洁净室级别分类技术标准现在学习的是第13页，共37页级别级别 工作特点工作特点 P11.通常用微生物实验室通常用微生物实验室若干低等真核生物及原生动物、磁菌体若干低等真核生物及原生动物、磁菌体2.可用嘴操作吸管可用嘴操作吸管3.对外人进入不限制对外人进入不限制4.可在开放性实验台上进行实验可在开放性实验台上进行实验P21.禁止外人进入实验区域禁止外人进入实验区域无脊椎动物及植物、变温脊椎动物无脊椎动物及植物、变温脊椎动物2.可能发生气溶胶的实验在可能发生气溶胶的实验在II级生物学安全柜级生物学安全柜的生殖细胞和胚胎的生殖细胞和胚胎3.禁止用嘴操作吸管禁止用嘴操作吸管4.室内设高压消互毒柜室内设高压消互毒柜,对废弃物先灭菌再排放对废弃物先灭菌再排放 P31由双重门，气闸和外部隔离开实验区域由双重门，气闸和外部隔离开实验区域变温脊椎动物，无脊椎动物的病毒变温脊椎动物，无脊椎动物的病毒2非本区人员禁止入内非本区人员禁止入内植物病毒灵长类以外的哺乳类及鸟类植物病毒灵长类以外的哺乳类及鸟类3平时送外部空气送入室内，室内排气经平时送外部空气送入室内，室内排气经HEPA滤后排放室外滤后排放室外4在在II级生物学安全柜内进行实验级生物学安全柜内进行实验5实验人员工作服为室内专用，先灭菌后，再拿实验人员工作服为室内专用，先灭菌后，再拿到外面去洗涤到外面去洗涤P41采用独立建筑物由隔离区与外部隔断采用独立建筑物由隔离区与外部隔断2根据相应隔离等级，保持室内负压根据相应隔离等级，保持室内负压3在密闭型生物学安全柜（在密闭型生物学安全柜（GBLII级）内做实验级）内做实验4非本区人员禁止入内非本区人员禁止入内5取出器材，废弃物先经双门高压消毒柜灭菌消取出器材，废弃物先经双门高压消毒柜灭菌消毒后，再取出，排出废液也要先灭菌后再排放毒后，再取出，排出废液也要先灭菌后再排放6实验入口处设置国际生物学危险标志实验入口处设置国际生物学危险标志灵长类的癌及致癌性研究灵长类的癌及致癌性研究 现在学习的是第14页，共37页如何提高高产菌的稳定性？如何提高高产菌的稳定性？（1 1）首先在菌种选育中应把菌株产量分布中的稳度作为评价菌株的条件之一。不）首先在菌种选育中应把菌株产量分布中的稳度作为评价菌株的条件之一。不仅以产量高低为基准；仅以产量高低为基准；（2 2）菌株选育中避免使用含有多核的包子和菌丝片断；）菌株选育中避免使用含有多核的包子和菌丝片断；（3 3）用单倍化试剂处理高产菌株，有提高菌株稳定性的作用；）用单倍化试剂处理高产菌株，有提高菌株稳定性的作用；（4 4）在培养基中加入某些金属离子可增加菌株的稳定性；）在培养基中加入某些金属离子可增加菌株的稳定性；（5 5）利用营养缺陷型和原养型在生理和抗性上的不同，在发酵培养基中加入抗生素也）利用营养缺陷型和原养型在生理和抗性上的不同，在发酵培养基中加入抗生素也会有防止回复突变发生的效果；会有防止回复突变发生的效果；（6 6）在生产过程中应尽力减少菌种传代次数，这是发酵工业中普遍遵循）在生产过程中应尽力减少菌种传代次数，这是发酵工业中普遍遵循的原则；的原则；（7 7）杂菌污染、发酵条件改变都能引起发酵生产产量波动，应注意区分）杂菌污染、发酵条件改变都能引起发酵生产产量波动，应注意区分原因。原因。现在学习的是第15页，共37页提高次级代谢产物产量的方法？提高次级代谢产物产量的方法？答：答：1 1）补加前体类似物；）补加前体类似物；2 2）加入诱导物；）加入诱导物；3 3）防止碳分解代谢阻遏或抑制的发生；）防止碳分解代谢阻遏或抑制的发生；4 4）防止氮代谢阻遏的发生；）防止氮代谢阻遏的发生；5 5）筛选耐前体或前体类似物的突变株；）筛选耐前体或前体类似物的突变株；6 6）筛选抗抗生素突变株；）筛选抗抗生素突变株；7 7）筛选营养缺陷型的回复突变株；）筛选营养缺陷型的回复突变株；8 8）抗毒性突变株的选育。）抗毒性突变株的选育。现在学习的是第16页，共37页试述提高初级代谢产物产量的方法？试述提高初级代谢产物产量的方法？1)1)使用诱导物；使用诱导物；2)2)除去诱导物除去诱导物-选育组成型产生菌；选育组成型产生菌；3)3)降低分解代谢产物浓度，减少阻遏的发生；降低分解代谢产物浓度，减少阻遏的发生；4)4)解除分解代谢阻遏解除分解代谢阻遏-筛选抗分解代谢阻遏突变株；筛选抗分解代谢阻遏突变株；5)5)解除反馈抑制解除反馈抑制-筛选抗反馈抑制突变株；筛选抗反馈抑制突变株；6)6)防止回复突变的产生和筛选负变菌株的回复突变株；防止回复突变的产生和筛选负变菌株的回复突变株；7)7)改变细胞膜的通透性；改变细胞膜的通透性；8)8)筛选抗生素抗性突变株；筛选抗生素抗性突变株；9)9)选育条件抗性突变株；选育条件抗性突变株；10)10)调节生长速率；调节生长速率；11)11)加入酶的竞争抑制剂。加入酶的竞争抑制剂。现在学习的是第17页，共37页二二.动植物细胞的组织培养动植物细胞的组织培养1.1.动物细胞培养动物细胞培养 动物细胞培养又称组织培养，是生物技术的重要组成部分。它与植物细胞、微生物细胞培养不同，是将来自动物某些器官或组织的细胞，在模拟体内生理条件下进行体外培养，使之存活和生长。早期的动物细胞培养，实际上是以组织片来进行培养的，后来改进为单细胞状态培养，并作为生产疫苗等物质的培养手段。1975年后，建立了以大量制备有用的细胞成分为目的的培养设施而进入新阶段。它不仅用于生产各类疫苗，而且随着动物细胞可以作为外来DNA的受体细胞的DNA重组技术的成功而得到发展，已可用来生产人生长激素、人胰岛素和干扰素。培养能产生生长激素的基因工程细胞猴肾细胞，最高表达量，以1107个细胞计，每日可获得近1mg的产物。使用该法生产的产物有5大类：a.病毒疫苗（如脊髓灰质炎、狂犬病、乙型肝炎等的疫苗）；b.干扰素；c.激素；d.免疫剂；e.人体活性蛋白（如胰岛素、血纤维蛋白溶酶原等），其中病毒疫苗生产已得到广泛应用。现在学习的是第18页，共37页(1)(1)动物细胞的性质动物细胞的性质 动动物物组组织织经经物物理理切切碎碎、切切片片，或或者者经经化化学学法法或或酶酶法法处处理理所所得得的的细细胞胞，一一般般经经约约5050代代分分裂裂繁繁殖殖，便便退退化化死死亡亡。在在培培养养期期内内，染染色色体体数数目目和和二二倍倍体体细细胞胞特特性性仍仍保保持持正正常常。这这类类细细胞胞被被称称为为初初代代培培养养细细胞胞。细细胞胞在在反反复复分分裂裂的的过过程程中中，有有时时出出现现繁繁殖殖能能力力突突然然培培强强、几几乎乎无无限限制制繁繁殖殖的的细细胞胞。其其形形态态、病病毒毒敏敏感感性性、抗抗原原性性、染染色色体体构构成成等等都都发发生生了了变变化化，完完全全失失去去原原细细胞胞的的特特性性。我我们们把把这这一一类类通通常常所所说说的的癌癌细细胞胞称称之之为为确确立立细细胞胞株株或或株株化化细细胞胞。来来源源于于小小鼠鼠的的L L细细胞胞和和来来源源于于人人子子宫宫颈颈癌癌的的HelaHela细细胞胞就就是是有有名名的的确确立立细细胞胞株株。绝绝大大部部分分初初代代培培养养细细胞胞只只能能附附着着面面层层着着在在容容器器壁壁上上进进行行繁繁殖殖，形形成成单单层层状状细细胞胞层层，因因此此称称为为贴贴壁壁附附着着细细胞胞或或附附着着性性细细胞胞。用用胰胰蛋蛋白白酶酶处处理理这这个个细细胞胞层层，又又可可分分散散成成单单细细胞胞，如如果果继继续续培培养养又又可可形形成成单单细细胞胞层层。我我们们把把这这种种操操作作称称为为移移植植继继代代培培养养。但但这这类类细细胞胞与与确确立立细细胞胞株株不不一一样样，不不能能无无限限繁繁殖殖，人人胚胚胎胎组组织织的的细细胞胞经经过过5050次分裂便停止繁殖，为区别起见，把这类细胞称为次分裂便停止繁殖，为区别起见，把这类细胞称为细胞株细胞株。现在学习的是第19页，共37页 这这类类细细胞胞在在繁繁殖殖初初期期也也有有形形态态变变化化，经经过过几几代代反反复复分分裂裂繁繁殖殖后后，只只有有一一种种能能继继续续繁繁殖殖的叫做的叫做成纤维细胞成纤维细胞，其他形状的细胞就消失了。，其他形状的细胞就消失了。通通常常，成成纤纤维维细细胞胞在在5050代代内内染染色色体体是是正正常常的的。成成纤纤维维细细胞胞的的繁繁殖殖过过程程是是，开开始始于于初初代代培培养养细细胞胞期期，随随着着世世代代的的增增加加进进入入对对数数繁繁殖殖期期，大大约约经经过过30305050代代的的繁繁殖殖，生生长长速速度度就就变变缓缓慢慢，进进入入衰衰减减期期，这这时时细细胞胞分分开开明明繁繁殖殖就就完完全全停停止止，继继而而死死亡亡。在在此此繁繁殖殖过过程程中中可可能能出出现现有少部分细胞发生变异的确立细胞株。有少部分细胞发生变异的确立细胞株。成成纤纤维维细细胞胞在在衰衰减减期期之之前前，大大部部分分不不具具癌癌化化性性，仍仍留留初初代代培培养养细细胞胞的的性性质质，因因此此非非常常安安全全可可靠靠。如如果果从从中中采采集集繁繁殖殖10102020代代的的细细胞胞作作种种细细胞胞，冷冷冻冻保保存存在在-80-800 0C C，供供作作生生产产疫疫苗苗、尿尿激酶、干扰素等的组织培养的种细胞是可行的。激酶、干扰素等的组织培养的种细胞是可行的。确确立立细细胞胞株株一一般般都都显显示示非非常常稳稳定定的的繁繁殖殖特特性性，可可以以无无限限增增殖殖，在在大大多多数数情情况况下下，可可用用于于大大量量悬悬浮浮培培养养。然然而而，它它具具有有癌癌化化性性质质，用用来来生生产产疫疫苗苗之之类类物物质质是是带带有有一一定定的的危危险险性性。可可是是，近近代代分分离离纯纯化化支支术术的的进进步步，有有可可能能除除去去夹夹杂杂有有害害物物质质。这这样样用用确确立立细细胞胞株株生生产产有有用用物物质质也也是是完完全全可可能能的的。例例如如：19821982年年用用来来自自淋淋巴巴瘤瘤的的确确立立细胞株淋巴芽球细胞作种细胞进行悬浮培养，生产出用于临床的人干扰素。细胞株淋巴芽球细胞作种细胞进行悬浮培养，生产出用于临床的人干扰素。现在学习的是第20页，共37页（2 2）培养条件）培养条件 动动物物细细胞胞的的培培养养条条件件和和微微生生物物培培养养相相似似，除除要要保保证证无无杂杂菌菌外外，还还需需要要适适当当的的营营养养、pHpH、温温度度、溶解氧、罐压、搅拌转速、渗透压等。溶解氧、罐压、搅拌转速、渗透压等。细细胞胞培培养养最最适适温温度度为为3737+0.50.5，偏偏离离此此温温度度，生生长长和和代代谢谢就就受受到到影影响响，甚甚至至死死亡亡。实实验验证证明明，细细胞胞对对低低温的耐受性比对高温强。温的耐受性比对高温强。大大多多数数生生物物体体液液的的pHpH都都接接近近中中性性，细细胞胞生生存存的的pHpH在在6.86.87.67.6之之间间，最最适适pHpH为为7.27.27.47.4间间，当当pHpH低低于于6.06.0或或高高于于7.67.6时时，生生长长就就受受到到影影响响，甚甚至至死死亡亡。但但多多数数类类型型的的细细胞胞对对偏偏酸酸性性的的耐耐受受性性较较强强，在在仿仿碱碱性性条条件件下下则则会会很很快快死死亡亡。作作为为代代谢谢产产物物的的COCO2 2，除除保保证证体体内内的的代代谢谢活活动动外外，还还有有调调节节pHpH的的作作用用。大大多多数数培培养养基基的的pHpH就就是是利利用用COCO2 2（NaHCONaHCO3 3缓缓冲冲系系液液）和和细细胞胞代代谢谢产产物物（特特别别是是乳乳酸酸）的的组组合合来来控控NaHCONaHCO3 3控控系系统统就就是是血血中中自自然然缓缓冲冲剂剂。在在培培养养箱箱中中，可可根根据据需需要要持持续续地地提提供供一一定定比比例例的的COCO2 2气气体体。在在培培养养罐罐中中，可可增增加加NaHCONaHCO3 3的用量，调节的用量，调节COCO2 2浓度来控制培养液的浓度来控制培养液的pHpH，以保持比较稳定的，以保持比较稳定的pHpH范围。范围。溶溶解解氧氧的的控控制制，通通常常都都是是采采用用控控制制通通气气量量、搅搅拌拌转转速速和和空空气气中中的的氧氧浓浓度度等等因因素素来来实实现现，但但对对脆脆弱弱的的动动物物细细胞胞和和易易产产生生泡泡沫沫的的含含血血清清培培养养基基，只只有有在在维维持持适适宜宜的的通通气气量量和和缓缓慢慢的的搅搅拌拌的的基基础础上上，通通过过改改变变空空气气中中的的氧氧浓浓度度来来进进行行。现现在在有有一一种种控控制制溶溶氧氧的的办办法法是是将将硅硅氧氧管管浸浸的的培培养养液液中中，通通过过硅硅氧氧膜膜从从管管内内供供氧氧。用用这这种种办办法法可可增增加加供供氧氧浓浓度度，也也可可增增加加气气液液接接触触面面积积。适适当当的渗透压可通过调节培养液中的盐和葡萄糖浓度来维持。的渗透压可通过调节培养液中的盐和葡萄糖浓度来维持。只只有有满满足足这这些些基基本本条条件件，细细胞胞才才能能在在体体外外正正常常存存活活和和生生长长。在在实实际际培培养养中中，还还应应根根据据不不同同细细胞胞体体外外培培养养的的难难易程度采取不同的具体措施。易程度采取不同的具体措施。现在学习的是第21页，共37页（3 3）培培养养基基 动动物物细细胞胞培培养养基基的的组组成成是是一一个个极极为为重重要要的的问问题题。它它必必须须要要有有足足够够的的糖糖、脂脂肪肪、蛋蛋白白质质和和核核酸酸等等代代谢谢所所需需要要的的各各种种成成分分，包包括括十十几几种种必必需需氨氨基基酸酸及及其其他他非非必必需需氨氨基基酸酸、维维生生素素、糖糖和和无无机机盐盐等等。氨氨基基酸酸只只利利用用L-L-型型；碳碳源源以以葡葡萄萄糖糖为为最最常常用用，半半乳乳糖糖也也可可以以，但但不不能能利利用用双双糖糖；维维生生素素、无无机机盐盐是是由由血血清清提提供供或或单单独独添添加加。由由于于培培养养基基成成分分的的来来源源不不同同，有有下下列列几几种种培培养养基。基。合合成成培培养养基基和和血血清清培培养养基基 人人们们对对确确立立细细胞胞株株的的营营养养要要求求进进行行了了广广泛泛的的研研究究，出出现现了了许许多多化化学学合合成成培培养养基基，并并在在市市场场上上出出售售。其其中中最最有有名名的的是是伊伊格格尔尔（EagleEagle）的的最最低低基基本本培培养养基基，简简称称MEMMEM，见见下下表表。它它是是由由1313种种必必需需氨氨基基酸酸、8 8种种维维生生素素、葡葡萄萄糖糖和和无无机机盐盐所所组组成成。对对于于细细胞胞繁繁殖殖来来说说，尚尚须须加加入入5%-10%5%-10%的的动动物物血血清清（如如小小牛牛血血清清）。但但从从经经济济成成本本或或血血清清供供给给来来看看，使使用用这这种种培培养养基基都都是是不不现现实实的的。由由于于所所用用血血清清来来源源批批次次不不同同和和含含有有较较多多蛋蛋白白质质，培培养养结结果的重复性往往较差，细胞产物还混有异种蛋白，给分离精制带来很大的困难。果的重复性往往较差，细胞产物还混有异种蛋白，给分离精制带来很大的困难。无无血血清清培培养养基基 近近年年来来对对无无血血清清培培养养基基进进行行了了深深入入研研究究，已已