基因工程和分子生物学常用技术.ppt

关于基因工程与分子生关于基因工程与分子生物学常用技术物学常用技术第一张，PPT共三十四页，创作于2022年6月第一节 基因工程与基因重组(Genetic Engineering and Genetic recombination)一、基因工程的基本概念 不同来源的DNA分子可以通过磷酸二酯键连接形成重新组合的DNA分子，称为DNA重组。将基因进行克隆，并表达制备特定的产物，或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作统称为基因工程。第二张，PPT共三十四页，创作于2022年6月(一一)工具酶工具酶1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 (1)(1)能够切割能够切割DNADNA中磷酸二酯键的酶称核酸酶，其中有中磷酸二酯键的酶称核酸酶，其中有选择地切割选择地切割DNADNA分子特异序列的核酸酶，称为分子特异序列的核酸酶，称为限制性核酸内切酶，简称限制性内切酶。，简称限制性内切酶。(2)命名命名命名命名Hin d 属 系 株 序Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶(3)(3)识别特征5GAATTC33CTTAAG5 限制性内切酶识别限制性内切酶识别的的DNA序列具有回文结回文结构构特征。特征。第三张，PPT共三十四页，创作于2022年6月 不同的限制性内切酶识别和切割的特异性不同，结果有3种不同的情况：产生产生3 3 突出粘性末端：以：以EcoEcoRR为例：为例：5G5GAATTC3 AATTC3 5G5G AATTC3 AATTC33CTTAA3CTTAAG5 G5 3CTTAA3CTTAA G5 G5 产生产生5 5 突出粘性末端：以：以PstPst 为例：为例：5CTGCA5CTGCA G3 G3 5CTGCA5CTGCA G3 G33G3G ACGTC5 ACGTC5 3 G3 G ACGTC5 ACGTC5 产生平末端平末端：NruNru 为例：5TCG5TCGCGA3 CGA3 5TCG5TCG CGA3 CGA3 3AGC3AGCGCT5 GCT5 3AGC3AGC GCT5 GCT5(4)(4)切割位点切割位点切割位点切割位点第四张，PPT共三十四页，创作于2022年6月2.DNA2.DNA聚合酶聚合酶(1)(1)基因工程主要应用基因工程主要应用E.coli E.coli DNADNA聚合酶聚合酶、T4 DNAT4 DNA聚合聚合酶和酶和Taq DNA DNA聚合酶等。(2)主要用途：主要用途：利用5 5/33/聚合活性，合成DNADNA第二条链；第二条链；对DNA的3 3/端进行填补或末端标记；端进行填补或末端标记；E.coliE.coli DNA-pol DNA-pol用于缺口平移，制作探针；用于缺口平移，制作探针；T4 DNAT4 DNA聚合酶可用于聚合酶可用于DNA序列测定；序列测定；Taq DNA DNA聚合酶用于聚合酶链式反应聚合酶用于聚合酶链式反应(PCR)(PCR)。3.DNA连接酶连接酶 使单链切口形成磷酸二酯键，共价地连接。使单链切口形成磷酸二酯键，共价地连接。第五张，PPT共三十四页，创作于2022年6月4.4.逆转录酶逆转录酶(1)(1)用于真核用于真核mRNAmRNA逆转录，构建逆转录，构建cDNAcDNA文库。文库。(2)(2)用于进行3/端填补和标记，制备DNADNA探针。(3)(3)用于用于DNADNA序列测定。序列测定。5.5.多核苷酸激酶多核苷酸激酶 (1)(1)用于放射性标记DNADNA链的链的5 5/端。(2)(2)用于缺少用于缺少5/-磷酸基的磷酸基的DNADNA磷酸化。磷酸化。6.6.碱性磷酸酶碱性磷酸酶 此酶防止载体的自身连接。此酶防止载体的自身连接。7.7.末端脱氧核苷酸转移酶 能催化单核苷酸转移到能催化单核苷酸转移到DNADNA的3 3/-端羟基上。第六张，PPT共三十四页，创作于2022年6月(二二)载体载体1.为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子，称为载体。2.载体的选择标准能自主复制。能自主复制。易进入宿主细胞。易进入宿主细胞。易进入宿主细胞。易进入宿主细胞。具有多克隆位点。具有多克隆位点。具有多克隆位点。具有多克隆位点。易从宿主细胞中分离纯化。易从宿主细胞中分离纯化。有易被识别和筛选的标志。有易被识别和筛选的标志。有易被识别和筛选的标志。有易被识别和筛选的标志。质粒噬菌体粘粒粘粒病毒3.常用载体第七张，PPT共三十四页，创作于2022年6月质粒是细菌中独立于染质粒是细菌中独立于染色质以外的、能自主复制色质以外的、能自主复制的、并与细菌或细胞共存的、并与细菌或细胞共存的遗传成分，的遗传成分，可赋予宿主细胞某些遗传性状。通常质粒的大小为通常质粒的大小为2300kb300kb。一般只能容纳一般只能容纳10kb10kb的外源DNADNA片断。(1)(1)质粒质粒(plasmid)(plasmid)第八张，PPT共三十四页，创作于2022年6月(2)(2)噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体(bacteriophage(bacteriophage，phage)phage)噬菌体是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌中并能溶噬菌体是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌中并能溶解细菌细胞，故称为噬菌体。解细菌细胞，故称为噬菌体。噬菌体由头和尾构成，感染时尾管将基因组噬菌体由头和尾构成，感染时尾管将基因组DNADNA注入大注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。具有具有溶菌性和溶原性两种不同的繁殖方式。溶菌性和溶原性两种不同的繁殖方式。第九张，PPT共三十四页，创作于2022年6月(3)粘粒粘粒(cosmid)(cosmid)粘粒本身约粘粒本身约4 6kb6kb，可克隆，可克隆DNADNA大片段，可用作建大片段，可用作建立真核基因组文库的载体。立真核基因组文库的载体。粘粒是将粘粒是将 噬菌体的噬菌体的cos区与质粒组合的装配型载体。区与质粒组合的装配型载体。(4)(4)病毒病毒病毒病毒 病毒载体更多地用于真核表达系统，如腺病毒、痘病毒、反转录病毒和猴空泡病毒。第十张，PPT共三十四页，创作于2022年6月二、重组DNA技术的基本原理和过程 基因工程中最主要是基因工程中最主要是分子克隆分子克隆，克隆克隆是指由一个细胞是指由一个细胞经过无性繁殖后所形成的子代群体。进行分子克隆所采用经过无性繁殖后所形成的子代群体。进行分子克隆所采用的技术即重组的技术即重组DNA技术，故又称为分子克隆技术或基因技术，故又称为分子克隆技术或基因工程技术。工程技术。制备目的基因和相关载体；制备目的基因和相关载体；将目的基因和载体进行连接；将目的基因和载体进行连接；将目的基因和载体进行连接；将目的基因和载体进行连接；将重组的将重组的DNA导入受体细胞；导入受体细胞；导入受体细胞；导入受体细胞；DNADNA重组体的筛选和鉴定；重组体的筛选和鉴定；重组体的筛选和鉴定；重组体的筛选和鉴定；DNADNA重组体的扩增、表达。重组体的扩增、表达。重组体的扩增、表达。重组体的扩增、表达。基本步骤基本步骤第十一张，PPT共三十四页，创作于2022年6月(一)目的基因的制备1.1.制备基因组制备基因组DNA文库文库 (genomic library)(genomic library)将基因组将基因组DNADNA酶切成片段，再与载体分子拼接成重组DNADNA，将其引入宿主细胞进行扩增，所得分子克隆混合体，将其引入宿主细胞进行扩增，所得分子克隆混合体称基因组文库。称基因组文库。2.2.制备制备cDNAcDNA文库文库 (cDNA library)(cDNA library)将将mRNAmRNA逆转录合成cDNA，再与载体连接成重组，再与载体连接成重组DNA，将其引入宿主细胞并进行扩增，所得分子克隆的混，将其引入宿主细胞并进行扩增，所得分子克隆的混合体称为合体称为cDNAcDNA文库。文库。第十二张，PPT共三十四页，创作于2022年6月3.3.聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)(PCR)如已知目的基因序列，则可采用PCRPCR从基因从基因组组DNADNA中获得目的基因，也可以采用逆转录中获得目的基因，也可以采用逆转录PCR(RT-PCR(RT-PCR)PCR)直接从mRNAmRNA获得特定基因的cDNA。4 4化学合成化学合成 如已知肽链的氨基酸顺序，则可按对应密码子推导出DNADNA的碱基序列，然后合成该段的碱基序列，然后合成该段DNA序序列。列。第十三张，PPT共三十四页，创作于2022年6月(二)目的基因与载体的连接1 1粘性末端连接粘性末端连接2 2同聚物加尾连接3 3平末端连接4 4人工接头连接人工接头连接 将目的基因插入载体，用将目的基因插入载体，用DNADNA连接酶连接双链DNADNA粘性末端序列，在体外重新连接成人工重组体。方法粘性末端序列，在体外重新连接成人工重组体。方法主要有以下四种：主要有以下四种：第十四张，PPT共三十四页，创作于2022年6月(三)将外源DNA导入宿主细胞常用的方法有以下两种：1.1.转化(transformation)(transformation)转化是指将质粒或其他外源DNADNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。2.2.感染感染(infection)(infection)感染是指以噬菌体进入宿主菌或病毒进入宿感染是指以噬菌体进入宿主菌或病毒进入宿主细胞中繁殖的过程。主细胞中繁殖的过程。第十五张，PPT共三十四页，创作于2022年6月1.1.遗传学方法遗传学方法 针对载体携带有某些标志基因如抗药性标志基针对载体携带有某些标志基因如抗药性标志基针对载体携带有某些标志基因如抗药性标志基针对载体携带有某些标志基因如抗药性标志基因因因因(amprampr、tetr、kanrkanr等等等等)和目的基因而设计的筛选方和目的基因而设计的筛选方和目的基因而设计的筛选方和目的基因而设计的筛选方法。法。法。法。2.2.分子杂交方法分子杂交方法 利用利用利用利用32P标记的探针与重组标记的探针与重组标记的探针与重组标记的探针与重组DNADNA或克隆或克隆或克隆或克隆DNADNA片片段进行分子杂交，直接筛选并鉴定目的基因。段进行分子杂交，直接筛选并鉴定目的基因。3.免疫学方法免疫学方法 利用特异性抗体与目的基因表达产物特异结合的利用特异性抗体与目的基因表达产物特异结合的利用特异性抗体与目的基因表达产物特异结合的利用特异性抗体与目的基因表达产物特异结合的方法筛选。方法筛选。方法筛选。方法筛选。(四)目的基因的筛选和鉴定第十六张，PPT共三十四页，创作于2022年6月(五)克隆基因的表达 利用重组DNADNA技术所获得目的基因或技术所获得目的基因或DNADNA序列，可实序列，可实现在受体细胞中的表达，即产生现在受体细胞中的表达，即产生mRNA或蛋白质产物。或蛋白质产物。(六)重组DNA技术操作过程总结归纳 分切接转筛分离目的基因 限制酶切目的基因与载体拼接重组体 转入受体菌 筛选重组体 第十七张，PPT共三十四页，创作于2022年6月2.特点 针对性强、特异性强、灵敏度高、适应性强。三、基因诊断和基因治疗1.基因诊断是指利用分子生物学技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。(一)基因诊断(gene diagnosis)3.3.应用应用遗传性疾病遗传性疾病遗传性疾病遗传性疾病肿瘤肿瘤肿瘤肿瘤感染性疾病感染性疾病感染性疾病感染性疾病遗传易感性疾病遗传易感性疾病器官移植配型器官移植配型器官移植配型器官移植配型法医学中个体识别、亲子鉴定法医学中个体识别、亲子鉴定法医学中个体识别、亲子鉴定法医学中个体识别、亲子鉴定第十八张，PPT共三十四页，创作于2022年6月1.基因治疗是指以正常基因矫正、替代缺陷基因，或从基因水平调控细胞中缺陷基因表达的一种治疗疾病的方法。2.狭义的基因治疗是指将目的基因导入靶细胞，与宿主细胞的基因整合后表达以达到治疗疾病的方法。3.广义的基因治疗是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用以达到治疗疾病的方法。(二)基因治疗(gene therapy)第十九张，PPT共三十四页，创作于2022年6月5.基因治疗的基本程序(1)选择和制备目的基因：治疗性基因。(2)选择基因转运载体：通常选择病毒载体。(3)选择靶细胞：体细胞、生殖细胞。(4)转移基因：将治疗基因导入并表达。4.基因治疗的基本策略基因增补基因置换基因矫正基因失活基因疫苗第二十张，PPT共三十四页，创作于2022年6月(The Technology and Application in Molecular Biology)(The Technology and Application in Molecular Biology)第二节 分子生物学 技术及其应用 核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)是指利用DNA复性原理，把不同来源的DNA单链或DNA与RNA混合，如单链分子间有碱基配对关系，则可形成杂化双链的过程。一、核酸分子杂交技术第二十一张，PPT共三十四页，创作于2022年6月(一)探针(probe)2.2.理想探针的特点 (1)带有标记的示踪物，便于检测、鉴定；带有标记的示踪物，便于检测、鉴定；(2)应是单链；应是单链；(3)(3)具有高度特异性；具有高度特异性；(4)(4)探针长度一般为数十至数千个碱基探针长度一般为数十至数千个碱基;(5)具有高灵敏度和稳定性，标记方法简便安全。1.1.探针是一段与被测的核苷酸序列(靶基因序列靶基因序列)互互补的带有标记的核苷酸片段。补的带有标记的核苷酸片段。第二十二张，PPT共三十四页，创作于2022年6月(二)核酸分子杂交的基本方法1.Southern印迹杂交印迹杂交 2.(1)(1)指将经酶切和电泳分离的待测指将经酶切和电泳分离的待测DNADNA片段片段转印到固相转印到固相支持物上，然后与标记的支持物上，然后与标记的DNADNA探针杂交。3.3.(2)(2)可用于分子克隆、遗传病诊断、法医鉴定、肿瘤可用于分子克隆、遗传病诊断、法医鉴定、肿瘤研究和器官移植等方面研究和器官移植等方面。2.Northern印迹杂交印迹杂交 (1)(1)指将经电泳分离后的待测指将经电泳分离后的待测RNARNA片段片段转印到固相支持转印到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交。物上，然后与标记的核酸探针进行杂交。(2)(2)主要用于检测各种基因转录产物，主要是主要用于检测各种基因转录产物，主要是mRNA。第二十三张，PPT共三十四页，创作于2022年6月第二十四张，PPT共三十四页，创作于2022年6月3.斑点及狭缝印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交 (1)(1)指将指将RNARNA或或DNADNA变性后直接点样于硝酸纤维素变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再与探针杂交，称为斑点印迹。若采膜或尼龙膜上，再与探针杂交，称为斑点印迹。若采用狭缝点样器加样后杂交，其印迹为线状，称为狭缝用狭缝点样器加样后杂交，其印迹为线状，称为狭缝印迹杂交。印迹杂交。(2)(2)主要用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究。4.原位杂交原位杂交 (1)(1)指将标记的核酸探针与经适当方法处理的细胞或组指将标记的核酸探针与经适当方法处理的细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。(2)(2)该方法不需从组织或细胞中提取核酸，有很高的该方法不需从组织或细胞中提取核酸，有很高的灵敏度，并可保持组织与细胞的形态，更能准确地反灵敏度，并可保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。映出组织细胞的相互关系及功能状态。第二十五张，PPT共三十四页，创作于2022年6月二、聚合酶链反应(一一)PCR的基本原理的基本原理 1.PCR有三个反应步骤DNA的变性 DNA与引物的退火(复性)引物的延伸。第二十六张，PPT共三十四页，创作于2022年6月n个循环加热变性模板DNA退火DNA延伸P25 35 35 3 3P15 2.变性复性延伸这三个步骤为一个循环，每次循环的产物作为下个循环的模板，如此循环多次，则DNA成指数扩增。第二十七张，PPT共三十四页，创作于2022年6月PCR反应体系：1.引物 是PCR特异性反应的关键，取决于引物与模板DNA互补的程度。2.酶浓度酶催化的PCR反应的Taq DNA聚合酶量约需2.5U。3.dNTP的质量dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当，易变性失去生物学活性。4.模板核酸模板核酸的量与纯化程度是PCR成败与否的关键环节之一。(二)PCR的基本反应第二十八张，PPT共三十四页，创作于2022年6月1可分析基因转录产物；构建cDNA文库；克隆特异cDNA；合成cDNA探针。2可判断突变的基因片段，如癌基因和抑癌基因中点突变的检测和鉴定。3用于病原微生物的微量检测及鉴别菌株；突变基因的筛选；法医学鉴定；DNA序列分析；器官移植配型等。4应用于遗传性疾病的诊断如地中海贫血、苯丙酮酸尿症等；感染性疾病如肝炎、结核等诊断。5根据已知致癌基因顺序设计特异的模板和引物，用于筛选特异的抗肿瘤化合物。(三)PCR的应用第二十九张，PPT共三十四页，创作于2022年6月三、核酸的序列分析三、核酸的序列分析(一)DNA链末端合成终止法(Sanger法)第三十张，PPT共三十四页，创作于2022年6月采用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子发出不同波长荧光，采集荧光信号，确定DNA碱基的排列顺序。DNA自动测序结果举例(二)DNA自动测序第三十一张，PPT共三十四页，创作于2022年6月四、基因文库基因文库基因文库是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。包括基因组DNA文库和cDNA文库。五、生物芯片技术(一)基因芯片(gene chip)是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上。包括DNA芯片(DNA chip)和cDNA芯片(cDNA chip)。第三十二张，PPT共三十四页，创作于2022年6月是将蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，可特异性与待测样品中的靶蛋白反应，再进行定性或定量分析的技术。(二)蛋白质芯片(protein chip)(三)生物芯片技术的应用主要应用于大量生物样品的快速、高效、灵敏的定量分析，如测序和突变检测。可应用于基因表达研究的分析，如基因功能分析、疾病发生机制探讨、药物筛选研究等。第三十三张，PPT共三十四页，创作于2022年6月感谢大家观看第三十四张，PPT共三十四页，创作于2022年6月