DNA重组技术的基本工具概述(PPT 43页)44469.pptx

基因工程 第一节：DNA重组技术的基本工具 浚县一中浚县一中 刘秀荣刘秀荣据据WTOWTO调查：调查：20042004年全世界因狂犬病致死人数约年全世界因狂犬病致死人数约5.55.5万人万人中国卫生部通报：中国卫生部通报：20042004年月，狂犬病列法定报告年月，狂犬病列法定报告传染病死亡数之首。传染病死亡数之首。发病死亡率近发病死亡率近100%100%.能产生狂犬病抗体蛋白能产生狂犬病抗体蛋白的转基因植物的转基因植物基因工程的概念基因工程的概念 基因工程是基因工程是指按照人们的愿望，进行指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过严格的设计，并通过体外体外DNA重组重组和和转基转基因因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人类需要的新的而创造出更符合人类需要的新的生物类型生物类型和和生物产品生物产品。由于基因工程是。由于基因工程是DNA分子水分子水平平上进行设计和施工的，因此上进行设计和施工的，因此又叫又叫DNA重组技术重组技术。基因工程的别名基因工程的别名DNA重组技术重组技术操作环境操作环境生物体外生物体外操作对象操作对象基因基因操作水平操作水平DNA分子水平分子水平基本过程基本过程剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达结果结果人类需要的基因产物或性状人类需要的基因产物或性状概念分析：问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想想一想需要做哪些关键工作？需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌毒蛋白毒蛋白毒蛋白毒蛋白普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉普通棉花普通棉花(无抗虫特性无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取抗虫基因抗虫基因棉花细胞棉花细胞(含抗虫基因含抗虫基因)棉花植株棉花植株(有抗虫特性有抗虫特性)上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？重组重组DNADNA导入导入形成形成基因工程培育抗虫棉的简要过程基因工程培育抗虫棉的简要过程基因工程培育抗虫棉的关键步骤基因工程培育抗虫棉的关键步骤关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来细胞内提取出来关键步骤二：关键步骤二：形成重组形成重组DNADNA关键步骤三：关键步骤三：重组重组DNADNA导入受体导入受体(棉花棉花)细胞细胞1.1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来细胞内提取出来关键步骤二：关键步骤二：形成重组形成重组DNADNA关键步骤三：关键步骤三：重组重组DNADNA导入受体导入受体(棉花棉花)细胞细胞“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子缝合针分子缝合针”DNA DNA连接酶连接酶“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶主要来源主要来源：2.种类与种类与命名命名：3.作用：作用：4.作用结果：作用结果：主要是从主要是从原核生物原核生物中分离纯化出来中分离纯化出来的一类酶。的一类酶。约约4000种种识别特定的核苷酸序列，断裂磷酸二酯键识别特定的核苷酸序列，断裂磷酸二酯键。形成形成粘性末端或平末端粘性末端或平末端寻根问底寻根问底你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？是什么吗？原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵，的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割切割掉，以保证自身的安全。所以，掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原限制酶在原核生物中主要起到切割外源核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，、使之失效，从而达到保护自身的目的。从而达到保护自身的目的。go back 现在已经从约现在已经从约300300种微生物中分离出约种微生物中分离出约40004000种种限制性内切酶限制性内切酶(限制酶限制酶)。E EcocoR RS Smama粘质沙雷氏杆菌粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌（EscherichiaEscherichia colicoli R R）练习：流感嗜血杆菌的练习：流感嗜血杆菌的d d菌株菌株(Haemophilus influenzae d)Haemophilus influenzae d)中先后分离到中先后分离到3 3种限制酶，则分种限制酶，则分别命名为别命名为:Hind、Hind和和Hind限制酶的识别序列：限制酶的识别序列：能被限制性内切酶特能被限制性内切酶特异性识别的切割部位异性识别的切割部位都具有都具有回文序列回文序列：在切割部位，一条链在切割部位，一条链正向正向读的碱基顺序与读的碱基顺序与另一条链另一条链反向反向读的顺读的顺序完全序完全一致一致。限制性核酸内切酶作用的是限制性核酸内切酶作用的是DNADNA分子中的什么键？分子中的什么键？磷酸二酯键磷酸二酯键即脱氧核糖、磷即脱氧核糖、磷酸之间的连接酸之间的连接AAT TGGGGCCAAT TCCT TT TCCGGAAAA GP AP A GGo backEcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切口，两条单链的切口，带有几个带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，它们之间正好，它们之间正好互互补配对补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。Sma平末端平末端平末端平末端限制酶DNA解旋酶区别限制酶与限制酶与DNA解旋酶的区别解旋酶的区别切割特定的核苷酸序列切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键的磷酸二酯键将将DNADNA两条链的氢键两条链的氢键打开形成两条单链打开形成两条单链限制酶DNA水解酶区别限制酶与限制酶与DNA水解酶的区别水解酶的区别切割切割特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列的磷酸二酯键的磷酸二酯键，形成片，形成片段的段的DNA.DNA.（双链）（双链）切割磷酸二酯键，形成切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸。单个的脱氧核苷酸。目的基因所在目的基因所在DNADNA片段片段载体载体DNADNA片段片段EcoREcoREcoREcoRDNA连接酶连接酶1.作用作用:把切下来的把切下来的DNA片段拼接成新的片段拼接成新的DNA.2.作用原理：作用原理：催化催化磷酸二酯键磷酸二酯键形成形成3.种类：种类：Ecoli DNA连接酶连接酶 T4 DNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”DNA DNA连接酶连接酶 可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来，起来，Ecoli DNA连接酶或连接酶或T4DNA连接酶连接酶即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗？聚合酶是一回事吗？T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶还可把还可把平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，但效率较低起来，但效率较低DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶连接连接DNADNA链链连接部位连接部位相同点相同点双链双链单链单链在两在两DNADNA片段之间形片段之间形成磷酸二酯键成磷酸二酯键将单个核苷酸加将单个核苷酸加到已存在的核酸到已存在的核酸片段的片段的3 3末端的末端的羟基上，形成磷羟基上，形成磷酸二酯键酸二酯键都能形成磷酸二酯键都能形成磷酸二酯键二者都是蛋白质类化合物二者都是蛋白质类化合物尝试写出下列序列受尝试写出下列序列受EcoRI限制酶作用后的黏性末端限制酶作用后的黏性末端CTTCATGAATTCCCTAA GAAGTACTTAAGGGATT“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体1.作用：作用：2.条件条件：3.种类：种类：质粒质粒、噬菌体的衍生物和动植物噬菌体的衍生物和动植物病毒等。病毒等。将外源基因送入受体细胞。将外源基因送入受体细胞。有1多个限制酶切点对受体细胞无害使导入基因能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于筛选假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？子运输车吗？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？作为载体的必要条件作为载体的必要条件:Go back质粒的特点：质粒的特点：1.1.是是一一种种裸裸露露的的、结结构构简简单单、独独立立于于细细菌菌拟拟核核DNADNA分分子子外外并并能能自自我我复复制制的的小小型型双双链链环环状状DNADNA分子。分子。能复制并带着插能复制并带着插入的目的基因一入的目的基因一起复制起复制有切割位点有切割位点有标记基因的存有标记基因的存在，将来可用含在，将来可用含青霉素的培养基青霉素的培养基鉴别。鉴别。基因工程基因工程的工具的工具限制酶限制酶主要存在于原核生物中主要存在于原核生物中具有专一性具有专一性(识别序列识别序列)切开切开DNADNA分子的磷酸二酯键分子的磷酸二酯键DNADNA连连接酶接酶连接磷酸二酯键连接磷酸二酯键种类种类E.coliDNAE.coliDNA连接酶连接酶T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶载体载体具备的具备的条件条件质粒、质粒、噬菌体衍生物、噬菌体衍生物、动植物病毒动植物病毒种类种类能自我复制能自我复制有一个或多个酶切割位点有一个或多个酶切割位点有标记基因有标记基因对受体细胞无害对受体细胞无害思考与探究思考与探究 P7 2、为什么限制酶不剪切细菌本身的为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其制酶的细胞，其DNADNA分子中或者分子中或者不具备不具备这这种限制酶的种限制酶的识别切割序列识别切割序列；或者通过甲基；或者通过甲基化酶化酶将甲基转移将甲基转移到所到所识别序列识别序列的碱基上，的碱基上，使使限制酶不能将其切开限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的中含有某种限制酶也不会使自身的DNADNA被被切断，并且可以防止外源切断，并且可以防止外源DNADNA的入侵。的入侵。3、天然的、天然的DNA分子可以直接用做基因工分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？程载体吗？为什么？提示：提示：提示：提示：基因工程中作为载体使用的基因工程中作为载体使用的基因工程中作为载体使用的基因工程中作为载体使用的DNADNA分子很多都是质粒分子很多都是质粒分子很多都是质粒分子很多都是质粒（plasmidplasmid），即独立于细菌拟核染色体），即独立于细菌拟核染色体），即独立于细菌拟核染色体），即独立于细菌拟核染色体DNADNA之外之外之外之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNADNA分子。分子。分子。分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：思考与探究思考与探究 P71 1）载体载体载体载体DNADNA必需有必需有必需有必需有一个或多个限制酶一个或多个限制酶一个或多个限制酶一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基的切割位点，以便目的基的切割位点，以便目的基的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是所处的位置，还必须是所处的位置，还必须是所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外在质粒本身需要的基因片段之外在质粒本身需要的基因片段之外在质粒本身需要的基因片段之外，这样，这样，这样，这样才不至于因目的基因的插入而失活。才不至于因目的基因的插入而失活。才不至于因目的基因的插入而失活。才不至于因目的基因的插入而失活。2 2）载体载体载体载体DNADNA必需具备必需具备必需具备必需具备自我复制的能力自我复制的能力自我复制的能力自我复制的能力，或整合到受体染色体，或整合到受体染色体，或整合到受体染色体，或整合到受体染色体DNADNA上随染色体上随染色体上随染色体上随染色体DNADNA的的的的复制而同步复制复制而同步复制复制而同步复制复制而同步复制。3 3）载体载体载体载体DNADNA必需必需必需必需带有标记基因带有标记基因带有标记基因带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。，以便重组后进行重组子的筛选。，以便重组后进行重组子的筛选。，以便重组后进行重组子的筛选。4 4）载体载体载体载体DNADNA必需必需必需必需是安全的是安全的是安全的是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入，不会对受体细胞有害，或不能进入，不会对受体细胞有害，或不能进入，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。到除受体细胞外的其他生物细胞中去。到除受体细胞外的其他生物细胞中去。到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5 5）载体载体载体载体DNADNA分子分子分子分子大小应适合大小应适合大小应适合大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太，以便提取和在体外进行操作，太，以便提取和在体外进行操作，太，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。大就不便操作。大就不便操作。大就不便操作。实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒DNADNA分子并不完全具备上述条件，分子并不完全具备上述条件，分子并不完全具备上述条件，分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。4、DNA连接酶有连接单链连接酶有连接单链DNA的本领吗？的本领吗？迄今为止，所发现的迄今为止，所发现的DNA连接酶都连接酶都不具有不具有连接单链连接单链DNA的能力，至于原因，的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链接单链DNA的酶。的酶。思考与探究思考与探究 P71)不属于质粒被选为基因运载体的理由是不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制、能复制 （）B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD练习练习2）有有关关基基因因工工程程的的叙叙述述中中，正正确确的的是是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的、所有的限制酶只能识别一种特定的 核苷酸序列核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的载体、质粒是基因工程中唯一的载体 C、载体必须具备的条件之一是：具有、载体必须具备的条件之一是：具有 多个限制酶多个限制酶 切点，以便与目的基因连接切点，以便与目的基因连接 D、DNA连接酶使黏性末端的碱基之间连接酶使黏性末端的碱基之间 形成氢键形成氢键C练习练习3 3）同一种限制酶切割成的黏性末端是）同一种限制酶切割成的黏性末端是 A.B.C.D.A（1010江苏卷）江苏卷）4.下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图l、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：（1）一个图1所示的质粒分子经Sma 切割前后，分别含有 个游离的磷酸基团。（2）若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越多，质粒的热稳定性越 。（1）0、2 （2）高（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma 切割，原因是 。（4）与只使用EcoR I相比较，使用BamH 和Hind 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止 。（3）Sma会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因（4）质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入 酶。（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了 。（5）DNA连接 （6）鉴别和筛选含有目的基因的细胞演讲完毕，谢谢观看！