病毒学第七章病毒基因.ppt

病毒学第七章病毒基因病毒学第七章病毒基因现在学习的是第1页，共54页本章重点本章重点1.1.几种重要的基因工程载体几种重要的基因工程载体2.2.噬菌体展示的原理噬菌体展示的原理现在学习的是第2页，共54页人们研究病毒，一方面是为了控制病毒性疾病，另一方面人们研究病毒，一方面是为了控制病毒性疾病，另一方面也是为了利用病毒服务人类。也是为了利用病毒服务人类。1953年年Watson和和Crick发现了发现了DNA双螺旋结构双螺旋结构，开创了分，开创了分子生物学的新时代。子生物学的新时代。1970年年H.M.Temin和和D.Baltimore对对RNA肿瘤病毒反转录肿瘤病毒反转录酶酶的发现，不仅使的发现，不仅使DNA复制的中心法则得以完善和发展，同复制的中心法则得以完善和发展，同时使时使RNA反转录为反转录为cDNA成为实验室常规手段，也使基因工程成为实验室常规手段，也使基因工程这门学科得到了飞速的发展。这门学科得到了飞速的发展。现在学习的是第3页，共54页病毒基因工程就是利用重组病毒基因工程就是利用重组DNA技术，以病毒为载体，高技术，以病毒为载体，高效表达病毒基因及其它外源基因或者对病毒基因组进行改造，用效表达病毒基因及其它外源基因或者对病毒基因组进行改造，用于制备防治病毒性疾病的疫苗、杀虫剂、进行基因治疗及开展有于制备防治病毒性疾病的疫苗、杀虫剂、进行基因治疗及开展有关蛋白功能研究。关蛋白功能研究。现在学习的是第4页，共54页第一节第一节 病毒载体病毒载体一、噬菌体载体一、噬菌体载体1、噬菌体噬菌体线状线状dsDNA，总长度为，总长度为48502bp，在，在DNA分子的两端各有分子的两端各有一条由一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的个核苷酸组成的彼此完全互补的5单链突出序列，即单链突出序列，即黏性末端。黏性末端。噬菌体噬菌体DNA进入寄主细胞后，通过两个末端互补进入寄主细胞后，通过两个末端互补结合形成黏性末端位点，使结合形成黏性末端位点，使DNA环化，开始复制。环化，开始复制。现在学习的是第5页，共54页现在学习的是第6页，共54页噬菌体整个基因组可分为三个部分噬菌体整个基因组可分为三个部分左臂：从左臂：从A到到J长约长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的丝对组装完整噬菌体所需要的结构蛋白质结构蛋白质。中段：长约中段：长约20kb，位于基因，位于基因J和和N之间，之间，是是DNA整合和切出，整合和切出，溶原生长所需的序列溶原生长所需的序列。右臂：长约右臂：长约10kb，是调控区是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及控基因和序列、以及DNA复制起始均在这区域内。复制起始均在这区域内。左右臂包含左右臂包含DNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段对溶菌生长来说，中段是非必需的是非必需的。现在学习的是第7页，共54页 噬菌体的改造噬菌体的改造噬菌体的改造噬菌体的改造2、噬菌体的缺陷与改造噬菌体的缺陷与改造 噬菌体的缺陷：噬菌体的缺陷：基因组太大（基因组太大（49kb）；）；酶酶切切点点太太多多，它它有有5个个BamH1位位点点（GGATCC），6个个Bg位位点点（AGATCT），），5个个EcoR位点（位点（GAATTC）。）。野生型只能接纳一定长度的野生型只能接纳一定长度的DNA。接纳。接纳49kb5%=2.45kb的的DNA。噬菌体的改造噬菌体的改造切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）；或更大）；去处太多的酶位点，每种酶只留去处太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口；个切口；增加标记基因（增加标记基因（remarkergene）。）。现在学习的是第8页，共54页（1）插入型载体）插入型载体：噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文文库或基因组文库的构建，库或基因组文库的构建，一般容许插入一般容许插入5-7kb外来外来DNA。cI基因插入失活：基因插入失活：如如gt10、NM1149等载体，在等载体，在cI基因上有基因上有EcoRI及及HindIII的酶切位点。的酶切位点。外源基因插入后将导致外源基因插入后将导致cI基因的失活。基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。原化，产生清晰的噬菌斑。LacZ基因插入失活：基因插入失活：如如charon16A载体，在非必须区段引入载体，在非必须区段引入lacZ基因，在基因，在lacZ基因上有基因上有EcoRI位点，插入失活后利用位点，插入失活后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。法筛选（兰白筛选）。现在学习的是第9页，共54页cIEcoRILA32.7LA32.7RA10.6RA10.6gt10gt10lacZLA19.9LA19.9RA21.9EcoRICharon16A现在学习的是第10页，共54页是重组子筛选的一种方法：是重组子筛选的一种方法：是根据载体的遗传特征筛选重组子，如是根据载体的遗传特征筛选重组子，如-互补、抗生素互补、抗生素基因等。现在使用的许多基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有的短区段，其中有-半乳糖苷酶基半乳糖苷酶基因（因（lacZ）的调控序列和前）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于响功能，这种载体适用于可编码可编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞端部分序列的宿主细胞。因此，。因此，宿主和质宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质质。这样，。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为之间实现了互补，称为-互补。由互补。由-互补而产生的互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂细菌在诱导剂IPTG的作用下，在的作用下，在生色底物生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无多克隆位点后，几乎不可避免地导致无-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。现在学习的是第11页，共54页（2）替换型载体：只有）替换型载体：只有DNA的长度大于野生型的的长度大于野生型的75%而不超而不超过过105%，才能包装成噬菌体。插入外源基因，才能包装成噬菌体。插入外源基因20kb。没有。没有外源基因插入的噬菌体不能包装。外源基因插入的噬菌体不能包装。（3）cos质粒：如果将左右臂和中段都去除，仅留下质粒：如果将左右臂和中段都去除，仅留下DNA两两端包装噬菌体所必需的端包装噬菌体所必需的cos序列，再加上质粒的复制序列、标序列，再加上质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点等，就可构成志基因、多克隆位点等，就可构成cos质粒或称为粘粒的载质粒或称为粘粒的载体体。粘粒可插入粘粒可插入45kb长的外源长的外源DNA，然后用，然后用噬菌体外壳蛋噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后，粘粒的白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后，粘粒的DNA能以质粒的能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于形式在细菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文库文库的构建。的构建。现在学习的是第12页，共54页现在学习的是第13页，共54页现在学习的是第14页，共54页2、丝状噬菌体、丝状噬菌体大肠杆菌的大肠杆菌的M13噬菌体为单链环状噬菌体为单链环状DNAM13噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：M13噬菌体的外型呈丝状，由外壳包装蛋白和正噬菌体的外型呈丝状，由外壳包装蛋白和正链链DNA组成。组成。DNA全长全长6407个核苷酸，基因组个核苷酸，基因组90%以上以上的序列可编码蛋白质，的序列可编码蛋白质，DNA上有上有11个基因，基因之间个基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因和基和基因因以及基因以及基因和基因和基因之间，其间有调节基因表之间，其间有调节基因表达和达和DNA合成的元件。成熟的噬菌体只感染雄性大肠杆菌，合成的元件。成熟的噬菌体只感染雄性大肠杆菌，M13噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长。噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长。2700270027002700个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子现在学习的是第15页，共54页M13噬菌体基因组可编码噬菌体基因组可编码3类蛋类蛋白质白质:复制蛋白复制蛋白(基因基因，和和)形态发生蛋白形态发生蛋白(基因基因，和和)结构蛋白结构蛋白(基因基因、和和)。基因组基因组DNA为正链，按基因为正链，按基因至基因至基因方向合成，与噬菌体的方向合成，与噬菌体的mRNA序列同义。序列同义。现在学习的是第16页，共54页大肠杆菌的大肠杆菌的M13单链噬菌体单链噬菌体DNAM13DNA载体的构建：载体的构建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列载体系列载体lacZpolylinker现在学习的是第17页，共54页现在学习的是第18页，共54页大肠杆菌的大肠杆菌的M13单链噬菌体单链噬菌体DNAM13噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：感染周期感染周期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA+DNAIIV 复制复制滚环复制滚环复制+DNA 复制复制现在学习的是第19页，共54页在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体DNA（正链）在（正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链宿主酶的作用下转变成环状双链DNA，用于，用于DNA的复制，的复制，因此这种双链因此这种双链DNA称为复制型称为复制型DNA（replicativeformDNA），即，即RFDNA。通过通过复制方式，复制方式，RFDNA进行扩增，基因的转录也随进行扩增，基因的转录也随即开始。基因组中的任意一个启动子都可以启动基因的转录，即开始。基因组中的任意一个启动子都可以启动基因的转录，单方向地终止于下游的终止子。启动子和终止子的位置关系单方向地终止于下游的终止子。启动子和终止子的位置关系使得靠近终止子的基因转录更频繁。使得靠近终止子的基因转录更频繁。现在学习的是第20页，共54页当当基因基因蛋白在亲代蛋白在亲代RFDNA的正链特定位点上产生的正链特定位点上产生一个切口时，便启动噬菌体基因组进行滚环复制一个切口时，便启动噬菌体基因组进行滚环复制。此时，在。此时，在大肠杆菌的大肠杆菌的DNA聚合酶聚合酶的作用下，以负链为模板在切口的作用下，以负链为模板在切口的的3末端加入核苷酸，并持续末端加入核苷酸，并持续DNA的合成，用新合成的的合成，用新合成的DNA替换原有的正链。当复制叉环绕模板整整一周时，被取代替换原有的正链。当复制叉环绕模板整整一周时，被取代的正链由基因的正链由基因产物切去，经环化后形成单位长度的噬菌产物切去，经环化后形成单位长度的噬菌体基因组体基因组DNA。在感染开始的。在感染开始的1520分钟内，这些子代分钟内，这些子代正链在宿主细胞酶的作用下，又转变成正链在宿主细胞酶的作用下，又转变成RFDNA，然后以，然后以之为模板继续转录并继续合成子代正链之为模板继续转录并继续合成子代正链DNA。现在学习的是第21页，共54页当感染细胞内累计有当感染细胞内累计有100-200个个RFDNA时，细胞内也产时，细胞内也产生了足够的生了足够的单链单链DNA结合蛋白，即基因结合蛋白，即基因蛋白蛋白。该蛋白可该蛋白可以抑制翻译活性，特别是抑制基因以抑制翻译活性，特别是抑制基因mRNA的翻译，并且的翻译，并且强烈地结合在新合成的正链强烈地结合在新合成的正链DNA上，阻止其转化成上，阻止其转化成RFDNA。此时，此时，DNA的合成几乎只产生子代正链的合成几乎只产生子代正链DNA。另外，。另外，基因基因蛋白和基因蛋白和基因蛋白也是噬菌体特异蛋白也是噬菌体特异DNA合成的强合成的强力抑制子，从而限制感染细胞内力抑制子，从而限制感染细胞内RFDNA的数量。结果，的数量。结果，感染细胞内感染细胞内RFDNA的数目和子代正链的数目和子代正链DNA的产生速率都的产生速率都能保持适度。能保持适度。现在学习的是第22页，共54页单链单链DNA的酶切和连接是比较困难的，因此的酶切和连接是比较困难的，因此M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RFDNA。RFDNA很容易从感染细胞中纯化出很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。法再次导入细胞。成熟的噬菌体颗粒仅能感染成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的的F+细胞，这细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是无论是RFDNA或或ssDNA都能转染都能转染E.coli的的F+或或F-细胞。细胞。现在学习的是第23页，共54页M13噬菌体载体噬菌体载体 6.4kb单链环状正链单链环状正链DNA基因组。基因组。作载体的优点：作载体的优点：(1)RFDNA和和SSDNA都可转染都可转染E.coli，产生噬菌斑；，产生噬菌斑；(2)无包装限制问题（可无包装限制问题（可6倍于倍于M13基因组）；基因组）；(3)复制以双链环形复制以双链环形DNA为中间媒介；为中间媒介；(4）易测出外源）易测出外源DNA的插入方向；的插入方向；(5）可产生能直接测序的单链）可产生能直接测序的单链DNA分子。分子。现在学习的是第24页，共54页二、典型的杆状病毒表达系统二、典型的杆状病毒表达系统 昆虫杆状病毒表达载体系统（昆虫杆状病毒表达载体系统（bculovrirusexpressionvectorsystem，BEVS）于）于20世纪世纪80年代初期问世，已被公认为当今基因工程四大表年代初期问世，已被公认为当今基因工程四大表达系统（即达系统（即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统物细胞表达系统）之一，应用最广的是苜蓿丫纹）之一，应用最广的是苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)与与S9细胞系。细胞系。现在学习的是第25页，共54页AcMNPV是有囊膜的是有囊膜的闭合环状闭合环状dsDNA病毒病毒，的基因表达分为，的基因表达分为4个阶个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。因表达。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多多角体蛋白和角体蛋白和P10蛋白蛋白。多角体蛋白是形成包涵体的主要成分，感染后。多角体蛋白是形成包涵体的主要成分，感染后期在细胞中的期在细胞中的积累可高达积累可高达3050，是病毒复制非必需成分，是病毒复制非必需成分，但对但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力。另一类高效表达的极病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力。另一类高效表达的极晚期蛋白为晚期蛋白为P10蛋白蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，状物质，可能与细胞溶解有关可能与细胞溶解有关。多角体基因和。多角体基因和P10基因现在都已被定位基因现在都已被定位和克隆，这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此和克隆，这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。现在学习的是第26页，共54页 AcNPV病毒用作外源基因的表达载体，通常是通过体内同源重病毒用作外源基因的表达载体，通常是通过体内同源重组的方法，用外源基因替代多角体蛋白基因而构建重组病毒。组的方法，用外源基因替代多角体蛋白基因而构建重组病毒。BEVS通常由转移载体、亲本病毒和重组介质三部分组成，通常由转移载体、亲本病毒和重组介质三部分组成，其技术路线分以其技术路线分以下几步：下几步：先将外源片段克隆到转移载体质粒中，置于杆状病毒启动子控制之下，先将外源片段克隆到转移载体质粒中，置于杆状病毒启动子控制之下，上下游各有一段与亲本病毒上下游各有一段与亲本病毒DNA相匹配的侧翼序列，构建成转移载体；相匹配的侧翼序列，构建成转移载体；然后把转移载体和野生型病毒共转染昆虫细胞，通过同源重组将外源片段然后把转移载体和野生型病毒共转染昆虫细胞，通过同源重组将外源片段插入到病毒基因组；插入到病毒基因组；再以特定的筛选标记和方法获得重组病毒。再以特定的筛选标记和方法获得重组病毒。现在学习的是第27页，共54页同源重组同源重组 发生在同源序列间的重组称为同源重组发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。，又称基本重组。是最基本的是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。片段的交换。现在学习的是第28页，共54页现在学习的是第29页，共54页杆状病毒表达体系的优点：杆状病毒表达体系的优点：杆状病毒表达体系具有与高等真核细胞类似的蛋白修饰，杆状病毒表达体系具有与高等真核细胞类似的蛋白修饰，加工和转运体系，其表达的外源基因产物在抗原性、免疫加工和转运体系，其表达的外源基因产物在抗原性、免疫原性和功能上均与天然蛋白相似。原性和功能上均与天然蛋白相似。构建杆状病毒载体的主要基因为多角体基因构建杆状病毒载体的主要基因为多角体基因ph和和p10，为，为病毒复制非必须基因。病毒复制非必须基因。多角体基因多角体基因ph和和p10有非常强大的启动子，可使目的基因有非常强大的启动子，可使目的基因大量表达，可达细胞总蛋白量的大量表达，可达细胞总蛋白量的25%。杆状病毒基因组较大（杆状病毒基因组较大（130Kb），适合克隆大片段外原基因，），适合克隆大片段外原基因，还可以同时表达几个基因。还可以同时表达几个基因。杆状病毒不感染脊椎动物，比较安全。杆状病毒不感染脊椎动物，比较安全。现在学习的是第30页，共54页现在学习的是第31页，共54页三、动物病毒载体三、动物病毒载体1、SV40（猴病毒（猴病毒40）病毒作为载体）病毒作为载体现在学习的是第32页，共54页（1）SV40基因组（多瘤病毒科）基因组（多瘤病毒科）其基因组为共价闭合环状双链其基因组为共价闭合环状双链DNA，只有，只有5243个碱基对。个碱基对。是第一个完成基因是第一个完成基因组组DNA全序列分析的动物病毒。全序列分析的动物病毒。（2）SV40的复制和增殖的复制和增殖SV40感染敏感的猿猴细胞后，经过感染敏感的猿猴细胞后，经过8-12小时的潜伏期，脱去外小时的潜伏期，脱去外壳，壳，DNA进入细胞核。进入细胞核。首先启动早期转录，在细胞质中翻译产生首先启动早期转录，在细胞质中翻译产生T和和t抗原。抗原。当两种抗原积累到足够量时，当两种抗原积累到足够量时，DNA开始复制，同时启动晚期转录，翻译开始复制，同时启动晚期转录，翻译产生壳蛋白产生壳蛋白VP1、VP2、VP3，将，将DNA包装成病毒颗粒。包装成病毒颗粒。当细胞内病毒颗粒多达当细胞内病毒颗粒多达105时，细胞破裂，释放出大量病毒颗粒。时，细胞破裂，释放出大量病毒颗粒。现在学习的是第33页，共54页 SV40病毒基因组早期基因编码两种肿瘤抗原病毒基因组早期基因编码两种肿瘤抗原(tumorantigen，T抗抗原原)，其分子量分别为，其分子量分别为94000(大大T抗原抗原)和和17000(小小T抗原抗原)。T抗原有以下的作用抗原有以下的作用:通过抑制宿主细胞通过抑制宿主细胞Rb和和p53基因，促使细胞分裂；基因，促使细胞分裂；阻止细胞凋亡；阻止细胞凋亡；结合在结合在SV40的复制起点，起始病毒复制；的复制起点，起始病毒复制；关闭病毒早期转录；关闭病毒早期转录；启动病毒晚期转录；启动病毒晚期转录；在病毒组装中起作用；在病毒组装中起作用；小小T抗原对于细胞的转化不是必需的，但可起加强作用。抗原对于细胞的转化不是必需的，但可起加强作用。现在学习的是第34页，共54页SV40DNA中的非必须区很小，故在向中的非必须区很小，故在向SV40插入外源基因插入外源基因时，须除去某些区段，同时采取相应补救措施。时，须除去某些区段，同时采取相应补救措施。早期基因被置换时，不能合成早期基因被置换时，不能合成T抗原，一般采用抗原，一般采用cos细胞来细胞来解决。解决。Cos细胞是已经被细胞是已经被SV40DNA转化了的猴传代细胞，其转化了的猴传代细胞，其染色体内的染色体内的SV40DNA可编码可编码T抗原，但没有复制起点，病抗原，但没有复制起点，病毒不能复制。将重组毒不能复制。将重组DNA导入导入cos细胞，可形成含有重组细胞，可形成含有重组DNA的病毒颗粒。的病毒颗粒。（3 3）构建）构建SV40SV40克隆载体的基本策略和途径克隆载体的基本策略和途径现在学习的是第35页，共54页晚期基因被置换，则不能合成衣壳蛋白，形成缺损性晚期基因被置换，则不能合成衣壳蛋白，形成缺损性病毒。需要另一个病毒。需要另一个SV40的温度敏感变异株作为辅助病毒，的温度敏感变异株作为辅助病毒，两者同时感染相容性细胞，形成含外源基因的重组病毒颗两者同时感染相容性细胞，形成含外源基因的重组病毒颗粒。一般来说，在相容性细胞中，病毒晚期基因启动子的粒。一般来说，在相容性细胞中，病毒晚期基因启动子的转录水平高于早期启动子。转录水平高于早期启动子。现在学习的是第36页，共54页（4）SV40作为克隆载体有其局限性：作为克隆载体有其局限性：病毒最终裂解细胞，不利于基因表达；病毒最终裂解细胞，不利于基因表达；早期功能区与病毒的致癌性有关，使用时有顾虑；早期功能区与病毒的致癌性有关，使用时有顾虑；重组重组DNA片段的大小受体限制。包装严格，不能包装大于片段的大小受体限制。包装严格，不能包装大于SV40-DNA的分子。的分子。现在学习的是第37页，共54页 第二节：病毒基因工程应用举例第二节：病毒基因工程应用举例 一、噬菌体展示一、噬菌体展示噬菌体展示技术（噬菌体展示技术（phagedisplaytechniques，PDT）是以改造的噬）是以改造的噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质区，使外菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质区，使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，进而通过亲和富集法筛源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，最终获得具有特异结合性质的选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，最终获得具有特异结合性质的多肽多肽/蛋白质，并实现基因克隆化的一种重要的分子生物学技术。蛋白质，并实现基因克隆化的一种重要的分子生物学技术。现在学习的是第38页，共54页1985年，年，SmithGP第一次将外源基因插入第一次将外源基因插入丝丝状噬菌体状噬菌体f1的的基因基因，使目的基因，使目的基因编码编码的多的多肽肽以融合蛋白的形式展示在噬菌以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而体表面，从而创创建了噬菌体展示技建了噬菌体展示技术术。该该技技术术的主要特点：的主要特点：1、将特定分子的基因型和表型、将特定分子的基因型和表型统统一在同一病毒一在同一病毒颗颗粒内，即粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白在噬菌体表面展示特定蛋白质质，而在噬菌体核心，而在噬菌体核心DNA中中则则含有含有该该蛋白的蛋白的结结构基因。构基因。2、这项这项技技术术把基因表达把基因表达产产物与物与亲亲和和筛选结筛选结合起来，可以利用合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽肽挑挑选选出来。出来。现在学习的是第39页，共54页1、噬菌体展示技术的原理、噬菌体展示技术的原理融合蛋白融合蛋白PIII基因型基因型表达型表达型现在学习的是第40页，共54页以改造的噬菌体为载体，以改造的噬菌体为载体，cDNA基因片段定向插入基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白基因区，噬菌体外壳蛋白基因区，使外源蛋白表达并展示使外源蛋白表达并展示于噬菌体表面，于噬菌体表面，通过亲和富集法筛选通过亲和富集法筛选表达有特异蛋白质的噬菌体。表达有特异蛋白质的噬菌体。现在学习的是第41页，共54页2、噬菌体展示系统噬菌体展示系统单链丝状噬菌体展示系统单链丝状噬菌体展示系统P展示系统。展示系统。丝状噬菌体是单链丝状噬菌体是单链DNA病毒，病毒，P是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染大肠埃希菌所必须的。每个病毒颗粒都有的尾端，是噬菌体感染大肠埃希菌所必须的。每个病毒颗粒都有3个个5个拷贝个拷贝P蛋白，其在结构上可分为蛋白，其在结构上可分为N1、N2和和CT3个功能区域，这个功能区域，这3个功个功能区域由两段富含甘氨酸的连接肽能区域由两段富含甘氨酸的连接肽G1和和G2连接。连接。Sg N1 G1 N2 G2 CT现在学习的是第42页，共54页其中，其中，N1和和N2与噬菌体吸附大肠埃希菌菌毛及穿透细胞膜有关，而与噬菌体吸附大肠埃希菌菌毛及穿透细胞膜有关，而CT构成噬菌体外壳蛋白结构的一部分，并将整个构成噬菌体外壳蛋白结构的一部分，并将整个P蛋白的蛋白的C端结构域端结构域锚定于噬菌体的一端。锚定于噬菌体的一端。P有有2个位点可供外源序列插入，当外源的多肽或蛋白质融合于个位点可供外源序列插入，当外源的多肽或蛋白质融合于P蛋白蛋白的信号肽的信号肽(Sg)和和N1之间时，该系统保留了完整的之间时，该系统保留了完整的P蛋白，噬菌体仍有感蛋白，噬菌体仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接与染性；但若外源多肽或蛋白直接与P蛋白的蛋白的CT结构域相连，则噬菌体结构域相连，则噬菌体丧失感染性，这时重组噬菌体的感染性由辅助噬菌体表达的完整丧失感染性，这时重组噬菌体的感染性由辅助噬菌体表达的完整P蛋蛋白来提供。白来提供。P蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有辅助噬菌体超感蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有辅助噬菌体超感染（共同感染）时，可以使每个噬菌体平均展示不到一个融合蛋白，染（共同感染）时，可以使每个噬菌体平均展示不到一个融合蛋白，即所谓即所谓“单价单价”噬菌体。噬菌体。现在学习的是第43页，共54页PIII展示系统的主要用途是制备噬茵体抗体展示系统的主要用途是制备噬茵体抗体单链抗体，单链抗体，它的突出优点是模拟了自然免疫选择系统。它的突出优点是模拟了自然免疫选择系统。用用PIII系统制备抗体的基本程序是：从经免疫或未免疫者系统制备抗体的基本程序是：从经免疫或未免疫者获取淋巴细胞获取淋巴细胞(外周血淋巴细胞，或脾、淋巴结、骨髓等的外周血淋巴细胞，或脾、淋巴结、骨髓等的淋巴细肥淋巴细肥)，提取细胞，提取细胞mRNA(或细胞基因组或细胞基因组DNA)，逆转录成，逆转录成cDNA，用，用PCR方法扩增抗体重链和轻链基因。方法扩增抗体重链和轻链基因。现在学习的是第44页，共54页VHVLCLCH1CH2CH3Hinge(Fab)2FabFcAntibody IgG structure现在学习的是第45页，共54页VHVLCLCH1CH2CH3Antibody IgG structure现在学习的是第46页，共54页VHVLCLCH1CH2CH3Fv现在学习的是第47页，共54页FvVHVLscFvVHVLSingleChainFragmentvariable现在学习的是第48页，共54页总总mRNA反转录反转录cDNAPCRVHVLlinkerPCRVHLinkerVL接入噬菌体接入噬菌体现在学习的是第49页，共54页若欲制备若欲制备ScFv抗体，则克隆抗体，则克隆VHLinkerVL基因，若基因，若制备制备Fab抗体，则可将抗体，则可将VHCH1基因克隆入基因克隆入菌体载体。菌体载体。PIII展示系统的载体，在抗体基因与展示系统的载体，在抗体基因与PIII蛋白之间插入了一个琥蛋白之间插入了一个琥珀中止密码珀中止密码(amberstopcodon)，当此密码受抑制时抗体片段，当此密码受抑制时抗体片段就展示在噬菌体表面，当此密码不受抑制时抗体则分泌。因此就展示在噬菌体表面，当此密码不受抑制时抗体则分泌。因此在抑制型和非抑制型大肠杆菌中培养重组噬菌体时就分别模拟在抑制型和非抑制型大肠杆菌中培养重组噬菌体时就分别模拟了了B细胞表面呈现抗体细胞表面呈现抗体SmIg和浆细胞分泌抗体的功能。已有和浆细胞分泌抗体的功能。已有用用PIII展示系统成功地筛选到高亲和力特异性抗体的报道。展示系统成功地筛选到高亲和力特异性抗体的报道。现在学习的是第50页，共54页Ab1Ab3Ab4单克隆抗体单克隆抗体抗原抗原Ab1抗血清抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清（多克隆抗体）普通抗血清（多克隆抗体）脾脾B细细胞胞骨髓瘤小鼠骨髓瘤小鼠取腹水取腹水骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞HAT培养，培养，稀释稀释单单克克隆隆抗抗体体和和多多克克隆隆抗抗体体产产生生区区别别示示意意图图杂交瘤细胞杂交瘤细胞+PEG,融合融合Ab2现在学习的是第51页，共54页3、噬菌体、噬菌体cDNA展示技术的应用展示技术的应用用于模拟表位的研究。用于模拟表位的研究。用于用于DNA、RNA结合蛋白的研究。结合蛋白的研究。用于蛋白用于蛋白-蛋白相互作用的研究。蛋白相互作用的研究。用于非蛋白小分子与蛋白相互作用的研究。用于非蛋白小分子与蛋白相互作用的研究。细胞与蛋白相互作用的研究。细胞与蛋白相互作用的研究。酶作用底物的分析、先导化合物的发现、定位信号转导酶作用底物的分析、先导化合物的发现、定位信号转导途径等。途径等。现在学习的是第52页，共54页4 4、展望、展望 噬菌体噬菌体cDNA展示技术有效地实现了基因型和表现型的展示技术有效地实现了基因型和表现型的转换，在分子克隆的基础上，实现蛋白质构象的体外控制，转换，在分子克隆的基础上，实现蛋白质构象的体外控制，从而可获得具有生物学活性的表达产物。若将其与蛋白质三从而可获得具有生物学活性的表达产物。若将其与蛋白质三维结构预测、分子模拟技术完美融合，对分子相互作用、分维结构预测、分子模拟技术完美融合，对分子相互作用、分子识别、受体识别、酶学机制等研究进程将起到极大的推动子识别、受体识别、酶学机制等研究进程将起到极大的推动作用。作用。现在学习的是第53页，共54页5、噬菌体展示技术的局限性、噬菌体展示技术的局限性 在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。建库的容量和分子多样性。不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以一些对由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。示。现在学习的是第54页，共54页