碱性磷酸酶的分离提取课件.ppt
Page 1关于碱性磷酸酶的分关于碱性磷酸酶的分离提取离提取现在学习的是第1页，共19页2碱性磷酸酶碱性磷酸酶 广泛存在于微生物界和动物界。碱性磷酸酶能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。现在学习的是第2页，共19页3如何获取碱性磷酸酶如何获取碱性磷酸酶 碱碱性性磷磷酸酸酶酶（AKPAKP）溶溶于于30%30%乙乙醇醇或或33%33%丙丙酮酮。但但在在60%60%的的乙乙醇醇或或50%50%丙丙酮酮中中则则形形成成沉沉淀淀。通通过过离离心心可可以以使使AKPAKP和和其其他他蛋蛋白白分分离离，从从而而得得到到纯纯化化。反反复复进进行行纯纯化化的的操操作作，可可以以获获得得较较高高纯纯度的度的AKPAKP。现在学习的是第3页，共19页4 1.综合运用有机溶剂沉淀、离心、分光等方法，从组织中分离纯化及鉴定特定蛋白质的技能。2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及鉴定的方法实验目的现在学习的是第4页，共19页5 实验原理v碱性磷酸酶在碱性碱性环境中作用于磷酸苯二 钠，使之水解生成酚和磷酸盐。酚在碱性碱性溶 液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾 氧化形成红色醌类衍生物，其颜色深浅与 AKP活性成正比。现在学习的是第5页，共19页6碱性磷酸酶的提取碱性磷酸酶的提取称称取取兔兔肝肝2g2g,剪剪碎碎后后置置于于玻玻璃璃匀匀浆浆器器中中，加加入入0.01 0.01 mol/Lmol/L的的醋醋酸酸镁镁及及醋醋酸酸钠钠混混合合液液4ml4ml,进进行行匀匀浆浆。将将其其转转入入离离心心管管，并并加加2ml2ml 0.01 0.01 mol/Lmol/L的的醋醋酸酸镁镁及及醋醋酸酸钠钠混混合合液液清清洗洗匀匀浆浆器器，之之后后将将之之倒倒入入离离心心管管，与与原原来来的的匀匀浆浆液液混混合合。记记录录体体积积a a，取取0.1ml0.1ml作作为为A A液液于于EPEP管管，待待测测比比活活性用。性用。现在学习的是第6页，共19页7碱性磷酸酶的提取碱性磷酸酶的提取在在离离心心管管中中剩剩余余的的液液体体加加入入2ml2ml正正丁丁醇醇，玻玻璃璃棒棒搅搅拌拌 2min2min，室温放置，室温放置30min30min，纱布过滤，置于离心管。，纱布过滤，置于离心管。现在学习的是第7页，共19页8碱性磷酸酶的纯化碱性磷酸酶的纯化 滤滤液液加加入入等等体体积积的的冷冷丙丙酮酮，边边倒倒边边摇摇，混混匀匀后后3000r/min 3000r/min 5min5min。弃弃上上清清，沉沉淀淀用用4ml 4ml 0.5mol/L 0.5mol/L Mg(AC)Mg(AC)2 2溶溶解解。记记录录体体积积b b。取取0.1ml0.1ml作作为为B B液液于于EPEP管管，待待测比活性用。测比活性用。在在悬悬液液中中缓缓慢慢加加入入冷冷95%95%乙乙醇醇使使其其终终体体积积为为30%30%（0.460.46体体积积），混混匀匀后后2000r/min 2000r/min 5min5min，转转移移上上清清液液于于另另一离心管。一离心管。上上 清清 液液 中中缓缓 慢慢加加 入入 冷冷 95%95%乙乙 醇醇 使使 其其 终终 体体 积积 为为60%60%（0.850.85体体积积），混混匀匀后后3000r/min 3000r/min 5min5min，沉沉淀淀用用4ml 4ml 0.01M Mg(AC)0.01M Mg(AC)2 2、NaACNaAC混合液搅拌混悬。混合液搅拌混悬。现在学习的是第8页，共19页9碱性磷酸酶的纯化碱性磷酸酶的纯化 其其余余悬悬液液中中缓缓慢慢加加入入冷冷丙丙酮酮，使使得得丙丙酮酮的的体体积积分分数数达达到到33%（0.5体体积积），混混匀匀后后2000r/min 离离心心5min，取取上上清清液液丢丢弃沉淀。弃沉淀。上上清清液液中中缓缓慢慢加加入入冷冷丙丙酮酮，使使丙丙酮酮终终体体积积分分数数达达到到50%(0.34体积），混匀后体积），混匀后3000r/min离心离心15min。沉沉淀淀中中加加入入Tris-醋醋酸酸镁镁缓缓冲冲液液5ml，即即为为纯纯化化酶酶液液。作作为为D液液用于比活性测定。用于比活性测定。现在学习的是第9页，共19页10现在学习的是第10页，共19页11碱性磷酸酶活性的鉴定碱性磷酸酶活性的鉴定磷酸苯二钠磷酸苯二钠 磷酸盐磷酸盐 +酚酚 酚酚 +4-氨基安替比林氨基安替比林 红色醌类衍生物红色醌类衍生物 AKP是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解磷酸基团。最适磷酸基团。最适pH范围为范围为8.810,需要镁离子作为激活需要镁离子作为激活剂。剂。AKP 铁氰化钾铁氰化钾现在学习的是第11页，共19页12现在学习的是第12页，共19页13 管号 空白 标准 A B C D酶液体 0.1 0.1 0.1 0.1酚标准液 0.1Tris-Mg(AC)2 0.1复合底物 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0现在学习的是第13页，共19页14 加加入入底底物物后后,立立即即混混匀匀,37 准准确确15 min后后加加入入0.5%铁铁氰氰化化钾钾2.0 ml终终止止反反应应,混匀混匀,静置静置15 min,510 nm比色比色现在学习的是第14页，共19页15 酶活性单位（U/ml)=A样A标*0.1*稀释倍数现在学习的是第15页，共19页16 蛋白质含量测定基本原理 BCA法现在学习的是第16页，共19页17 现在学习的是第17页，共19页18 现在学习的是第18页，共19页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第19页，共19页
