超声波在酶催化中的应用.ppt

关于超声波在酶催化中的应用现在学习的是第1页，共47页主讲内容v超声波的定义及特性v超声波的生物学效应（作用机制）v超声波技术应用于酶催化的研究背景v超声波技术在酶催化中的应用v超声波技术在酶催化中的研究及应用前景展望现在学习的是第2页，共47页超声波的定义及特性v什么是超声波（ultrasound）：超声波是声波大家族中的一员。声波是物体机械振动状态（或能量）的传播形式。超声波是指振动频率大于20KHz以上的,其每秒的振动次数（频率）甚高，超出了人耳听觉的上限（20000Hz），人们将这种听不见的声波叫做超声波。超声和可闻声本质上是一致的，它们的共同点都是一种机械振动，通常以纵波的方式在弹性介质内传播，是一种能量的传播形式，其不同点是超声频率高，波长短，在一定距离内沿直线传播具有良好的束射性和方向性。现在学习的是第3页，共47页超声波的定义及特性v超声波的特性：（1）超声波可在气体、液体、固体、固熔体等介质中有效传播。（2）超声波可传递很强的能量。（3）超声波会产生反射、干涉、叠加和共振现象。（4）超声波在液体介质中传播时，可在界面上产生强烈的冲击和空化现象。现在学习的是第4页，共47页超声波的生物学效应（作用机制）作用机制主要包括以下三个：v机械力学作用v热力学作用v空化作用现在学习的是第5页，共47页超声波的生物学效应（作用机制）v机械力学作用：超声波在媒质中传播，意味着超声波在其传播空间内使媒质质点进入振动状态。超声波在生物介质中疏密相间的传播，引起组织细胞容积变化及细胞液，反应介质的流动，产生的冲击波和微射流等能增加传质速度，提高分子间的碰撞几率，促进酶解反应，从而加快组织、细胞代谢作用。现在学习的是第6页，共47页超声波的生物学效应（作用机制）v热力学作用：当超声波束通过机体组织介质时，介质中的摩擦力可对超声引起的分子振动发生阻抗，部分超声能被吸收并转化为热。合适强度的超声波在机体组织内传播时，一部分能量被组织吸收由机械能转变成热能，由于不同组织细胞吸收热量不同可产生局部高温、高压，形成胞内物质的微流、涡流，促进物质的扩散与传输，有利于化学反应的进行，加速细胞新陈代谢等。强度低、作用时间久的超声主要产生热效应。现在学习的是第7页，共47页超声波的生物学效应（作用机制）v空化作用：这是超声波通过暴露介质中原先存在的气体核或微气泡而产生的作用效应，包括:(1)稳态空化或非崩溃性空化;(2)瞬态空化或崩溃性空化。适宜的超声波在组织液或液体中传播时可产生乳化作用或激活气泡，使物质分子的结构形态改变，增加细胞膜、细胞壁的通透性，利于胞内、外物质的流通；或使酶的活性中心更加暴露，促进酶与底物的结合，利于酶促反应的进行。强度高、作用时间短的超声主要产生空化效应。现在学习的是第8页，共47页超声波的生物学效应（作用机制）此外，高强度的超声波的机械作用所产生的强大冲击波、快速溶液流，可使细胞破碎；热学作用与瞬间空化作用所产生的高温与高压，可杀灭细菌、抑制酶活性或使生物大分子分解、断裂，形成自由基等。现在学习的是第9页，共47页超声波技术应用于酶催化的研究背景 上个世纪20年代，人们首次发现了超声波可以加速化学反应。随后产生了研究在超声波作用下物质进行化学反应的一门新兴交叉学科一声化学(Sonochemistry)。自声化学诞生以来，化学工作者们对超声场在化学各个领域中的研究工作从未间断。尤其是近年来，随着功率超声设备的普及与应用，使得声化学的研究工作蓬勃开展，国际及国内的研究论文骤然增多，学术交流非常活跃。为促进这一学科的发展，国际声化学界于1994年创办了超声化学(Ultrasonics Sonochemistry)杂志。现在学习的是第10页，共47页超声波技术应用于酶催化的研究背景 众所周知，对化学反应过程当有催化剂加入时，可以加速化学反应，缩短反应时间，降低反应条件。但是即便如此，有些催化反应过程所需的环境仍较为苛刻，如高温、高压、反应时间长，产率较低。众多实验结果表明，将超声波应用于催化反应过程，可进一步提高其反应速度、缩短反应时间、提高目的产物的产率、使反应在温和的条件下进行。现在学习的是第11页，共47页超声波技术应用于酶催化的研究背景 早期研究发现,较高强度的超声波会导致酶失活。新西兰白兔脑组织匀浆中的超氧化物歧化酶(SOD)经超声波处理后活性下降,过氧化脂质大幅度升高,而 K-Na ATP 酶及 Ca-Mg ATP酶活性也大幅度下降。枯草杆菌蛋白酶在 50 mmol/L、pH7.8 的磷酸缓冲液中,以波长 210 m、功率 150 W 的超声波处理 2h,酶活性下降了 50%现在学习的是第12页，共47页超声波技术应用于酶催化的研究背景 然而近年来的研究则表明,适当的超声波处理不但不会使酶失活,反而可促进酶的生物催化活性,并可在酶生产中提酶产量。用超声波处理有机溶剂中碱性蛋白酶催化 N-乙酰-苯丙氨酸乙酯的转酯反应,发现超声波可增强该酶的活性,其结果与超声波的作用频率和强度有关。用微超声波处理酵母过氧化氢酶(CAT)和多酚氧化酶(PPO),结果表明,在一定参数范围内CAT 和 PPO 的活性都升高。对 CAT 来说,其最适当的超声波参数是 13.5 kHz、40 W/cm2、处理 10 min;对 PPO 来说,其最适当参数是 13.5 kHz、25 W/cm2、处理 10 min。此外还有不少研究表明,超声波对于固定化酶的影响是很大的。对固定化菊糖酶的研究表明,20 kHz、20 W 超声波可促进该酶的催化作用,以蔗糖为底物时酶活性提高了 60%;在以菊糖为底物的反应中,超声波使水解效率提高了 70%。现在学习的是第13页，共47页超声波技术在酶催化中的应用v超声波影响酶活性的机理 超声对酶的作用来源于机械传质作用、加热作用和空化作用。酶的反应速度主要取决于2个因素：传质效率和酶分子的构象。超声通过机械传质、加热和空化3种作用影响着这2个因素。现在学习的是第14页，共47页超声波技术在酶催化中的应用 Vulfson认为超声波对酶的影响主要取决于超声波的波长(频率)、反应介质中的水含量及介质的疏水性。由于超声波强大的辐射和热能可以改变生物大分子(如 DNA 和蛋白质)的结构,往往会导致某些敏感的胞外酶活性的损失。而在低强度及适宜的频率条件下,因其具有的空穴作用、磁致伸缩作用和机械振荡作用,又表现出对溶液化学反应、结晶成核的促进功能及对酶催化的协同加速作用。超声波在介质中传播时,加速了介质中的质量传递作用,这种微流效应促进底物迅速进入酶的催化部位及产物进入介质,表现出酶催化活性的提高现在学习的是第15页，共47页超声波技术在酶催化中的应用 超声波产生的空化作用是酶活性提高的另一主要原因。空化作用产生的冲击波改变了酶分子的构象,使其折叠更合理,更易于与底物结合形成中间产物,从而影响酶促反应的进程,提高了酶催化效率。也有人认为,超声波是对酶活性部位的接触残基施加影响,使失去活性的酶复活或有活性的酶失活。现在学习的是第16页，共47页超声波技术在酶催化中的应用v超声对酶活力的影响超声对酶活力的影响 目前利用超声技术对酶进行处理主要有目前利用超声技术对酶进行处理主要有 两两 种方式：种方式：一种是超声预处理，即首先在超声介质中对酶进行超声一种是超声预处理，即首先在超声介质中对酶进行超声处理，酶干燥后再在反应介质中催化酶促反应；处理，酶干燥后再在反应介质中催化酶促反应；另一种是直接对反应介质中的酶进行超声处理，另一种是直接对反应介质中的酶进行超声处理，超声处理同酶促反应同时进行。大量的研究表明，不超声处理同酶促反应同时进行。大量的研究表明，不管采取何种方式，适宜的超声可提高酶促反应速度。管采取何种方式，适宜的超声可提高酶促反应速度。现在学习的是第17页，共47页超声波技术在酶催化中的应用 目前普遍认为，在较低强度的超声作用下，超声强度同酶活力呈正相关；随着强度的增大，酶逐渐被激活，强度越高，酶的催化活力越高。若进一步加大强度，酶催化活力反而降低，酶变性失活，强度越高，失活率越高现在学习的是第18页，共47页超声波技术在酶催化中的应用v介质性质与超声对酶的影响 研究发现，介质性质不同时，超声对酶活力的促进效果不同。Vulfson等认为，超声可提高枯草蛋白酶在丁醇、己醇、辛醇中的酯交换反应活力。现在学习的是第19页，共47页超声波技术在酶催化中的应用现在学习的是第20页，共47页超声波技术在酶催化中的应用 Vulfson指出经超声处理，在丁醇中酯交换反应速度提高了 50%，而在辛醇中提高了 68 倍。同时指出，在癸醇中，未经超声处理几乎测不到酶活性，而经超声处理后酶活大幅度提高。结果表明，超声对酶活性提高的幅度与有机溶剂的链长正相关。非极性介质的极性越小，疏水性越强，超声对酶活的促进作用就越明显。现在学习的是第21页，共47页超声波技术在酶催化中的应用v水含量对超声作用的影响 邱树毅等研究了非极性介质中水含量对超声作用的影响。他们认为，在水饱和的有机溶剂中，水分子进入酶分子周围，补充了酶分子的必需水，因此水饱和非极性介质中酶催化反应的初速度比脱水非极性介质中的初速度要高。他们比较了在脱水正辛烷和水饱和正辛烷中脂肪酶催化 1-三甲基-1-丙醇与戊酸的酯交换反应中超声的促进作用，结果却表明非极性介质水含量的影响甚小。他们对这一现象的解释为超声使酶反应的初速度大大提高，从而使非极性介质水含量对酶催化反应初速度的影响可以忽略不计。现在学习的是第22页，共47页超声波技术在酶催化中的应用v介质性质与酶在超声作用下的稳定性 大量的实验表明，与水溶液相比，酶在非极性介质中对超声作用有较大的抗性。例如枯草蛋白酶经超声处理2h后，水相中酶活损失 50%，而戊醇中酶活几乎不变.现在学习的是第23页，共47页超声波技术在酶催化中的应用 宗敏华老师等在研究固定化脂肪酶水解三乙酸甘油酯时，探讨了反应介质对脂肪酶稳定性的影响。较大功率下（140W），超声对正己烷中脂肪酶催化三乙酸甘油酯水解活力的影响甚小：超声时间少于 20min 时，几乎未出现酶的失活现象；超声处理时间达到 40min 时，酶活力损失仅为 11.8%。而在水溶液中，超声处理使酶迅速失活，10min 时失活率就达到了 58.4%，处理 40min 后失活率高达93.3%。而以四氢呋喃为介质时，失活率介于水和正己烷之间。这表明介质疏水性越强，抗超声变性能力越强。其他条件相同时，在正己烷中，140W 的超声作用对酶活的影响较小；而在水中，即使超声的功率只有 20W，酶也表现出明显失活。现在学习的是第24页，共47页超声波技术在酶催化中的应用 他们推测，可能是由于酶在疏水性强的非极性介质中具有较大的刚性，不易发生构象变化而失活的缘故。现在学习的是第25页，共47页超声波技术在酶催化中的应用v非极性介质的含水量和酶的稳定性之间关系 非极性介质的含水量和酶的稳定性之间也存在着一定的联系。水含量对酶活力影响很大。用水含量分别为 0%，1%，2%，5%和 10%的四氢呋喃作为超声介质，脂肪酶活力随水含量的增加而急剧下降。含水量为 10%时，酶活力仅存 4.8%。因此，在利用超声提高酶反应速度时需要严格控制非极性介质的含水量现在学习的是第26页，共47页超声波技术在酶催化中的应用v超声波对固定化酶活性的影响 用超声波处理时，固定化酶的适应性强，酶失活少。有关超声波激活固定化酶的研究已有报道。1981年Ishimori et al发现，利用超声处理固定化葡萄糖氧化酶时，活性表现出来，而当停止超声处理时，活性则消失。用20kHz声场处理固定于琼脂胶上的。a-胰凝乳蛋白酶(以酪蛋白作底物)，活性提高2倍。用7MHz超声波辐照固定于多孔聚苯乙烯上的a-淀粉酶时，酶活力也有提高。用频率0.88kHz、声强0.05-1W/cm2的声波对肌酸激酶、乳酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸激酶所催化的反应进行多次，结果对反应速率均没有明显直接影响。但将酶固定化以后，超声波处理使固定化酶反应速率明显增加。现在学习的是第27页，共47页超声波技术在酶催化中的应用 种种研究结果表明，适宜的超声波处理固定化酶，可以在一定程度上提高酶活性。但超声波对酶活性的改善依不同的酶而有不同。某些酶可能对超声波的作用较为敏感，在一定的超声波作用下，就会改变酶活性而另一些酶可能就不太敏感，用超声波处理时，其活力的改变就不会太大。现在学习的是第28页，共47页超声波技术在酶催化中的应用v超声波作用于固定化酶的影响因素超声波功率的影响 许多研究表明超声波的功率强度对酶活性有较重要的影响。适当强度的超声波可以使酶活力的表现达到最仕状态。相反，不适当强度的超声波处理不但不会增强酶活力，甚至可以降低酶的活力当然，超声波对不同的酶有一不同的作用效果，因而不同的酶对超声波功率的要求是不同的。现在学习的是第29页，共47页超声波技术在酶催化中的应用超声连续辐照时间对酶活的影响 刘耘等研究表明，对有机相中Lipozyme进行超声辐照处理时(蔗糖为底物)，酶活力随着连续超声辐照时间的延长而大幅度提高。其他条件相同情况下，将120s/30s和30s/30s(均为辐射时间/间歇时间)两种作用方式进行比较表明，在120s/30s的形式下，相对酶活力高达247.7%。而在适宜的超声功率下，总超声时问对酶活力影响甚少现在学习的是第30页，共47页超声波技术在酶催化中的应用超声介质的特性对固定化酶活性的影响 一般酶都在水溶液中催化反应，但很多酶还能在非水溶剂中催化反应。研究结果揭示，超声能量对处于不同溶剂中的酶分子的作用效果是有差别的。一般来说，酶在不同的溶剂系统中有不同的活力表现。超声波对在不同溶剂系统中的酶分子的催化特性有不同的影响效果，这是很容易理解的。现在学习的是第31页，共47页超声波技术在酶催化中的应用 宗敏华等研究表明，Lipozyme在不同介质中经超声辐照处理不同时间后，活性不同;他们发现，溶剂的疏水性越强，酶抗超声辐射变性作用的能力越强。在正己烷中，处理对酶活影响甚小，处理时间小于20min，几乎未出现酶的失活;处理40min后，活力损失仅11.8%。在水相中，超声辐照处理使酶迅速失活，处理l0min后，酶的失活率为58.4%，处理40min后，酶失活率高达93.3%。在四氢峡喃中，酶对超声辐射变性作用的抗性介于正己烷和水之间。刘耘等研究表明，超声介质中水的含量对Lipozyme活力影响很大。在脱水四氢呋喃中，超声辐照60min，酶活力损失24.6%，到含水量10%时，酶活力仅存4.8%。现在学习的是第32页，共47页超声波技术在酶催化中的应用固定化酶颗粒大小和反应系统的影响 林影等研究超声波对固定化菊糖酶作用的影响时，以纯菊糖为底物，选择不同直径范围的固定化酶颗粒反应，发现随着固定化酶颗粒的增大，超声波的促进作用增大。他们发现静止反应的超声波作用比振荡反应的作用效果更加显著。现在学习的是第33页，共47页超声波技术在酶催化中的应用底物和载体颗粒大小对超声作用效果的影响 P.Schmidt等和林影等都发现随着底物相对分子质量增大，超声波对固定化酶促进作用增大。P.Schmidt等采用底物流动系统反应，发现底物流速越大，酶促反应速度越小。他们还发现超声波对酶的影响跟载体颗粒有关，但并不呈线性关系。现在学习的是第34页，共47页超声波技术在酶催化中的应用v超声波影响固定化酶活性的机理P.Schmidt等认为超声波引起固定化酶活力增强的可能机理是，活力在固体载体表面附近的总体积中的运输过程中增加，并提出以下事实进行支持:1.超声效果随着分子量增加而增大。小分子物质比大分子更容易穿过固体基质，因而受声场影响较小。2.超声效果随流速增加而减小。随着底物溶液流经载体颗粒速度增加，每一颗粒周围的静止层尺寸变小，底物扩散加快，因而超声效率降低。3.超声效率大小与载体颗粒大小有关。但由于随着颗粒直径增加，扩散限制也增加，因而颗粒最大时超声增加效应不一定最大。4.超声效应增加是频率平方的函数。现在学习的是第35页，共47页超声波技术在酶催化中的应用 高大维等认为可能的机理是，在适当的超声场条件下的底物和产物分子在超声波的驱使下，以较高的频率振动，固定化酶与底物和反应物的接触次数大大增加，同时产物释放也加快，从而使得固定化糖化酶的表观米氏常数减少，反应速率增加，而在一定条件下超声波对酶的微细结构活性部位影响不大，表现为酶的最适作用pH和温度不变。现在学习的是第36页，共47页超声波技术在酶催化中的应用林影等认为，超声波对酶催化反应的促进机理中，超声波对促进反应物质的扩散和传输起主导作用，它对改善固定化酶对大分子物质传输阻碍有着很大的应用前景。另外，也有人认为超声提高固定化酶酶活力的机理是超声促进底物透入载体或主要是声流的作用。现在学习的是第37页，共47页超声波技术在酶催化中的应用v可见，对于超声波影响酶促反应的机理，不同的作者有不同的理解和解释。也许在不同的条件下有不同的作用效果，或者可以说超声波对固定化酶活性的影响是各种机理影响的综合效果。因此，要对其作用机理作出更加合理的解释，还要进行更加深入的研究。v固定化酶己成功地工业化了，如何利用超声波的促进传质作用，克服固定化技术中存在的传质障碍，以提高酶固定化技术在工业上的应用度，是亟待深入探讨的问题。现在学习的是第38页，共47页超声波技术在酶催化中的应用v一些应用实例现在学习的是第39页，共47页超声波技术在酶催化中的应用现在学习的是第40页，共47页超声波技术在酶催化中的应用现在学习的是第41页，共47页超声波技术在酶催化中的应用现在学习的是第42页，共47页超声波技术在酶催化中的应用现在学习的是第43页，共47页超声波技术在酶催化中的研究及应用前景展望v超声作为一种能量传播形式，可将能量释放到介质中，从而使介质中的分子产生物理和化学变化。v超声与酶的作用是复杂的。适宜强度的超声可以增强酶的催化活力，提高酶促反应速度。超声强度过大时，会破坏酶分子的结构，反而会降低酶的活力甚至使酶失活。v酶在超声作用下的稳定性与介质的性质有关。与水溶液中相比，酶在非极性介质中具有更高的稳定性。v超声具有效率高、价格低、无污染、易获得等优点，特别适用于生物研究领域。应用超声技术提高酶促反应速度是具有良好应用前景的技术，已引起了广大生物科学工作者的兴趣。但这方面的报道比较少，有待进一步的研究。现在学习的是第44页，共47页超声波技术在酶催化中的研究及应用前景展望v超声技术应用于生物工程领域还有许多工作要做。v固定化酶和固定化细胞技术已经成功地工业化了,如果利用超声波的促进传质作用,克服固定化技术中存在的传质障碍。则可大大提高固定化技术的工业应用;v非水相酶催化有机合成是有机合成的新途径,正受到有机化学家的青睐,但其反应速度慢,产率低,利用超声技术,可大大提高其反应速度及产率。v超声技术可用于提高细胞膜和细胞壁透性,增强代谢活性及促进有益物质的生成,以及用于下游工程等。v这些均是超声技术在生物工程中应用的有趣课题。现在学习的是第45页，共47页超声波技术在酶催化中的研究及应用前景展望v目前有关这方面的应用基础研究还很缺乏,相应的超声生物反应器研究更是空白。目前国内已开展超声声化学反应器的研制开发,但将其应用于生物技术领域还需研制。v总的来说,超声技术简单,易于实现,它在生物工程领域的应用前景是十分广阔和诱人的。现在学习的是第46页，共47页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第47页，共47页