碱性磷酸酶值测定课件.ppt

关于碱性磷酸酶值测定现在学习的是第1页，共18页实验目的学习环境因素对酶促反应速度的影响；学习米氏方程及Km值得测定；测量碱性磷酸酶km值；实验原理 E的反应速度受到环境因素的影响，这些因素包括底物浓度、E浓度、PH、温度、激活剂、抑止剂等现在学习的是第2页，共18页（一）米曼氏方程式（一）米曼氏方程式中间产物中间产物 酶促反应模式酶促反应模式中间产物学说中间产物学说E+S k1k2k3ESE+P相关相关E学原理学原理现在学习的是第3页，共18页19131913年年年年MichaelisMichaelis和和和和MentenMenten提提提提出出出出反反反反应应应应速速速速度度度度与与与与底底底底物物物物浓浓浓浓度度度度关关关关系系系系的的的的数数数数学学学学方方方方程程程程式式式式，即即即即米米米米曼曼曼曼氏氏氏氏方方方方程程程程式式式式，简称米氏方程式简称米氏方程式简称米氏方程式简称米氏方程式(Michaelis equation)(Michaelis equation)。S：底物浓度底物浓度V：不同不同S时的反应速度时的反应速度Vmax：最大反应速度最大反应速度(maximum velocity)m：米氏常数米氏常数(Michaelis constant)VmaxS Km+S 现在学习的是第4页，共18页当反应速度为最大反应速度一半时当反应速度为最大反应速度一半时当反应速度为最大反应速度一半时当反应速度为最大反应速度一半时v Km值的推导值的推导KmS Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是底物浓度，单位是mol/L。2Km+S Vmax VmaxSVmaxVSKmVmax/2 现在学习的是第5页，共18页（二）（二）Km与与Vmax的意义的意义 K Km m值值 K Km m等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。意义：意义：a)a)K Km m是酶的特征性常数之一；是酶的特征性常数之一；b)b)K Km m可近似表示酶对底物的亲和力；可近似表示酶对底物的亲和力；c)c)同一酶对于不同底物有不同的同一酶对于不同底物有不同的KmKm值。值。现在学习的是第6页，共18页 Vmax定义：定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。正比。现在学习的是第7页，共18页（三）（三）m m值与值与maxmax值的测定值的测定1.双倒数作图法双倒数作图法(double reciprocal plot)，又，又称为称为 林林-贝氏贝氏(Lineweaver-Burk)作图法作图法-1/Km 1/V 1/Vmax max 1/S 1/S 1/V 1/V VmaxS Km+SV=（林贝氏方程）（林贝氏方程）+1/V=KmVmax 1/Vmax 1/S 两边同取倒数两边同取倒数 现在学习的是第8页，共18页2.Hanes作图法作图法S S S/V S/V -Km K Kmm/V/Vm m 在林贝氏方程基础上，两边同乘在林贝氏方程基础上，两边同乘在林贝氏方程基础上，两边同乘在林贝氏方程基础上，两边同乘SSSSS/V=KS/V=Kmm/V/Vmax max+S/V+S/Vmax max 现在学习的是第9页，共18页酶浓度对反应速度的影响酶浓度对反应速度的影响当当SE，酶酶可可被被底底物物饱饱和和的的情情况况下下，反反应应速速度与酶浓度成正比。度与酶浓度成正比。关系式为：关系式为：V=K3 E0 V E 当当SE时，时，Vmax=k3 E 酶浓度对反应速度的影响酶浓度对反应速度的影响 现在学习的是第10页，共18页q双重影响双重影响温温度度升升高高，酶酶促促反反应应速速度度升升高高；由由于于酶酶的的本本质质是是蛋蛋白白质质，温温度度升升高高，可可引引起起酶酶的的变变性性，从从而而反反应应速速度度降降低低 。温度对反应速度的影响温度对反应速度的影响q最适温度最适温度 (optimum temperature)：酶促反应速度最快时的酶促反应速度最快时的环境温度。环境温度。*低温的应用低温的应用酶酶活活性性0.51.02.01.50 10 20 30 40 50 60 温度温度 C 温度对淀粉酶活性的影响温度对淀粉酶活性的影响 现在学习的是第11页，共18页pH对反应速度的影响对反应速度的影响q最适最适pH (optimum pH)：酶催化活性最大酶催化活性最大时的环境时的环境pH。0酶酶活活性性 pH pH对某些酶活性的影响对某些酶活性的影响 胃蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶 淀粉酶淀粉酶淀粉酶淀粉酶 胆碱酯酶胆碱酯酶胆碱酯酶胆碱酯酶 246810现在学习的是第12页，共18页碱性磷酸酶碱性磷酸酶kmkm值的测定值的测定现在学习的是第13页，共18页操作操作试剂试剂（mlml）1234562.5mM2.5mM磷酸苯二钠磷酸苯二钠0.20.40.60.81.01.0蒸馏水蒸馏水0.80.60.40.2碱性缓冲液碱性缓冲液1.01.01.01.01.01.0混匀后，37水浴5min碱性磷酸酶碱性磷酸酶0.10.10.10.10.1混匀后，37水浴15min(准确计时）酚试剂酚试剂1.01.01.01.01.01.0碱性磷酸酶碱性磷酸酶0.110%10%碳酸钠碳酸钠3.03.03.03.03.03.0混匀后，37水浴15min,以第6管调0与650nm比色，读取各管A值。现在学习的是第14页，共18页实验数据及结果实验数据及结果管号管号A6501/A650s1/s123456以上述数据双倒数作图，求出以上述数据双倒数作图，求出碱性磷酸酶的碱性磷酸酶的Km值。值。现在学习的是第15页，共18页实验讨论实验讨论Km值的定义和意义是什么？值的定义和意义是什么？米氏方程度表达式是什么，如何求出米氏方程度表达式是什么，如何求出Vmax和和Km？现在学习的是第16页，共18页现有某待测样品液5ml，将其稀释到100ml，取其稀释液1ml加入测定管按酚试剂法测其蛋白质含量，另取已知浓度的牛血清白蛋白溶液（250微克/ml）1ml加入标准管，其余操作同测定管。反应显色后测得吸光度分别为：A测=0.4，A标=0.25，求原样品液中的蛋白质含量（g/100ml）0.8现在学习的是第17页，共18页05.04.2023感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第18页，共18页