糖代谢与控制 (2)课件.ppt

关于糖代谢与控制关于糖代谢与控制(2)现在学习的是第1页，共70页第一节 糖代谢与调节n n微微微微生生生生物物物物分分分分解解解解葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖可可可可归归归归纳纳纳纳为为为为有有有有氧氧氧氧降降降降解解解解和和和和无无无无氧氧氧氧降降降降解解解解两两两两大大大大类型。类型。类型。类型。n n葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖有有有有氧氧氧氧降降降降解解解解途途途途径径径径的的的的最最最最终终终终产产产产物物物物是是是是COCOCOCO2 2 2 2和和H H H H2 2O O，同同同同时时时时产产产产生生生生组组组组成成成成细细细细胞胞胞胞物物物物质质质质的的的的中中中中间间间间产产产产物物物物和和和和大大大大量量量量的的的的能能能能量量量量。主主主主要要要要包包包包括括括括EMPEMPEMPEMP、TCATCA、HMPHMP途径。途径。途径。途径。n n葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖的的的的无无无无氧氧氧氧降降降降解解解解的的的的产产产产物物物物为为为为各各各各种种种种有有有有机机机机酸酸酸酸、醇醇醇醇和和和和气气气气体体体体（COCOCOCO2 2 2 2和和H H H H2 2 2 2），主要包括），主要包括），主要包括），主要包括EMPEMPEMPEMP、HMPHMPHMPHMP两种基本方式。两种基本方式。两种基本方式。两种基本方式。现在学习的是第2页，共70页一、一、EMP途径途径n nEMP途途径径是是生生物物界界共共有有的的。在在该该途途径径中中，葡葡萄萄糖糖被被转转化化为为F-1,6-2P后后开开始始降降解解成成PYR，包包括括10个独立的，但又是连续的反应。个独立的，但又是连续的反应。n nPFK是是EMP途途径径的的关关键键酶酶，受受ATP、O2、柠柠檬酸的抑制，为檬酸的抑制，为AMP所激活。所激活。现在学习的是第3页，共70页n n葡萄糖经葡萄糖经EMPEMP途径降解成丙酮酸的总反应式为：途径降解成丙酮酸的总反应式为：C6H12O6+2NAD+2Pi+2ADP2PYR+（NADH+H+）+2ATPn n在在无无氧氧条条件件下下，如如以以乙乙醛醛作作为为受受氢氢体体，即即是是酒酒精精发发酵酵，如如以以丙丙酮酮酸酸作作为为受受氢氢体体，即即是是乳乳酸酸发发酵。酵。现在学习的是第4页，共70页二、二、HMP途径途径n n葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖在在在在转转转转化化化化成成成成6-6-磷磷磷磷酸酸酸酸葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖酸酸酸酸后后后后就就就就分分分分解解解解成成成成为为为为COCO2 2和和和和5-5-磷磷磷磷酸酸酸酸核核核核酮酮酮酮糖糖糖糖，也也也也就就就就是是是是在在在在单单单单磷磷磷磷酸酸酸酸己己己己糖糖糖糖的的的的基基基基础础础础上上上上开开开开始始始始降降降降解的。因此常称为单磷酸己糖途径，即解的。因此常称为单磷酸己糖途径，即解的。因此常称为单磷酸己糖途径，即解的。因此常称为单磷酸己糖途径，即HMPHMP途径。途径。途径。途径。n n这条途径的主要特点是：这条途径的主要特点是：这条途径的主要特点是：这条途径的主要特点是：葡萄糖直接脱氢和脱羧，不必先经过三碳糖阶段。葡萄糖直接脱氢和脱羧，不必先经过三碳糖阶段。葡萄糖直接脱氢和脱羧，不必先经过三碳糖阶段。葡萄糖直接脱氢和脱羧，不必先经过三碳糖阶段。只有辅酶只有辅酶只有辅酶只有辅酶（NADPNADP+）参与反应。）参与反应。）参与反应。）参与反应。n nHMPHMP途径的总反应式为：途径的总反应式为：途径的总反应式为：途径的总反应式为：G-6-P+12NADPG-6-P+12NADP+7H+7H2 206CO06CO2 2+12(NADPH+H+12(NADPH+H+)+Pi)+Pi现在学习的是第5页，共70页n nHMP途径的生物学意义：途径的生物学意义：HMP途途径径是是细细胞胞产产生生还还原原力力（NADP）的的主主要要途途径。径。HMP途途径径是是细细胞胞内内不不同同结结构构糖糖分分子子的的重重要要来来源源，并为各种单糖的相互转变提供条件。并为各种单糖的相互转变提供条件。现在学习的是第6页，共70页n nED途途径径主主要要存存在在于于假假单单胞胞菌菌（Pseudomonas Pseudomonas sp.sp.）等少数革兰氏阴性菌。等少数革兰氏阴性菌。n nED途途途途径径径径特特特特有有有有的的的的酶酶酶酶是是是是KDPGKDPG醛醛缩缩酶酶。它它催催化化己己糖糖裂裂解为三碳化合物的反应。解为三碳化合物的反应。n nEDED途径的总反应式为：途径的总反应式为：途径的总反应式为：途径的总反应式为：Glc+ADP+NADP+NAD+NAD+2PYR+ATP+NADPH+2H+NADH+NADH三、三、ED途径途径现在学习的是第7页，共70页现在学习的是第8页，共70页四、四、TCATCA循环循环n n三三羧羧酸酸循循环环又又称称柠柠檬檬酸酸循循环环，简简称称为为TCA循循环环，也称也称Krebs cycle。n n丙丙酮酮酸酸氧氧化化脱脱羧羧产产物物乙乙酰酰CoA与与草草酰酰乙乙酸酸（三三羧羧酸酸循循环环中中与与乙乙酰酰CoA结结合合点点）结结合合生生成成柠柠檬檬酸酸进进入入循循环环。在在循循环环过过程程中中，乙乙酰酰CoA被被氧氧化化成成 H2O 和和CO2，并释放出大量能量。，并释放出大量能量。现在学习的是第9页，共70页现在学习的是第10页，共70页n n生物氧化n n葡萄糖在有氧条件下的分解过程，包括3个环节：底物的脱氢作用；氢或电子的传递；受氢体接受氢。五、电子传递系统与氧化磷酸化五、电子传递系统与氧化磷酸化现在学习的是第11页，共70页现在学习的是第12页，共70页现在学习的是第13页，共70页六、糖代谢的调节六、糖代谢的调节1 1、能荷调节、能荷调节n n糖糖糖糖代代代代谢谢谢谢的的的的调调调调节节节节主主主主要要要要是是是是受受受受能能能能荷荷荷荷的的的的控控控控制制制制，也也也也就就就就是是是是受受受受细细细细胞胞胞胞内能量水平的控制。内能量水平的控制。内能量水平的控制。内能量水平的控制。n n糖糖糖糖代代代代谢谢谢谢最最最最重重重重要要要要的的的的生生生生理理理理功功功功能能能能是是是是以以以以ATPATPATPATP的的的的形形形形式式式式供供供供给给给给热热热热量量量量，在在在在葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖氧氧氧氧化化化化过过过过程程程程中中中中，中中中中间间间间产产产产物物物物积积积积累累累累或或或或减减减减少少少少，进进进进而而而而引引引引起能荷的变化，造成代谢终产物起能荷的变化，造成代谢终产物起能荷的变化，造成代谢终产物起能荷的变化，造成代谢终产物ATPATPATPATP的过剩或减少。的过剩或减少。的过剩或减少。的过剩或减少。n n这这这这些些些些中中中中间间间间产产产产物物物物和和和和腺腺腺腺嘌嘌嘌嘌呤呤呤呤核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸通通通通过过过过抑抑抑抑制制制制或或或或激激激激活活活活糖糖糖糖代代代代谢谢谢谢各各各各阶阶阶阶段关键酶的活性来调节能量的生成。段关键酶的活性来调节能量的生成。段关键酶的活性来调节能量的生成。段关键酶的活性来调节能量的生成。现在学习的是第14页，共70页现在学习的是第15页，共70页n n能荷（能荷（能荷（能荷（Energy chargeEnergy chargeEnergy chargeEnergy charge）：）：）：）：（ATPATPATPATP）+1/2+1/2+1/2+1/2（ADPADPADPADP）/（ATPATPATPATP）+（ADPADPADPADP）+（AMPAMPAMPAMP）n n当当当当生生生生物物物物体体体体内内内内生生生生物物物物合合合合成成成成或或或或其其其其它它它它需需需需能能能能反反反反应应应应加加加加强强强强时时时时，细细细细胞胞胞胞内内内内ATPATPATPATP分分分分解解解解生生生生成成成成ADPADPADPADP和和和和AMPAMPAMPAMP。一一一一旦旦旦旦ATPATPATPATP减减减减少少少少，ADPADPADPADP或或或或AMPAMPAMPAMP增增增增加加加加，即即即即能能能能荷荷荷荷降降降降低低低低，就就就就会会会会激激激激活活活活某某某某些些些些催催催催化化化化糖糖糖糖类类类类分分分分解解解解的的的的酶酶酶酶或或或或解解解解除除除除ATPATPATPATP对对对对这这这这些些些些酶酶酶酶的的的的抑抑抑抑制制制制，并并并并抑抑抑抑制制制制糖糖糖糖原原原原合合合合成成成成的的的的酶酶酶酶，从从从从而而而而加加加加速速速速糖糖糖糖酵酵酵酵解解解解，TCATCATCATCA循环产生的能量，通过氧化磷酸化作用生成循环产生的能量，通过氧化磷酸化作用生成循环产生的能量，通过氧化磷酸化作用生成循环产生的能量，通过氧化磷酸化作用生成ATPATPATPATP。n n当当当当能能能能荷荷荷荷高高高高时时时时，即即即即细细细细胞胞胞胞内内内内能能能能量量量量水水水水平平平平高高高高时时时时，AMPAMPAMPAMP、ADPADPADPADP都都都都转转转转变变变变成成成成ATPATPATPATP，情况则相反。，情况则相反。，情况则相反。，情况则相反。现在学习的是第16页，共70页2 2、生物素的调节、生物素的调节n n生生物物素素对对糖糖酵酵解解的的影影响响，主主要要是是解解糖糖速速度度，而而不是不是EMP/HMPEMP/HMP的比率。的比率。n n当当生生物物素素充充足足时时，解解糖糖速速度度显显著著提提高高，比比PYRPYR进进一步氧化速度提高得快，造成乳酸积累。一步氧化速度提高得快，造成乳酸积累。n n当当生生物物素素缺缺乏乏时时，由由于于NADNAD水水平平降降低低的的结结果果，间间接地引起四碳二羧酸氧化能力下降。接地引起四碳二羧酸氧化能力下降。现在学习的是第17页，共70页生物素充足和缺乏条件下，丙酮酸代谢的推测途径。生物素充足和缺乏条件下，丙酮酸代谢的推测途径。现在学习的是第18页，共70页现在学习的是第19页，共70页第二节第二节 D-D-核糖发酵核糖发酵一、一、D-D-核糖（核糖（Ribose）概述）概述n nD-D-D-D-核核核核糖糖糖糖在在在在体体体体内内内内具具具具有有有有重重重重要要要要的的的的生生生生理理理理功功功功能能能能，参参参参与与与与多多多多种种种种新新新新陈陈陈陈代代代代谢谢谢谢活活活活动动动动，是是是是生生生生物物物物体体体体内内内内遗遗遗遗传传传传物物物物质质质质基基基基础础础础RNARNARNARNA、DNADNA及及及及若若若若干辅酶和维生素的组成成份。干辅酶和维生素的组成成份。干辅酶和维生素的组成成份。干辅酶和维生素的组成成份。n n在在在在医医医医药药药药上上上上，D-D-D-D-核核核核糖糖糖糖本本本本身身身身作作作作为为为为药药药药物物物物用用用用于于于于治治治治疗疗疗疗心心心心肌肌肌肌缺缺缺缺血血血血、运运运运动动动动导导导导致致致致的的的的肌肌肌肌肉肉肉肉疼疼疼疼痛痛痛痛。作作作作为为为为医医医医药药药药中中中中间间间间体体体体，D-D-核核核核糖糖糖糖是是是是大大大大规规规规模模模模合合合合成成成成核核核核黄黄黄黄素素素素、病病病病毒毒毒毒唑唑唑唑的的的的主主主主要要要要原原原原料料料料，可可可可大大大大幅幅幅幅度度度度降降降降低低低低生生生生产产产产成成成成本本本本。在在在在食食食食品品品品工工工工业业业业中中中中可可可可以以以以作作作作为为为为调调调调味味味味品品品品、调调调调味味味味香香香香料料料料等等等等合成原料。合成原料。合成原料。合成原料。现在学习的是第20页，共70页n n在在自自然然界界中中，D-D-D-D-核核核核糖糖糖糖不不不不以以以以单单单单体体体体存存存存在在在在，长长长长期期期期以以以以来来来来一一一一直直直直作作作作为为为为昂昂昂昂贵贵贵贵的的的的生生生生化化化化试试试试剂剂剂剂，国国国国内内内内需需需需求求求求主主主主要要要要依依依依靠靠靠靠进进进进口口口口。用用用用微微微微生生生生物物物物发发发发酵酵酵酵法法法法可可可可大大大大规规规规模模模模生生生生产产产产D-D-D-D-核核糖糖，价价格格低低廉廉，解解决决了了核核黄黄素素、病病毒毒唑唑等等药药物物的的原原料料来来源源，市市场场应应用用前前景景非常乐观。非常乐观。n n采采用用生生物物技技术术发发酵酵法法生生产产D-D-D-D-核核核核糖糖糖糖成成成成本本本本低低低低、污污污污染染染染小小小小，是是是是当当当当前前前前最最最最为为为为经经经经济济济济有有有有效效效效的的的的D D核核糖糖生生产产方方法法。目目前前国国际际市市场场上上D-D-核核核核糖糖糖糖价价价价格格格格是是是是303040404040美美美美元元元元/千千千千克克克克，发发发发酵酵酵酵法法法法生生生生产产产产D-D-核核核核糖糖糖糖成成成成本本本本约约约约在在在在人人人人民民民民币币币币150150200200元元/kg/kg/kg/kg，属属于于高高附附加加值产品。值产品。现在学习的是第21页，共70页二、二、D-D-核糖的生物合成途径核糖的生物合成途径现在学习的是第22页，共70页n n葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖在在在在葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖激激激激酶酶酶酶的的的的作作作作用用用用下下下下先先先先生生生生成成成成葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖-6-6-6-6-磷磷磷磷酸酸酸酸（G-G-G-G-6-P6-P6-P6-P），并并并并继继继继续续续续由由由由6-6-6-6-磷磷磷磷酸酸酸酸-D-D-D-D-葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖脱脱脱脱氢氢氢氢酶酶酶酶催催催催化化化化转转转转化化化化为为为为6-6-6-6-磷磷磷磷酸酸酸酸-D-D-D-D-葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖酸酸酸酸（6-P-D-Gn6-P-D-Gn6-P-D-Gn6-P-D-Gn）(主主主主要要要要途途途途径径径径）；G G G G也也也也可可可可以以以以在在在在葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖脱脱脱脱氢氢氢氢酶酶酶酶的的的的作作作作用用用用下下下下生生生生成成成成D-D-D-D-葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖酸酸酸酸（GnGnGnGn），经经经经葡糖酸激酶的催化生成葡糖酸激酶的催化生成葡糖酸激酶的催化生成葡糖酸激酶的催化生成6-P-D-Gn6-P-D-Gn6-P-D-Gn6-P-D-Gn（次要途径）。（次要途径）。（次要途径）。（次要途径）。n n所所所所生生生生成成成成的的的的6-P-D-Gn6-P-D-Gn6-P-D-Gn6-P-D-Gn在在在在6-6-6-6-磷磷磷磷酸酸酸酸葡葡葡葡糖糖糖糖酸酸酸酸脱脱脱脱氢氢氢氢酶酶酶酶的的的的作作作作用用用用下下下下生生生生成成成成D-D-D-D-核核核核酮酮酮酮糖糖糖糖-5-5-5-5-磷磷磷磷酸酸酸酸（D-Rn-5-PD-Rn-5-PD-Rn-5-PD-Rn-5-P）。D-Rn-5-PD-Rn-5-PD-Rn-5-PD-Rn-5-P在在在在5-5-5-5-磷磷磷磷酸酸酸酸核核核核酮酮酮酮糖糖糖糖差差差差相相相相异异异异构构构构酶酶酶酶的的的的作作作作用用用用下下下下生生生生成成成成D-D-D-D-木木木木酮酮酮酮糖糖糖糖-5-5-5-5-磷磷磷磷酸酸酸酸，也也也也可可可可在在在在5-5-5-5-磷磷磷磷酸酸酸酸核核核核糖糖糖糖异异异异构构构构酶酶酶酶的的的的作作作作用用用用下下下下生生生生成成成成D-D-D-D-核核核核酮酮酮酮糖糖糖糖-5-5-5-5-磷磷磷磷酸酸酸酸，后者经酶的作用脱去磷酸便形成目的产物后者经酶的作用脱去磷酸便形成目的产物后者经酶的作用脱去磷酸便形成目的产物后者经酶的作用脱去磷酸便形成目的产物D-D-D-D-核糖。核糖。核糖。核糖。现在学习的是第23页，共70页三、三、D-D-核糖的发酵机制核糖的发酵机制n nD-D-核糖发酵是切断核糖发酵是切断HMPHMP途径，使微生物改途径，使微生物改变酶系，积累阻断反应的前体物，进行变酶系，积累阻断反应的前体物，进行代谢控制发酵的典型例子。代谢控制发酵的典型例子。现在学习的是第24页，共70页现在学习的是第25页，共70页n n由由上上面面的的代代谢谢途途径径可可以以看看出出，要要使使微微生生物物积积累累D-D-核核糖糖，必必须须选选育育丧丧失失转转酮酮酶酶活活力力的的突突变变株株，由由于于缺缺少少转转酮酮酶酶，所所以以由由转转酮酮酶酶所所催催化化的的反反应应就就会会发发生生阻阻断断，使使D-D-核核糖糖的的前前体体物物D-D-核核糖糖-5-5-磷磷酸酸大大量量积积累累，再再经经酶酶的的作作用用脱脱去去磷磷酸酸便便可可合成合成D-D-核糖。核糖。现在学习的是第26页，共70页四、四、D-D-核糖发酵的代谢控制育种核糖发酵的代谢控制育种1 1、出发菌株的选择、出发菌株的选择n n研研究究发发现现，芽芽孢孢杆杆菌菌属属（BacillusBacillus）细细菌菌转转酮酮酶酶缺缺陷突变株积累核糖具有普遍性。陷突变株积累核糖具有普遍性。n n使使使使用用用用不不不不同同同同的的的的亲亲亲亲株株株株，虽虽虽虽然然然然选选选选育育育育出出出出同同同同样样样样的的的的突突突突变变变变型型型型，但但但但产产产产物物物物的的的的种种种种类类类类也也也也会会会会有有有有所所所所差差差差异异异异。如如如如芽芽芽芽孢孢孢孢杆杆杆杆菌菌菌菌属属属属细细细细菌菌菌菌积积积积累累累累戊戊戊戊糖糖糖糖的的的的现现现现象象象象是是是是很很很很普普普普遍遍遍遍的的的的，而而而而大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌、鼠鼠鼠鼠伤伤伤伤寒寒寒寒沙沙沙沙门门门门氏氏氏氏菌菌菌菌等等等等细细细细菌菌菌菌的的的的突突突突变株不积累戊糖。变株不积累戊糖。变株不积累戊糖。变株不积累戊糖。n n因此，多采用芽孢杆菌属细菌作为出发菌株。因此，多采用芽孢杆菌属细菌作为出发菌株。因此，多采用芽孢杆菌属细菌作为出发菌株。因此，多采用芽孢杆菌属细菌作为出发菌株。现在学习的是第27页，共70页2 2、转酮酶缺陷突变株的分离、转酮酶缺陷突变株的分离分离转酮酶缺陷突变株，可采用以下遗传标记：分离转酮酶缺陷突变株，可采用以下遗传标记：分离转酮酶缺陷突变株，可采用以下遗传标记：分离转酮酶缺陷突变株，可采用以下遗传标记：选育不利用选育不利用D-D-D-D-葡萄糖酸或葡萄糖酸或葡萄糖酸或葡萄糖酸或L-L-阿拉伯糖的突变株。阿拉伯糖的突变株。阿拉伯糖的突变株。阿拉伯糖的突变株。D-D-D-D-葡葡萄萄糖糖酸酸或或L-L-L-L-阿阿阿阿拉拉拉拉伯伯伯伯糖糖糖糖必必必必须须须须通通通通过过过过HMPHMPHMPHMP途途径径进进行行代代谢谢。若若转转酮酮酶酶发发生生缺缺陷陷，菌菌体体自自然然也也就就不不能能利利用用D-D-D-D-葡葡萄糖或萄糖或L-L-阿拉伯糖。阿拉伯糖。现在学习的是第28页，共70页现在学习的是第29页，共70页选育莽草酸缺陷突变株。选育莽草酸缺陷突变株。莽莽草草酸酸是是由由HMPHMP途途径径中中的的中中间间产产物物D-D-赤赤藓藓糖糖-4-4-磷酸与磷酸与PEPPEP为前体物而合成的。为前体物而合成的。若若转转酮酮酶酶发发生生缺缺陷陷，则则D-D-赤赤藓藓糖糖-4-4-磷磷酸酸合合成成受阻，也就不会合成莽草酸。受阻，也就不会合成莽草酸。现在学习的是第30页，共70页现在学习的是第31页，共70页选选育育L-TrpL-Trp缺缺陷陷、L-TyrL-Tyr缺缺陷陷、L-PheL-Phe缺缺陷陷、CoQCoQ缺缺陷陷、维维生生素素K K缺缺陷陷或或叶叶酸酸缺缺陷陷突突变变株。株。原理同莽草酸缺陷突变株。原理同莽草酸缺陷突变株。现在学习的是第32页，共70页3 3、其它标记、其它标记n n据据报报道道，在在维维持持转转酮酮酶酶缺缺陷陷的的情情况况下下，进进一一步步诱诱变变，使使菌菌体体带带上上具具有有高高葡葡萄萄糖糖脱脱氢氢酶酶活活性性和和丧丧失失孢孢子子形形成成能能力力等等标标记记，可可使使菌菌体体的的D-D-核核糖糖积积累累量量大幅度提高。大幅度提高。n n葡葡萄萄糖糖脱脱氢氢酶酶是是芽芽孢孢杆杆菌菌属属细细菌菌的的孢孢子子所所特特有有的的酶酶，该该酶酶由由于于NADNAD、NADPNADP和和NADHNADH2 2、NADPHNADPH2 2会会发发生生分分子子型型的的变变换换，结结果果在在菌菌体体对对数数生生长长期期被被诱诱导导，导致导致D-D-核糖的大量积累。核糖的大量积累。现在学习的是第33页，共70页4 4、利用基因工程技术构建核糖工程菌株、利用基因工程技术构建核糖工程菌株n n岩岩岩岩盾盾盾盾等等等等人人人人将将将将枯枯枯枯草草草草芽芽芽芽孢孢孢孢菌菌菌菌染染染染色色色色体体体体DNADNADNADNA中中中中的的的的转转转转酮酮酮酮酶酶酶酶基基基基因因因因克克克克隆隆隆隆到到到到载载载载体体体体质质质质粒粒粒粒pUB110中中，再再将将氯氯霉霉素素酰酰基基转转移移酶酶基基因因插插入入到到转转酮酮酶酶基基因因之之中中，造造成成转转酮酮酶酶基基因因的的不不可可逆逆失失活活。经经限限制制性性内内切切酶酶酶酶切切后后得得到到线线状状重重组组质质粒粒，将将该该重重组组质质粒粒转转化化到到枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌宿宿主主中中，构构建建出出转转酮酮酶酶失失活活的的D-D-D-D-核核核核糖糖糖糖工工工工程程程程菌菌菌菌株株株株，其其其其D-D-核核核核糖糖糖糖积积积积累累累累量量量量达达达达52g/L52g/L52g/L52g/L。现在学习的是第34页，共70页n n小小林林等等人人将将葡葡萄萄糖糖脱脱氢氢酶酶基基因因克克隆隆到到穿穿梭梭载载体体质质粒粒pHY300PLK中中，然然后后转转化化到到枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌中中，构建出构建出D-D-核糖工程菌株，能积累核糖工程菌株，能积累49g/L D-49g/L D-核糖。核糖。现在学习的是第35页，共70页5 5、发酵控制、发酵控制n nD-D-D-D-核核核核糖糖糖糖的的的的发发发发酵酵酵酵培培培培养养养养基基基基的的的的碳碳碳碳源源源源可可可可以以以以使使使使用用用用葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖、D-D-D-D-甘甘甘甘露露露露糖糖糖糖、山山山山梨梨梨梨醇醇醇醇、D-D-D-D-甘甘甘甘露露露露醇醇醇醇、麦麦麦麦芽芽芽芽糖糖糖糖、乳乳乳乳糖糖糖糖、甘甘甘甘油油油油、糊糊糊糊精精精精、可溶性淀粉等。可溶性淀粉等。可溶性淀粉等。可溶性淀粉等。n n有有有有机机机机氮氮氮氮源源源源可可可可以以以以使使使使用用用用干干干干酵酵酵酵母母母母、牛牛牛牛肉肉肉肉膏膏膏膏、蛋蛋蛋蛋白白白白胨胨胨胨、玉玉玉玉米米米米浆等。浆等。浆等。浆等。n n为为为为促促促促进进进进生生生生长长长长，尚尚尚尚需需需需添添添添加加加加少少少少量量量量(NH(NH(NH(NH4 4 4 4)2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4，同同同同时时时时加加加加入入入入适适适适量量量量的的的的CaCOCaCOCaCOCaCO3 3 3 3，以便中和发酵过程中生成的，以便中和发酵过程中生成的，以便中和发酵过程中生成的，以便中和发酵过程中生成的SOSOSOSO4 4 4 42-2-2-2-。n n由由由由于于于于葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖生生生生成成成成核核核核糖糖糖糖的的的的反反反反应应应应酶酶酶酶系系系系与与与与3 3 3 3个个个个脱脱脱脱氢氢氢氢酶酶酶酶有有有有关关关关，所所所所以以以以，核核核核糖糖糖糖发发发发酵酵酵酵在在在在好好好好气气气气条条条条件件件件下下下下进进进进行行行行。一一一一般般般般要要要要求求求求pHpHpHpH中中中中性性性性，温温温温度度度度37373737左右。左右。左右。左右。现在学习的是第36页，共70页现在学习的是第37页，共70页第三节第三节 柠檬酸的发酵机制柠檬酸的发酵机制一、概述柠檬酸的应用一、概述柠檬酸的应用 柠檬酸（柠檬酸（Citric acid）又名枸橼酸，学名）又名枸橼酸，学名-羟基羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。现在学习的是第38页，共70页1)饮料与冰淇淋饮料与冰淇淋n n柠檬酸广泛用于配制各种水果型的饮料以及软饮料。n n柠檬酸本身是果汁的天然成分之一，不仅赋于饮料水果风味，而且具有增溶、缓冲、抗氧化等作用，能使饮料中的糖、香精、色素等成分交融协调，形成适宜的口味和风味；添加柠檬酸可以改善冰淇淋的口味，增加乳化稳定性，防止氧化作用。现在学习的是第39页，共70页2)果酱与酿造酒果酱与酿造酒n n柠檬酸在果酱与果冻中同样可以增进风味，并使产品抗氧化作用。由于果酱、果冻的凝胶性质需要一定范围的pH值，添加一定量的柠檬酸可以满足这一要求。n n当葡萄或其它酿酒原料成熟过度而酸度不足时，可以用柠檬酸调节，以防止所酿造的酒口味单薄。柠檬酸加到这些果汁中还有抗氧化和保护色素的作用，以保护果汁的新鲜感和防止变色。现在学习的是第40页，共70页3)腌制与罐头食品腌制与罐头食品n n各种肉类和蔬菜在腌制加工时，加入或涂上柠檬酸可以改善风味，除腥去臭，抗氧化。n n加加入入柠柠檬檬酸酸除除了了调调酸酸作作用用之之外外，还还有有螯螯合合金金属属离离子子的的作作用用，保保护护其其中中的的抗抗坏坏血血酸酸，使使之之不不被被金金属属离离子子破破坏坏。柠檬酸添加到植物油中也有类似的作用。柠檬酸添加到植物油中也有类似的作用。现在学习的是第41页，共70页4)其它其它n n在在医医药药工工业业中中，柠柠檬檬酸酸作作为为抗抗凝凝血血剂剂，可可防防止止血血液液中凝血的产生。还可用于生产柠檬酸钠作输血剂。中凝血的产生。还可用于生产柠檬酸钠作输血剂。n n在在化化学学工工业业中中，柠柠檬檬酸酸三三乙乙酯酯、三三丁丁酯酯可可作作肥肥皂皂或或香皂的添加剂，柠檬酸锌可作为微量元素肥料使用。香皂的添加剂，柠檬酸锌可作为微量元素肥料使用。n n在在洗洗涤涤剂剂工工业业中中，柠柠檬檬酸酸在在无无磷磷酸酸盐盐洗洗衣衣粉粉、液液体体洗洗涤涤剂剂等等配配方方中中使使用用，可可代代替替三三聚聚磷磷酸酸钠钠，增增强强洗洗涤涤剂剂的去污能力。的去污能力。现在学习的是第42页，共70页柠檬酸的消费领域：柠檬酸的消费领域：饮料行业占饮料行业占40404545 食品添加剂等占食品添加剂等占15152020 洗涤剂占洗涤剂占20203030 医药占医药占5 5 其它占其它占1010 2004年全球柠檬酸产量约120万吨，欧盟和美国为最大消费市场。现在学习的是第43页，共70页n n柠檬酸是目前世界上以生物化学方法生产，产量最大的有机酸；n n我国是柠檬酸的第一大生产国，估计年产约我国是柠檬酸的第一大生产国，估计年产约5050万吨；万吨；n n欧洲是柠檬酸的第二大生产地，产量约3030万吨；万吨；n n 美国柠檬酸年产量约美国柠檬酸年产量约2525万吨。万吨。现在学习的是第44页，共70页二、柠檬酸发酵机理二、柠檬酸发酵机理n n1874年首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶成固体；n n1913年首次实现利用黑曲霉发酵生成柠檬酸。现在学习的是第45页，共70页柠檬酸发酵微生物柠檬酸发酵微生物n n黑曲霉分生孢子头分生孢子头现在学习的是第46页，共70页现在学习的是第47页，共70页 柠檬酸合成途径柠檬酸合成途径磷酸烯醇式丙磷酸烯醇式丙磷酸烯醇式丙磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酮酸羧化酶酮酸羧化酶酮酸羧化酶现在学习的是第48页，共70页现在学习的是第49页，共70页现在学习的是第50页，共70页 柠檬酸柠檬酸合成的调节合成的调节 糖酵解途径的调节现在学习的是第51页，共70页现在学习的是第52页，共70页现在学习的是第53页，共70页柠檬酸的积累机制归纳为：柠檬酸的积累机制归纳为：现在学习的是第54页，共70页现在学习的是第55页，共70页现在学习的是第56页，共70页三、高产柠檬酸菌株的特征三、高产柠檬酸菌株的特征黑曲霉主要特征有：黑曲霉主要特征有：n n在在葡葡萄萄糖糖为为唯唯一一碳碳源源的的培培养养基基上上生生长长不不太太好好，形形成成的菌落较小，形成孢子的能力也较弱；的菌落较小，形成孢子的能力也较弱；n n能能耐耐受受高高浓浓度度的的葡葡萄萄糖糖并并产产生生大大量量酸酸性性淀淀粉粉酶酶和和糖糖化化酶，即使在低酶，即使在低pH下两种酶仍具有大部分活力；下两种酶仍具有大部分活力；n n能耐高浓度柠檬酸，但不能利用和分解柠檬酸；能耐高浓度柠檬酸，但不能利用和分解柠檬酸；现在学习的是第57页，共70页n n能能抗抗微微量量金金属属离离子子，特特别别是是抗抗Mn2+、ZnZn2+2+、Cu2+2+和和Fe2+2+等金属离子；n n在摇瓶和深层液体培养时能产生大量细小的菌丝球；n n具具有有旁旁系系呼呼吸吸链链活活性性，利利用用葡葡萄萄糖糖时时不不产产生生或或少少产产生生ATPATP。现在学习的是第58页，共70页现在学习的是第59页，共70页四、柠檬酸发酵的代谢控制育种四、柠檬酸发酵的代谢控制育种1、出发菌株的选择n n产产生生柠柠檬檬酸酸的的微微生生物物很很多多，工工业业生生产产上上应应用用的的，以以糖糖或或淀淀粉粉质质原原料料直直接接发发酵酵的的主主要要是是曲曲霉霉属属，有有黑黑曲曲霉霉、泡泡盛盛酒酒曲曲霉霉、温温氏氏曲曲霉霉、米米曲曲霉霉、灰灰绿绿曲曲霉霉、金金黄黄曲曲霉霉等等，特特别别是是黑黑曲曲霉霉，在在工工业业生生产产上上产产酸酸已已达达20%20%以上，对糖的转化率可达以上，对糖的转化率可达90%90%以上。n n在在石石油油原原料料发发酵酵中中主主要要使使用用酵酵母母菌菌，特特别别是是解解脂脂假假丝丝酵母。酵母。现在学习的是第60页，共70页2、选择透明圈大的突变株、选择透明圈大的突变株n n培培养养基基（10%甘薯粉，2%琼琼脂脂）中中加加入入0.5%CaCO30.5%CaCO3，制成平板。，制成平板。n n黑黑曲曲霉霉诱诱变变后后在在平平板板上上培培养养，柠柠檬檬酸酸产产量量高高的的就就会会在在平板上形成较大的透明圈。平板上形成较大的透明圈。现在学习的是第61页，共70页现在学习的是第62页，共70页3、选择显色圈大的突变株、选择显色圈大的突变株n n在麦芽汁培养基中加入在麦芽汁培养基中加入pHpH指示剂，如0.1%溴酚蓝，溴酚蓝，将黑曲霉诱变后于将黑曲霉诱变后于3333在该培养基中培养在该培养基中培养3 3天，柠檬酸产量越高，显色圈的直径就越大。现在学习的是第63页，共70页4、选育耐高渗透压的突变株、选育耐高渗透压的突变株n n高产柠檬酸菌株，在高糖、高柠檬酸培养基中仍称保持正常生长，并具有代谢能力。n n选育在16-25%甘薯粉的平板上生长良好的突变株；n n选育在含10-20%柠檬酸培养基（10%甘薯粉，2%琼脂）上生长良好的突变株。现在学习的是第64页，共70页5、选育不分解利用柠檬酸的突变株、选育不分解利用柠檬酸的突变株n n选育在以柠檬酸为唯一碳源的培养基上菌体不生长或生长较弱的突变株；n n选育乌头酸酶活性低的突变株。现在学习的是第65页，共70页6、选育形态突变株、选育形态突变株n n黑曲霉形态突变与柠檬酸产量之间有一定的关系。黑曲霉形态突变与柠檬酸产量之间有一定的关系。n n选选育育菌菌落落直直径径约约为为正正常常型型菌菌落落直直径径1/3以下的S型型小小菌菌落，菌落凸起，孢子着生稀疏；落，菌落凸起，孢子着生稀疏；n n选菌丝、孢子颜色较浅的突变株；n n选孢子紧密而细小的突变株；选孢子紧密而细小的突变株；n n选选在在葡葡萄萄糖糖合合成成培培养养基基中中孢孢子子不不长长、迟迟长长或或少少长长的的突变株。突变株。现在学习的是第66页，共70页7、选育单氟乙酸、三氟乙酸或、选育单氟乙酸、三氟乙酸或2,4-二硝基酚二硝基酚敏感突变株敏感突变株n n单氟乙酸在体内可转化成单氟柠檬酸，其对乌头酸酶产生竞争性抑制。如菌体对单氟乙酸敏感，说明该突变株的乌头酸酶活力低下或乌头酸酶含量少。因此选育单氟乙酸敏感突变株，有助于柠檬酸的高产。现在学习的是第67页，共70页n n选育氟丙酮酸敏感突变株选育氟丙酮酸敏感突变株 该突变株体内丙酮酸向乙酰该突变株体内丙酮酸向乙酰CoACoA的反应弱，的反应弱，COCO2 2固定固定反应所占的比例相对较大。反应所占的比例相对较大。n n选育丙氨酸缺陷或渗漏突变株选育丙氨酸缺陷或渗漏突变株n n选育丙氨酸温度敏感型突变株选育丙氨酸温度敏感型突变株n n选育天冬氨酸缺陷或渗漏突变株选育天冬氨酸缺陷或渗漏突变株n n加大生物素用量，激活丙酮酸羧化酶加大生物素用量，激活丙酮酸羧化酶n n将将PEEPEE基因或丙酮酸羧化酶基因克隆到高拷贝载体质粒上，基因或丙酮酸羧化酶基因克隆到高拷贝载体质粒上，使之扩增。使之扩增。8、选育强化、选育强化CO2固定反应的突变株固定反应的突变株现在学习的是第68页，共70页 9、选育某些氨基酸缺陷突变株或抗药性突、选育某些氨基酸缺陷突变株或抗药性突变株变株现在学习的是第69页，共70页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第70页，共70页