WesternBlot详解及问题分析.pptx
qqWestern BlotWestern Blot 简介简介qqWestern BlotWestern Blot 一般流程一般流程qqWestern BlotWestern Blot 常见问题分析常见问题分析第1页/共42页Western Blot 简介：简介：印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。第2页/共42页Western Blot 基本原理第3页/共42页Western Blot 优点p 高分辨率的电泳技术高分辨率的电泳技术p 特异敏感的抗原特异敏感的抗原-抗体反应抗体反应p 1-5ng1-5ng中等大小的靶蛋白中等大小的靶蛋白第4页/共42页Western BlotWestern Blot应用应用q目的蛋白的表达特性分析q目的蛋白与其它蛋白的互作q目的蛋白的组织定位q目的蛋白的表达量分析第5页/共42页Western Blot Western Blot 流程流程l蛋白样品的制备SDS-PAGE转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色第6页/共42页?通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂蛋白质最常用的溶剂 。有机溶剂提取法有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。?通过层析或电洗脱法制备目的蛋白通过层析或电洗脱法制备目的蛋白通过层析或电洗脱法制备目的蛋白通过层析或电洗脱法制备目的蛋白蛋白样品的提取蛋白样品的提取第7页/共42页蛋白样品的定量目前常用比色法测定样品蛋白的含量：目前常用比色法测定样品蛋白的含量：目前常用比色法测定样品蛋白的含量：目前常用比色法测定样品蛋白的含量：BradfordBradford法（考马斯亮蓝法）、法（考马斯亮蓝法）、法（考马斯亮蓝法）、法（考马斯亮蓝法）、LowryLowry法（法（法（法（Folin-Folin-酚试剂法）酚试剂法）酚试剂法）酚试剂法）、BCABCA法等。但各有优缺点，大家可以根据具体法等。但各有优缺点，大家可以根据具体法等。但各有优缺点，大家可以根据具体法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。作，测定样品浓度。作，测定样品浓度。作，测定样品浓度。蛋白质浓度测定的各种方法汇总：蛋白质浓度测定的各种方法汇总：第8页/共42页蛋白样品的变性2SDS-PAGE上样缓冲液：DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20冻存。按1:1比例与蛋白质样品混合，95100加热515min，冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25l，总蛋白量2050g。1M Tris-HCl(pH6.8)10 ml1M DTT20 mlSDS4 g甘油甘油20 ml溴酚蓝溴酚蓝0.2 g总体积总体积100ml100mM Tris-HCl(pH6.8)200mM DTT4%SDS0.2%溴酚兰20%甘油ddH2O第9页/共42页SDS：阴离子去污剂阴离子去污剂 变性剂变性剂氨基酸侧链与氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。胶束。蛋白质蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。同分子之间原有的电荷差异。与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。子线性化。第10页/共42页蛋白质蛋白质-SDS-SDS胶束的特点：胶束的特点：（1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒（2）平均1g 蛋白质结合1.4g SDS（3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的（4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比第11页/共42页q不连续的电泳缓冲体系。qSDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳第12页/共42页pSDS-PAGESDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入是在蛋白质样品中加入SDSSDS和含有巯基乙醇和含有巯基乙醇的样品处理液，的样品处理液，SDSSDSSDSSDS是一种很强的是一种很强的阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂，它可以它可以断开分子内和分子间的氢键断开分子内和分子间的氢键断开分子内和分子间的氢键断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。的二级和三级结构。p强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTTDTT）可以可以断开二断开二硫键破坏蛋白质的四级结构硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDSSDS充分结合形成充分结合形成带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质-SDS-SDS复合物。复合物。p蛋白质分子结合蛋白质分子结合SDSSDS阴离子后，所带负电荷的量远远超阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。【SDS-PAGESDS-PAGE基本原理】基本原理】第13页/共42页凝胶成凝胶成分分M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 MSDSM配胶的Tris缓冲液MTEMEDM过硫酸铵MTris-甘氨酸电泳缓冲液第14页/共42页PAGEPAGE：聚丙烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)N,N-亚甲基双丙烯酰胺(N,N-methylenebisacylamide，简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。第15页/共42页聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：单体：丙烯酰胺（Acr）；交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）；催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）；加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）；产物：三维网状结构凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals)的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来完成的。催化体系主要有化学催化（APTEMED）和光化学催化（核黄素TMTED）体系。第16页/共42页凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212SDS-PAGE浓缩胶(5%Acrylamide)及分离胶配方表：第17页/共42页不连续电泳：不连续电泳：作用作用缓冲液缓冲液PHPH凝胶浓度凝胶浓度浓缩胶浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8Tris-Cl低，2-5%分离胶分离胶使蛋白样品分离pH8.8Tris-Cl高，根据蛋白大小电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。第18页/共42页灌制分离胶灌制分离胶 隔绝空气隔绝空气ddH2O0.1%SDS:8%第19页/共42页灌制积层胶 插入梳子 第20页/共42页Staking gelSeparating gel第21页/共42页转膜要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。第22页/共42页转移膜的选择最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride,PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。各种膜的详细特点介绍：第23页/共42页湿转系统第24页/共42页半干转移系统第25页/共42页丽春红染色丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。转膜后检测（此步可以省略）转膜后检测（此步可以省略）第26页/共42页封闭封闭S为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。S5%5%脱脂奶粉或脱脂奶粉或BSABSA（室温孵育（室温孵育1h1h）SWestern Blot Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司）膜封闭液（生物试剂公司）STween-20Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。影响抗体与抗原的结合。第27页/共42页一抗、二抗孵育把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。第28页/共42页二抗与底物反应显色辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）化学发光显色法(HRP)第29页/共42页膜解吸方法（膜的重复利用）通过加热和去污剂进行解吸 原理：组合使用去污剂和加热使抗体解离，适用于任何化学发光底物系统。酸解吸 原理：使用低pH改变抗体结构从而使结合位点失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任何化学发光底物系统。第30页/共42页Western Blot结果分析目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。Western Blot结果分析软件Gel-Pro Analyzer 4 绿色版（附动画演示教程）第31页/共42页Western Blot常见问题分析第32页/共42页SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳uu胶不平？胶不平？uu凝胶漏液？凝胶漏液？胶板洗刷干净胶板洗刷干净加入加入APAP和和TEMEDTEMED的量要合适的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐第33页/共42页uu条带比正常的窄？条带比正常的窄？uu“微笑微笑”或或“倒微笑倒微笑”条带？条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适气泡。同时注意电泳槽装置是否合适SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳第34页/共42页转膜及抗体检测转膜及抗体检测uu凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？uu条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？uu单个或多个白点？单个或多个白点？uu转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡泡5-10min5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸上少许普通的草纸确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温转膜过程注意降温第35页/共42页转移到膜上的蛋白很少蛋白分子量 10KD蛋白的等电点 9SDS浓度不合适凝胶太厚 原因对策蛋白分子量10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜更换高pH值Buffer在阴极buffer中加入0.005-0.01%SDS 可提高转膜效率延长转膜时间第36页/共42页膜没有均匀浸湿膜或者缓冲液污染封闭不充分抗体与封闭剂出现交叉反应抗体浓度过高 原因对策转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应杂交前检测一抗、二抗的工作浓度背景太高第37页/共42页杂交信号很弱抗体保存不当抗原不充足膜的漂洗过度 原因对策抗体长期保存应在70，使用前做效价检测增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照减少漂洗的时间和次数第38页/共42页一抗不是唯一特异的二抗出现非特异结合 原因对策制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合出现非特异带第39页/共42页Further Readings生物秀Western Blotting专题 Millipore的蛋白印迹手册 Bio-Rad的western Blotting操作手册 Western blot问题解答专帖第40页/共42页谢谢大家！谢谢大家！第41页/共42页感谢您的观看！第42页/共42页
