第五章亲和层析分离技术.ppt

第五章亲和层析分离技术现在学习的是第1页，共45页亲和层析技术5.1 简介5.2 亲和层析理论5.3 亲和层析介质活化5.4 常见底亲和层析技术现在学习的是第2页，共45页 利用生物大分子之间的专一性识别性或特定的相互作用的利用生物大分子之间的专一性识别性或特定的相互作用的分离技术称为亲和层析分离技术分离技术称为亲和层析分离技术5.1 简介简介现在学习的是第3页，共45页简介亲和配基 单专一性的小分子配基 基团专一性小分子亲和配基 专一性的大分子亲和配基 免疫亲和配基 基因专一性的大分子亲和配基现在学习的是第4页，共45页参数生物专一性（AC）拟生物专一性配基亲和层析IMACDLACHLAC专一性很高很高较高较高中等中等较高，较高，取决于吸附条件取决于吸附条件配基交联技术很多很多环氧化物环氧化物直接吸附或直接吸附或对氧化物对氧化物解吸难易中等中等容易容易化学化学交联容易交联容易容易容易吸附容量低，低，0.1-1.0%配配基利用基利用高高高高中等中等再生及稳定性较差，易变性较差，易变性高高高高高，可用浓或处理高，可用浓或处理成本高高较低较低最低最低较低较低不同亲和层析分离方法的比较现在学习的是第5页，共45页简介亲和洗脱 亲亲和和洗洗脱脱是是和和亲亲和和吸吸附附（Affinity Adsorption）对对应应的的，即即利利用用在在洗洗脱脱液液中中加加入入和和吸吸附附目目标标蛋蛋白白有有专专一一性性的的物物质质，而而只只将将目目标标分分子子解解吸吸下下来来。亲亲和和洗洗脱脱可可用用于于亲亲和和层层吸吸，也也可可以以用用于于普普通通的的层层析析如如离离子子交交换换等等的的解解吸吸。亲亲和和洗洗脱脱一一般般采采用用和和目目标标分分子具有识别性的小分子或类似物。子具有识别性的小分子或类似物。现在学习的是第6页，共45页亲和层析分离技术 亲和层析的理论亲和层析的理论 亲和介质的制备亲和介质的制备 常见的亲和层析常见的亲和层析现在学习的是第7页，共45页5.2 亲和层析的理论亲和层析的理论当蛋白质在非凝胶相和凝胶相之间达到平衡现在学习的是第8页，共45页亲和层析的理论对正常的凝胶过滤色谱而言亲和色谱中，固定配基在蛋白和凝胶之间产生的额外亲和作用现在学习的是第9页，共45页亲和层析的理论现在学习的是第10页，共45页 实实际际上上，Ve/VeVe/Ve很很难难测测定定，但但在在洗洗脱脱液液中中，加加入入可可活活性性配配基基或或竞竞争争性性抑抑制制剂剂，使使固固定定配配基基的的表表边边的亲和力降低，其数值可以测得的亲和力降低，其数值可以测得 亲和层析的理论现在学习的是第11页，共45页推导得到 在在可可溶溶性性亲亲和和竞竞争争性性配配基基的的存存在在下下，固固定定配配基基对对酶酶的的阻阻滞滞作作用用降降低低，其其程程度度取取决决于于可可溶溶性性配配基和固定配基的相对浓度和解离常数。基和固定配基的相对浓度和解离常数。亲和层析的理论现在学习的是第12页，共45页5.3 亲和介质的制备亲和介质的制备 介质的选择介质的选择 介质的活化和偶联介质的活化和偶联 亲和配基固定偶联的密度的测定亲和配基固定偶联的密度的测定 间臂分子的选择间臂分子的选择现在学习的是第13页，共45页介质的选择通常而言，亲和色谱的介质应具备下面四个条件：具有多孔网络结构具有多孔网络结构 非特异吸附小，基质化学性质应是惰性，表面非特异吸附小，基质化学性质应是惰性，表面 电荷尽可能低；电荷尽可能低；理化性质稳定，不因共价偶联反应的条件及吸理化性质稳定，不因共价偶联反应的条件及吸 附条件的变化而发生变化；附条件的变化而发生变化；基质必须能够活化或功能化基质必须能够活化或功能化介质是亲和配基附着的基础，起着支撑和骨架作用现在学习的是第14页，共45页介质的选择 多糖类：纤维素纤维素（cellulose）、）、葡聚糖葡聚糖（dextrin）琼脂糖琼脂糖（agarose）聚丙烯酰胺 无机基质 可控制孔径多孔玻璃可控制孔径多孔玻璃（CPG）、）、陶瓷和硅胶陶瓷和硅胶现在学习的是第15页，共45页介质的选择 用用于于分分析析时时，专专一一性性比比容容量量及及稳稳定定性性重重要要，而而应应用用制制备备时时，吸吸附附剂剂的的稳稳定定性性是是最最主主要要的的指指标标，同同时时还还要要考考虑虑成成本本因因素素。对对于于不不同同的的介介质质而而言言，这这些些要要求求不不可可能能同同时时满满足足。所所以以在在介介质的选取时，应该根据具体的分离要求选择合适的介质。质的选取时，应该根据具体的分离要求选择合适的介质。专一性（Specifcity）、）、容量（capacity）及稳定性（stability）是衡量所选介质好坏的三个标准现在学习的是第16页，共45页介质的活化和偶联介质的活化和偶联多糖基质 溴化氰法，三嗪法溴化氰法，三嗪法 高碘酸盐法高碘酸盐法 环氧化物法环氧化物法 苯醌法苯醌法 其他活化剂其他活化剂聚丙烯酰胺基质 戊二醛法戊二醛法 肼法肼法多孔玻璃与硅胶现在学习的是第17页，共45页溴化氰法 多糖基质现在学习的是第18页，共45页三嗪法 多糖基质现在学习的是第19页，共45页高碘酸盐法 多糖基质现在学习的是第20页，共45页环氧化物法 多糖基质现在学习的是第21页，共45页苯醌法多糖基质现在学习的是第22页，共45页其他方法甲苯磺酰氯 多糖基质现在学习的是第23页，共45页戊二醛法 聚丙烯酰胺基质现在学习的是第24页，共45页聚丙烯酰胺基质肼法现在学习的是第25页，共45页多孔玻璃与硅胶现在学习的是第26页，共45页亲和配基固定偶联的密度的测定p 分光光度法p 重量差法分析p 水解作用分析p 元素分析法现在学习的是第27页，共45页间臂分子的选择 由由于于生生物物大大分分子子的的空空间间结结构构及及层层析析介介质质本本身身孔孔结结构构的的因因素素，往往往往在在配配基基和和基基质质骨骨架架之之间间引引入入一一个个间间臂臂分分子子，可可显著地提高配基的空间利用度，即提高吸附容量。显著地提高配基的空间利用度，即提高吸附容量。间臂分子的引入时要考虑两个因素：空间位阻，空间位阻，疏水作用疏水作用现在学习的是第28页，共45页5.4 常见的亲和层析常见的亲和层析p 核苷酸及辅酶和层析 p 固定化金属离子亲和层析 p 染料亲和层析 p 免疫亲和层析 p 基团专一性大分子亲和层析p 共价色谱现在学习的是第29页，共45页常见的核苷酸及辅酶亲和层析介质 配基分类配基生产公司典型应用腺苷腺苷腺苷3，5环化单磷酸环化单磷酸（CAMP）PL Biochemical SIGMA腺苷激酶及脱氨酸腺苷激酶及脱氨酸腺苷腺苷3，5二磷酸（二磷酸（3，5ADP）PL Biochemical SIGMA Pharmcia依赖辅酶依赖辅酶A的酶的酶腺苷腺苷5单磷酸单磷酸（AMP）PL Biochemical磷酸化酶磷酸化酶腺苷腺苷5三磷酸（三磷酸（AIP）PL Biochemical激酶激酶辅酶辅酶辅酶A（CoA）PL Biochemical CoA转移酶，转移酶，乙酸乙酸-CoA酶酶氧化型辅酶氧化型辅酶I（NAD）PL BiochemicalSIGMA5-核苷酸酶核苷酸酶氧化型辅酶氧化型辅酶（NADP）PL Biochemical核酸酶核酸酶核苷酸鸟苷鸟苷-5-三磷酸三磷酸SIGMA谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶5.4.1 核苷酸及辅酶亲和层析现在学习的是第30页，共45页N6（6-氨己基）氨甲酰-AMP-Sepharose间接偶联法示意图 核苷酸及辅酶亲和层析现在学习的是第31页，共45页核苷酸及辅酶亲和层析 核苷酸亲和层析的合成 碳二亚胺直接法偶联碳二亚胺直接法偶联 间接偶联法间接偶联法 核苷酸亲和层析的吸附和解吸现在学习的是第32页，共45页5.4.2 固定化金属离子亲和层析p 螯和基团和金属离子的选择 p 亲和层析介质的合成 p 固定化金属离子亲和层析的 吸附和解吸条件现在学习的是第33页，共45页5.4.3 染料亲和层析 染料亲和层析介质的制备 蛋白质的吸附和解吸现在学习的是第34页，共45页染料亲和层析Cibacron Blue F3G-A 结构图结构图 现在学习的是第35页，共45页其中其中R R为为:染料亲和层析Procion Red H-E3B 结构图结构图现在学习的是第36页，共45页染料配基和蛋白质作用大小排列染料配基和蛋白质作用大小排列 第一组第二组第三组第四组第五组Procion Blue MX-7RXCibacron Blue 2-RAProcion Yellow MX-6GRemazol Organe 3RCibacron Brown 3-GRAProcion Red MX-4RProcion Yellow MX-4RRemazol Organe RCibacron Blue F3-GAProcion Red H-E3GRemazol Blue RProcion Yellow H-E6RProcion Blue MXGProcion Organge MX-2RProcion Red MX-7BProcion blue H-ERDProcion Green H-E4BDProcion Red H-3B染料亲和层析现在学习的是第37页，共45页5.4.4 免疫亲和层析 免疫亲和层析介质的制备 免疫亲和层析的吸附和解吸现在学习的是第38页，共45页比较项目单抗多抗设备需求多多简单简单手工时间多多少少抗体数量大大中等中等提供的持久性长期长期短短抗体质量高高低低亲和专一性可高可低可高可低多数专一性高多数专一性高免疫亲和层析单抗和多抗的比较单抗和多抗的比较现在学习的是第39页，共45页5.4.5 基团专一性大分子亲和层析 Protein A 亲和层析 Ig G抗体 解吸：1M acetate buffer 0.1 M glyceicine HCl buffer Con A 亲和层析 糖蛋白：免疫球蛋白，IgM 低密度酯蛋白 肝素亲和层析现在学习的是第40页，共45页原理原理（a）吸附过程；（吸附过程；（b）洗脱过程；（洗脱过程；（c）再生过程再生过程 5.4.6 共价色谱现在学习的是第41页，共45页引入硫醇基引入硫醇基引入双硫键引入双硫键 共价介质的合成共价介质的合成现在学习的是第42页，共45页共价色谱的吸附和解吸共价色谱的吸附和解吸1、上样预处理2、吸附 吸附时间较长，柱子长度 检测3、解吸 1025 mM DTT（二硫苏糖醇），2550mM 2巯基乙醇，半胱氨酸现在学习的是第43页，共45页层析操作应用举例层析操作应用举例 从从Jack Bean中分离尿素酶中分离尿素酶Urease 木瓜蛋白酶的分离纯化木瓜蛋白酶的分离纯化 POI和和GIT（protein disulphide isomerose）和和 （glutathiose insulm tramchydrogerac）的分离的分离现在学习的是第44页，共45页现在学习的是第45页，共45页