食品发酵菌种的选育与保藏.pptx

食品发酵菌种的选育与保藏食品发酵菌种的选育与保藏现在学习的是第1页，共69页l课时安排：4课时l教学目标：了解发酵工业中常用的菌种。掌握菌种选育方法。掌握划线培养和涂布培养方法。掌握菌种保藏方法。教学重点：菌种选育方法。菌种保藏方法。教学难点：菌种选育方法。授课方式：多媒体教学、讲授法现在学习的是第2页，共69页发酵工业常用微生物及要求发酵工业常用微生物及要求一、常见微生物一、常见微生物 （一）细菌（一）细菌（bacteriabacteria）醋杆菌属（醋杆菌属（AcetobacterAcetobacter）乳杆菌属（乳杆菌属（LactobacillusLactobacillus）芽孢杆菌属（芽孢杆菌属（BacillusBacillus）短杆菌属（短杆菌属（BrevibacteriumBrevibacterium）棒杆菌属（棒杆菌属（CorynebacteriumCorynebacterium）现在学习的是第3页，共69页（二）放线菌（二）放线菌（actinomycesactinomyces）最大的经济价值在于产生多种抗生素最大的经济价值在于产生多种抗生素（antibioticantibiotic）链霉菌（链霉菌（StreptomycesStreptomyces）小单孢菌属（小单孢菌属（MicromonosporaMicromonospora）现在学习的是第4页，共69页 （三）霉菌（三）霉菌（mouldmould）1.1.曲霉属（曲霉属（AspergillusAspergillus）黑曲霉（黑曲霉（A.nigerA.niger）米曲霉（米曲霉（A.oryzaeA.oryzae）黄曲霉（黄曲霉（A.flavusA.flavus）2.2.青霉属（青霉属（PenicillumPenicillum）桔青霉（桔青霉（P.citrinumP.citrinum）产生产生5 5磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。现在学习的是第5页，共69页3.3.根霉属（根霉属（RhizopusRhizopus ）米根霉（米根霉（R.oryzaeR.oryzae）华根霉（华根霉（R.chinensisR.chinensis）4.4.红曲霉属（红曲霉属（MonascusMonascus）现在学习的是第6页，共69页（四）酵母（四）酵母（yeastyeast）1.1.酵母属（酵母属（SaccharomycesSaccharomyces）啤酒酵母（啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae）2.2.假丝酵母属（假丝酵母属（CandidaCandida）产朊假丝酵母（产朊假丝酵母（Candida utilisCandida utilis）3.3.毕赤酵母属（毕赤酵母属（PichiaPichia）现在学习的是第7页，共69页（五）其它微生物（五）其它微生物1.1.担子菌（担子菌（basidiomycetesbasidiomycetes）即菇类）即菇类（mushroommushroom）2.2.藻类（藻类（algaalga）现在学习的是第8页，共69页几几种种菌菌落落现在学习的是第9页，共69页 （六）噬菌体（六）噬菌体（phagephage）危害以细菌和放线菌为危害以细菌和放线菌为生产菌株的发酵工业。生产菌株的发酵工业。现在学习的是第10页，共69页烈性噬菌体烈性噬菌体 引起寄主细胞迅速裂解。引起寄主细胞迅速裂解。受感染的细菌称受感染的细菌称敏感性细菌敏感性细菌。温和噬菌体温和噬菌体 随寄主细胞的繁殖而繁殖。随寄主细胞的繁殖而繁殖。含温和噬菌体的细菌称含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌溶原性细菌。现在学习的是第11页，共69页吸附吸附注入核酸注入核酸合成核酸和蛋白质合成核酸和蛋白质释放释放装配装配现在学习的是第12页，共69页 二、微生物工业对菌种的要求二、微生物工业对菌种的要求1.1.原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。2.2.易控制培养条件，发酵周期较短。易控制培养条件，发酵周期较短。3.3.抗杂菌和噬菌体的能力强。抗杂菌和噬菌体的能力强。4.4.不易变异和退化，不产生任何有害物质和不易变异和退化，不产生任何有害物质和 毒素。毒素。现在学习的是第13页，共69页 第二节第二节 工业微生物菌种的选育工业微生物菌种的选育一、自然选育一、自然选育 1.1.采样采样 2.2.增殖培养增殖培养 方法：方法：（1 1）控制培养基成分）控制培养基成分 （2 2）控制培养条件）控制培养条件 （3 3）抑制不需要的菌类）抑制不需要的菌类现在学习的是第14页，共69页3.3.纯种分离纯种分离（1 1）划线法：简单、快捷。）划线法：简单、快捷。（2 2）稀释法：菌落单一均匀。）稀释法：菌落单一均匀。现在学习的是第15页，共69页生产菌种斜面生产菌种斜面制备单孢子悬浮液制备单孢子悬浮液分离出单菌落分离出单菌落1.2自然选育流程图自然选育流程图为何进行复筛？为何进行复筛？生产菌种斜面生产菌种斜面制备单孢子悬浮液制备单孢子悬浮液分离出单菌落分离出单菌落移种进一步选育或保藏进一步选育或保藏斜面种子斜面种子(初筛初筛)高产菌株高产菌株沙土管菌株沙土管菌株斜面种子斜面种子摇瓶复筛摇瓶复筛高产纯化株高产纯化株生产试验生产试验生产菌种斜面生产菌种斜面制备单孢子悬浮液制备单孢子悬浮液分离出单菌落分离出单菌落自然选育是一种纯种选育的方法现在学习的是第16页，共69页接种针先以火焰灭菌法灭菌接种针先以火焰灭菌法灭菌 步骤一步骤一固体培养基四区划法接种法固体培养基四区划法接种法现在学习的是第17页，共69页轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却 步骤二步骤二现在学习的是第18页，共69页以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。步骤三步骤三现在学习的是第19页，共69页更换一个新的无菌营养平板更换一个新的无菌营养平板 步骤四步骤四现在学习的是第20页，共69页将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区为第一菌区 。现在学习的是第21页，共69页重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。然后轻触琼脂无菌处冷却。步骤六步骤六现在学习的是第22页，共69页由第五步骤的第一区中划出第二区，由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上图。如右上图。步骤七步骤七现在学习的是第23页，共69页重复第六以及第七步骤，由第七步骤的重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二区中划出第三区，如右上图。第二区中划出第三区，如右上图。步骤八步骤八现在学习的是第24页，共69页重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营养平板，如右上图。的营养平板，如右上图。步骤九步骤九现在学习的是第25页，共69页 在营养平板上贴好标签，在营养平板上贴好标签，标示好接种日期、操作者姓名、标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及培养基名称。菌种学名以及培养基名称。步骤十步骤十现在学习的是第26页，共69页需要使用的仪器需要使用的仪器震荡机震荡机 固体培养基的稀释涂抹接种法固体培养基的稀释涂抹接种法现在学习的是第27页，共69页吸取准备好欲稀释的菌液吸取准备好欲稀释的菌液现在学习的是第28页，共69页吸取充分均匀后的菌液吸取充分均匀后的菌液 现在学习的是第29页，共69页取含有取含有 9mL9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。无菌水之试管，将试管口过火灭菌。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。现在学习的是第30页，共69页将将试试管管于于震震荡荡机机上上，使使菌菌液液混混合合均均匀匀 现在学习的是第31页，共69页取出试管中的第一次十倍稀释菌液取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL1mL，加入另一个新的含加入另一个新的含9mL9mL无菌水的试管中。无菌水的试管中。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。现在学习的是第32页，共69页从最后稀释菌液中吸取从最后稀释菌液中吸取 0.1mL0.1mL菌液，置入菌液，置入准备好的无菌琼脂内。准备好的无菌琼脂内。现在学习的是第33页，共69页将三角玻璃棒浸于酒精中将三角玻璃棒浸于酒精中 现在学习的是第34页，共69页 将三角玻璃棒在火焰上燃烧将三角玻璃棒在火焰上燃烧（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）现在学习的是第35页，共69页 使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于恒使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍数推算出温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍数推算出菌液浓度。菌液浓度。现在学习的是第36页，共69页现在学习的是第37页，共69页4.4.生产性能的测定生产性能的测定 一般采用两步法：一般采用两步法：初筛：以量为主初筛：以量为主 复筛：以质为主复筛：以质为主现在学习的是第38页，共69页 二、诱变育种二、诱变育种 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变。用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。诱变剂诱变剂物理：紫外线，快中子物理：紫外线，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍现在学习的是第39页，共69页 诱变育种的主要环节诱变育种的主要环节（1 1）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液 诱变诱变（2 2）用合适的方法淘汰负效应变异株，）用合适的方法淘汰负效应变异株，选出性能优良的正变异株选出性能优良的正变异株筛选筛选现在学习的是第40页，共69页现在学习的是第41页，共69页2.3.1诱变剂的种类诱变剂的种类 物理诱变剂 射线如紫外线、X-射线、-射线，快中子 化学诱变剂 碱基类似物、5-氟尿嘧啶、烷化剂、亚硝基胍和甲基磺酸乙酯等。化学诱变剂，比物理诱变剂电离辐射有效，而且很经济，但大部分诱变剂是致癌剂，危害性大。现在学习的是第42页，共69页l物理诱变剂紫外线紫外线、X-X-射线射线、-射线射线、快中子快中子特点：紫外线方便、有效、使用安全，其他的几种射线有一定的穿透力l化学诱变剂碱基类似物、吖啶类、烷化剂特点：高效、经济、但应注意使用安全现在学习的是第43页，共69页2.3.2 诱变处理的基本方法A.诱变剂的选择不稳定菌株温和诱变剂不稳定菌株温和诱变剂 稳定菌株强烈的、广谱的诱变剂稳定菌株强烈的、广谱的诱变剂 低剂量诱变剂有利于高产菌株的稳定性低剂量诱变剂有利于高产菌株的稳定性B.B.诱变剂剂量的选择剂量的表示方法：常用杀菌率表示诱变剂的剂量。杀菌率=（mn）/m 100 m：未被处理菌体长出的菌落数 n：被处理菌体长出的菌落数 现在学习的是第44页，共69页 使用剂量：一般剂量一般剂量诱变率诱变率，但达到一定剂量后，但达到一定剂量后剂量剂量诱变率诱变率。一般使用一般使用90-9990-999 9以上细胞死亡的剂量。而近来则倾向于采用杀菌率为70-8070-80的剂量，特别是经过一再诱变的高产菌株。在生产实践或科研中，要确定某个诱变剂的合适剂量，是通过多次试验后才决定的，而且更换诱变剂或处理不同的菌株，也还要重新进行试验。C.增效（变）剂有一些因素本身并不是诱变剂，但它们与诱变剂配合使用起到协同作用。现在学习的是第45页，共69页D、影响诱变效果的因素外部环境条件对诱变效果的影响，如温度、氧气、PH、水分等出发菌株的选择对提高诱变效果具有重要作用。选择合适的诱变因素剂量也是提高诱变效果的重要条件。出发菌株的生理状态也影响诱变效率。诱变效应的测定，可分为直接法和浓缩法两种。诱变方法优良突变菌株的筛选直接摇瓶筛选法和琼脂柱预筛选法现在学习的是第46页，共69页筛选：将分离培养后的各型单菌落接斜面培养，成熟后接入摇瓶，测定其发酵生产能力的过程。初筛：以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛：则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。现在学习的是第47页，共69页突变株的筛选（Selection）I.随机筛选(Randomselection)1)摇瓶筛选法 初筛一般是一个菌株只做一初筛一般是一个菌株只做一个摇瓶，从大量菌株中选出个摇瓶，从大量菌株中选出10-20%10-20%较好的菌株，淘较好的菌株，淘汰汰80-90%80-90%的菌株；而复筛的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个菌株中摇瓶培养一般是一个菌株培养培养3 3瓶，并要重复瓶，并要重复3-53-5次，次，选出选出3-53-5个较好的菌株，再个较好的菌株，再做进一步比较，选出最佳的做进一步比较，选出最佳的菌株。菌株。复杂、耗时现在学习的是第48页，共69页2)琼脂块筛选法 简单、快速，但不准确3)自动化筛选（筛选几千个菌落数/天）现在学习的是第49页，共69页 3 3 杂交育种杂交育种 杂交育种：是指将两个基因型不同的菌株经接合，使遗传物质重新组合，杂交育种：是指将两个基因型不同的菌株经接合，使遗传物质重新组合，杂交育种：是指将两个基因型不同的菌株经接合，使遗传物质重新组合，杂交育种：是指将两个基因型不同的菌株经接合，使遗传物质重新组合，从而产生具有新性状的菌株。从而产生具有新性状的菌株。从而产生具有新性状的菌株。从而产生具有新性状的菌株。要求：进行结合的菌株应带有遗传标记。要求：进行结合的菌株应带有遗传标记。要求：进行结合的菌株应带有遗传标记。要求：进行结合的菌株应带有遗传标记。(一一一一)杂交育种的目的杂交育种的目的杂交育种的目的杂交育种的目的 1 1 1 1、使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的、使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的、使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的、使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的遗传物；遗传物；遗传物；遗传物；2 2 2 2、把不同菌株的优良性状汇集重组体菌株中，提高产量和质量，甚至、把不同菌株的优良性状汇集重组体菌株中，提高产量和质量，甚至、把不同菌株的优良性状汇集重组体菌株中，提高产量和质量，甚至、把不同菌株的优良性状汇集重组体菌株中，提高产量和质量，甚至改变菌种特性，获得新品种；改变菌种特性，获得新品种；改变菌种特性，获得新品种；改变菌种特性，获得新品种；3 3 3 3、获得的重组体可能对诱变剂的敏感度得以提高和恢复，以便重新使、获得的重组体可能对诱变剂的敏感度得以提高和恢复，以便重新使、获得的重组体可能对诱变剂的敏感度得以提高和恢复，以便重新使、获得的重组体可能对诱变剂的敏感度得以提高和恢复，以便重新使用诱变方法进行选育。用诱变方法进行选育。用诱变方法进行选育。用诱变方法进行选育。（二）杂交育种的程序（二）杂交育种的程序1 1、菌种准备：使用两种菌株，原始亲本和直接亲本菌株。、菌种准备：使用两种菌株，原始亲本和直接亲本菌株。现在学习的是第50页，共69页a a a a1 1 1 1营养缺陷型突变株的富集培养营养缺陷型突变株的富集培养方法方法1 1：抗生素富集法：抗生素富集法 方法方法2 2：过滤法：过滤法 现在学习的是第51页，共69页a a2 2营养缺陷型的检出营养缺陷型的检出营养缺陷型的检出营养缺陷型的检出 方法方法1.1.逐个检出法：逐个检出法：方法方法2.2.影印法：具体操作误差较大。影印法：具体操作误差较大。方法方法3.3.夹层法：先长出的菌落在底部作出标记，加入夹层法：先长出的菌落在底部作出标记，加入CMCM培养培养基后长出的菌落为营养缺陷型，可用打孔器取出。基后长出的菌落为营养缺陷型，可用打孔器取出。现在学习的是第52页，共69页3.3 杂交育种使用的培养基杂交育种使用的培养基完全培养基：一种含有糖类、多种氨基酸、维生素及核酸碱基等比较完全的营养基质。基本培养基：只含有纯的碳源、无机氮和无机盐类，不含有氨基酸、维生素、核苷酸等有机营养物。有限培养基：在基本培养基或蒸馏水中含有10%20%完全培养基成分。补充培养基：在基本培养基中加入已知成分的氨基酸、维生素、核苷酸等现在学习的是第53页，共69页3.4 3.4 杂交方法杂交方法杂交方法杂交方法 (1)(1)(1)(1)混混混混合合合合培培培培养养养养法法法法：要要要要求求求求两两两两亲亲亲亲本本本本菌菌菌菌株株株株必必必必须须须须为为为为互互互互补补补补的的的的营营营营养养养养缺缺缺缺陷陷陷陷型型型型。将将将将两两两两菌菌菌菌株株株株接接接接种种种种到到到到完完完完全全全全培培培培养养养养基基基基上上上上培培培培养养养养至至至至孢孢孢孢子子子子长长长长出出出出，然然然然后后后后将将将将孢孢孢孢子子子子在在在在选选选选择择择择培培培培养养养养基基基基上上上上进进进进行行行行筛筛筛筛选选选选，能能能能长长长长出出出出的的的的菌菌菌菌株株株株为为为为重组菌株。重组菌株。重组菌株。重组菌株。(2)(2)(2)(2)平平平平板板板板杂杂杂杂交交交交法法法法：将将将将菌菌菌菌株株株株一一一一在在在在完完完完全全全全培培培培养养养养基基基基上上上上培培培培养养养养至至至至产产产产生生生生孢孢孢孢子子子子，用用用用影影影影印印印印法法法法将将将将菌菌菌菌落落落落孢孢孢孢子子子子印印印印至至至至已已已已铺铺铺铺有有有有另另另另一一一一菌菌菌菌株株株株孢孢孢孢子子子子的的的的完完完完全全全全培培培培养养养养基基基基上，等长出孢子后，用基本培养基筛选重组菌株。上，等长出孢子后，用基本培养基筛选重组菌株。上，等长出孢子后，用基本培养基筛选重组菌株。上，等长出孢子后，用基本培养基筛选重组菌株。现在学习的是第54页，共69页 (3)(3)(3)(3)玻璃纸转移法玻璃纸转移法玻璃纸转移法玻璃纸转移法 要求：需要有两个遗传标记，一个为营养缺陷型，另一个标记为的抗要求：需要有两个遗传标记，一个为营养缺陷型，另一个标记为的抗要求：需要有两个遗传标记，一个为营养缺陷型，另一个标记为的抗要求：需要有两个遗传标记，一个为营养缺陷型，另一个标记为的抗药性。另一亲本要有不同的营养缺陷型并对此药物敏感。药性。另一亲本要有不同的营养缺陷型并对此药物敏感。药性。另一亲本要有不同的营养缺陷型并对此药物敏感。药性。另一亲本要有不同的营养缺陷型并对此药物敏感。分离方法：在选择培养基上筛选异核系菌落。分离方法：在选择培养基上筛选异核系菌落。分离方法：在选择培养基上筛选异核系菌落。分离方法：在选择培养基上筛选异核系菌落。原理：只有不带药物敏感等位基因，营养缺陷互补的异核系才能生长，原理：只有不带药物敏感等位基因，营养缺陷互补的异核系才能生长，原理：只有不带药物敏感等位基因，营养缺陷互补的异核系才能生长，原理：只有不带药物敏感等位基因，营养缺陷互补的异核系才能生长，得到异核系菌丛，然后在完全培养基上培养得到分离子菌落，然后再得到异核系菌丛，然后在完全培养基上培养得到分离子菌落，然后再得到异核系菌丛，然后在完全培养基上培养得到分离子菌落，然后再得到异核系菌丛，然后在完全培养基上培养得到分离子菌落，然后再在选择培养基上得到重组子。在选择培养基上得到重组子。在选择培养基上得到重组子。在选择培养基上得到重组子。现在学习的是第55页，共69页生产菌种的改良生产菌种的改良 一、原生质体融合（一、原生质体融合（protoplast fusionprotoplast fusion）1.1.标记菌株的筛选标记菌株的筛选 2.2.原生质体的制备原生质体的制备 3.3.原生质体的融合与再生原生质体的融合与再生 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）脱水剂）脱水剂 助融剂助融剂 CaCa2+2+提高融合频率提高融合频率 4.4.融合子的选择融合子的选择现在学习的是第56页，共69页原生质体的融合过程原生质体的融合过程 现在学习的是第57页，共69页1 1 1 1）菌体的预处理菌体的预处理菌体的预处理菌体的预处理 革兰氏阳性菌可加入青霉素破坏壁的形成；革兰氏阳性菌可加入青霉素破坏壁的形成；革兰氏阳性菌可加入青霉素破坏壁的形成；革兰氏阳性菌可加入青霉素破坏壁的形成；链霉菌加入甘氨酸培养到对数期，有利于原生质体的形成；链霉菌加入甘氨酸培养到对数期，有利于原生质体的形成；链霉菌加入甘氨酸培养到对数期，有利于原生质体的形成；链霉菌加入甘氨酸培养到对数期，有利于原生质体的形成；革兰氏阴性菌可加入革兰氏阴性菌可加入革兰氏阴性菌可加入革兰氏阴性菌可加入EDTAEDTAEDTAEDTA等。等。等。等。2 2 2 2）脱壁酶的选择）脱壁酶的选择）脱壁酶的选择）脱壁酶的选择 细菌、放线菌主要用溶菌酶；酵母菌和霉菌用蜗牛酶和纤维素酶。细菌、放线菌主要用溶菌酶；酵母菌和霉菌用蜗牛酶和纤维素酶。细菌、放线菌主要用溶菌酶；酵母菌和霉菌用蜗牛酶和纤维素酶。细菌、放线菌主要用溶菌酶；酵母菌和霉菌用蜗牛酶和纤维素酶。现在学习的是第58页，共69页 3）渗透压稳定剂渗透压稳定剂渗透压稳定剂渗透压稳定剂 对于细菌和放线菌一般采用蔗糖、丁二酸等为渗透压稳定剂；对于细菌和放线菌一般采用蔗糖、丁二酸等为渗透压稳定剂；对于细菌和放线菌一般采用蔗糖、丁二酸等为渗透压稳定剂；对于细菌和放线菌一般采用蔗糖、丁二酸等为渗透压稳定剂；酵母菌则采用山梨糖、甘露醇等；对与霉菌则采用酵母菌则采用山梨糖、甘露醇等；对与霉菌则采用酵母菌则采用山梨糖、甘露醇等；对与霉菌则采用酵母菌则采用山梨糖、甘露醇等；对与霉菌则采用KClKClKClKCl和和和和NaClNaClNaClNaCl等。等。等。等。稳稳稳稳定定定定剂剂剂剂采采采采用用用用的的的的浓浓浓浓度度度度为为为为0.3 0.3 0.3 0.3-0.8mol/L0.8mol/L0.8mol/L0.8mol/L及及及及一一一一定定定定浓浓浓浓度度度度的的的的CaCaCaCa2+2+2+2+、MgMgMgMg2+2+2+2+的二价阳离子。的二价阳离子。的二价阳离子。的二价阳离子。现在学习的是第59页，共69页 3.3.原生质体形成率的计算原生质体形成率的计算4.4.原生质体的融合原生质体的融合 在融合剂在融合剂PEGPEG和和CaCa2+2+作用下发生融合。或脉冲点击进行作用下发生融合。或脉冲点击进行电融合。电融合。现在学习的是第60页，共69页5.融合子的再生和检出融合子的再生和检出融合子的再生和检出融合子的再生和检出 主要依靠两个亲本的遗传标记。真正的融合体或假融合体，主要依靠两个亲本的遗传标记。真正的融合体或假融合体，主要依靠两个亲本的遗传标记。真正的融合体或假融合体，主要依靠两个亲本的遗传标记。真正的融合体或假融合体，通过传代分离。通过传代分离。通过传代分离。通过传代分离。6.6.6.6.原生质体的诱变原生质体的诱变原生质体的诱变原生质体的诱变 原生质体由于失去了细胞壁，对外界的环境更加敏感。原生质体由于失去了细胞壁，对外界的环境更加敏感。原生质体由于失去了细胞壁，对外界的环境更加敏感。原生质体由于失去了细胞壁，对外界的环境更加敏感。1 1 1 1）原生质体再生容易发生突变）原生质体再生容易发生突变）原生质体再生容易发生突变）原生质体再生容易发生突变 2 2 2 2）单一亲本灭活）单一亲本灭活）单一亲本灭活）单一亲本灭活 3 3 3 3）双亲株或多亲株灭活融合）双亲株或多亲株灭活融合）双亲株或多亲株灭活融合）双亲株或多亲株灭活融合 现在学习的是第61页，共69页二、二、DNADNA重组技术重组技术 （DNA recombination technologyDNA recombination technology）1.1.目标目标DNADNA片断的获得片断的获得2.2.与载体与载体DNADNA分子的连接分子的连接3.3.重组重组DNADNA分子引入宿主细胞分子引入宿主细胞4.4.从中选出所需重组从中选出所需重组DNADNA分子的宿主细胞分子的宿主细胞现在学习的是第62页，共69页菌种保藏（一）保藏目的及原理目的原理创造不利于菌种生长的一切条件，使其代谢处于休眠状态。使菌种不生长不死亡不污染不降低或不丧失其优良性以尽量延长使用时间现在学习的是第63页，共69页低温干燥无氧缺营养不利条件现在学习的是第64页，共69页（二）常用保藏法1.斜面低温保藏法 将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4C冰箱中包藏。保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存24个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。现在学习的是第65页，共69页 将无菌石蜡（最好的矿物油灭菌方法是以烤箱在170下加热1-2h，而非以灭菌锅灭菌）加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置低温或室温下保存。此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1-2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。2、液体石蜡保藏法现在学习的是第66页，共69页3.沙土管保藏法沙土管保藏法 沙土管保藏法是载体保藏法的一种。将培养好的微生物细胞或孢子用无菌水制成悬浮液,注入灭菌的沙土管中混合均匀，或直接将成熟孢子刮下接种于灭菌的沙土管中，使微生物细胞或孢子吸附在沙土载体上，将管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于4-6或室温进行保存的一种菌种保藏方法。保藏时间达2-10年。活化时在无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面。现在学习的是第67页，共69页4.甘油管保藏法甘油管保藏法 本法是利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。此法是将拟保藏菌种对数期的培养液直接与无菌甘油混合，并使甘油的终浓度在10-30，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温度若采用-20，保藏期约为0.5-1年，而采用-70，保藏期可达10年。基因工程菌常采用本法保藏。现在学习的是第68页，共69页5.冷冻保藏冷冻保藏 冷冻保藏（-20以下）：是保藏微生物菌种的最简单而有效的方法，将菌种加入菌种保护剂（甘油或二甲基亚砜）通过冷冻，使微生物代谢活动停止。冷冻温度愈低，效果愈好。冷冻深藏的缺点运输较困难。主要冷冻保藏方法 普通冷冻保藏技术(-20)超低温冷冻保藏技术(-80-60)液氮冷冻保藏技术（-150-130）现在学习的是第69页，共69页