第五章色谱分离法新.ppt

第五章色谱分离法新现在学习的是第1页，共97页吸附色谱吸附色谱排阻色谱排阻色谱（凝胶色谱）（凝胶色谱）分配色谱分配色谱离子交换色谱离子交换色谱吸附能力的差异吸附能力的差异分子尺寸的大小不同分子尺寸的大小不同两相中分配系数的不同两相中分配系数的不同亲和力的差异亲和力的差异Adsorption chromatographyExclusion chromatographyGel-permeation chromatographyPartition chromatographyIon-exchange chromatography色谱分离法的分类（原理）色谱分离法的分类（原理）现在学习的是第2页，共97页551 1 纸色谱法纸色谱法纸色谱法纸色谱法：以：以滤滤纸吸附的水作固纸吸附的水作固定相，有机溶剂定相，有机溶剂作流动相的一种作流动相的一种色谱法。色谱法。现在学习的是第3页，共97页551 1 纸色谱法纸色谱法一、基本原理和特点一、基本原理和特点二、定性分析二、定性分析三、操作技术三、操作技术四、应用四、应用现在学习的是第4页，共97页一、基本原理和特点一、基本原理和特点基本原理：基本原理：它和萃取一样，它也是根据不同它和萃取一样，它也是根据不同物质在两相间的分配比不同而进行分离的物质在两相间的分配比不同而进行分离的（相当于逆流萃取）（相当于逆流萃取）特点特点：操作简单、分离效率高，但分离速度：操作简单、分离效率高，但分离速度慢。慢。现在学习的是第5页，共97页1.层析缸层析缸123456732.滤纸滤纸3.原点原点4.展开剂展开剂5.前沿前沿6.7.斑点斑点现在学习的是第6页，共97页二、定性分析二、定性分析 组分分离后，它们在滤纸上的位置用组分分离后，它们在滤纸上的位置用比移值比移值来表示，它也是色谱定性分析的依据。来表示，它也是色谱定性分析的依据。aABbl 将标准和样品的将标准和样品的 Rf 值进行比较，值进行比较，可以对样品进行定性分析。可以对样品进行定性分析。定性分析方法：定性分析方法：现在学习的是第7页，共97页二、定性分析二、定性分析影响比移值的因素：影响比移值的因素：1）欲分离物的本性欲分离物的本性:物质在两相的分配系数物质在两相的分配系数,决定了它的决定了它的Rf大小大小2)层析溶剂层析溶剂:同一组分在不同溶剂中同一组分在不同溶剂中Rf不同。通常应选这不同。通常应选这样的层析剂，使溶质的样的层析剂，使溶质的Rf在在0.05 0.85之间之间,不同组分不同组分的的Rf差值差值0.05.3）pH:影响它们的存在状态影响它们的存在状态现在学习的是第8页，共97页二、定性分析二、定性分析4）滤纸滤纸:质地均一、厚薄适当、具有一定机械强度、质地均一、厚薄适当、具有一定机械强度、不含杂质不含杂质5）温度温度:温度会影响溶质的分配系数及流动相的扩散速温度会影响溶质的分配系数及流动相的扩散速度。层析操作应在恒温下进行，温度不超过度。层析操作应在恒温下进行，温度不超过 0.5oC6）展开方式展开方式:展开方式不同展开方式不同,Rf也不同。下行法的也不同。下行法的Rf最大，最大，上行法的上行法的Rf较小，环行法的较小，环行法的 Rf也不大。也不大。现在学习的是第9页，共97页三、操作技术三、操作技术1.1.滤纸的选择和处理滤纸的选择和处理2.2.固定相的选择固定相的选择3.3.试样的制备和点样试样的制备和点样4.4.展开展开5.5.显色显色现在学习的是第10页，共97页1.滤纸的选择与处理滤纸的选择：滤纸的选择：a.要求滤纸质地均匀、平整无折痕边缘整齐要求滤纸质地均匀、平整无折痕边缘整齐 b.要求滤纸的纤维松紧适宜要求滤纸的纤维松紧适宜 c.滤纸的杂质含量少滤纸的杂质含量少 以以0.1 0.4 mol/L HCl(或或 2 mol/L HAc)浸泡数小时浸泡数小时,除去无机杂质后除去无机杂质后,取出用蒸馏水洗净取出用蒸馏水洗净,再将滤纸放在丙酮再将滤纸放在丙酮-乙醇乙醇(1:1)中浸泡一周时间中浸泡一周时间,除去有机杂质除去有机杂质,再取出风再取出风干备用干备用.滤纸的处理滤纸的处理现在学习的是第11页，共97页2.固定相的选择n 纸层析纸层析以吸着在纤维素上的水作固以吸着在纤维素上的水作固定相。定相。n 反相纸层析反相纸层析用甲酰胺、二甲基甲酰用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇等作固定相。胺、丙二醇等作固定相。n 若分离芳香油等非极性物，以石蜡油、若分离芳香油等非极性物，以石蜡油、硅油作固定相。硅油作固定相。现在学习的是第12页，共97页3.试样的制备和点样A.试样的制备试样的制备 固体试样尽量不用水来溶解，而多采用乙醇、丙酮、氯仿固体试样尽量不用水来溶解，而多采用乙醇、丙酮、氯仿等有机溶剂来溶解，最好采用与展开剂极性相似的溶剂。等有机溶剂来溶解，最好采用与展开剂极性相似的溶剂。液体试样可直接点样。液体试样可直接点样。）先用铅笔在距纸条一端）先用铅笔在距纸条一端2 3 cm处划一条直线（起始处划一条直线（起始线）并在线上隔一定距离划一线）并在线上隔一定距离划一“x”号表示点样位置；见下号表示点样位置；见下示意图：示意图：B.点样方法点样方法现在学习的是第13页，共97页3.试样的制备和点样现在学习的是第14页，共97页3.试样的制备和点样）点样工具：点样工具：微量注射器、毛细滴管微量注射器、毛细滴管（0.5 mm)；）点样方法：点样方法：用点样工具吸取试液轻轻与用点样工具吸取试液轻轻与“x”号接号接触，使点样的斑点直径为触，使点样的斑点直径为0.2 0.5 cm,每次点样每次点样2 20 L于滤纸上，以冷风吹干；于滤纸上，以冷风吹干；）干后，将纸的两边用线缝好，以圆筒形式置）干后，将纸的两边用线缝好，以圆筒形式置于层析缸中展开。于层析缸中展开。现在学习的是第15页，共97页4.展开n欲分离物在两相中的溶解度；欲分离物在两相中的溶解度；n展开剂的极性展开剂的极性n展开剂与欲分离物间应无化学反应展开剂与欲分离物间应无化学反应n欲分离物在展开剂中的分配系数最好不受温度的影响欲分离物在展开剂中的分配系数最好不受温度的影响n欲分离物在两相间的分配平衡瞬间达到欲分离物在两相间的分配平衡瞬间达到A.展开剂的选择展开剂的选择现在学习的是第16页，共97页4.展开B.展开方法展开方法 展开展开前，前，层析缸与已点样滤纸必须预先经水蒸汽、溶剂层析缸与已点样滤纸必须预先经水蒸汽、溶剂蒸气饱和蒸气饱和。方法：将溶剂和水置于分液漏斗中充分振荡，分层后，。方法：将溶剂和水置于分液漏斗中充分振荡，分层后，将水层放入小烧杯内，置于层析缸中平衡一段时间，使滤纸吸饱将水层放入小烧杯内，置于层析缸中平衡一段时间，使滤纸吸饱蒸汽，然后移去小烧杯，将溶剂倒入溶剂槽中，立即将点好样的蒸汽，然后移去小烧杯，将溶剂倒入溶剂槽中，立即将点好样的滤纸的一端浸入溶剂槽内展层。滤纸的一端浸入溶剂槽内展层。展开方式可分为展开方式可分为上行法、下行法上行法、下行法和和环行法环行法及及双向展开法双向展开法等。等。现在学习的是第17页，共97页4.展开B.展开方法（上行法）展开方法（上行法）将点有试样的滤纸条的下端浸入溶将点有试样的滤纸条的下端浸入溶剂（但不能浸没点样处）上端固定剂（但不能浸没点样处）上端固定在层析缸的上部，保持垂直，将缸在层析缸的上部，保持垂直，将缸密闭，使溶剂沿下端上升而展层。密闭，使溶剂沿下端上升而展层。待溶液上升到距离纸上端待溶液上升到距离纸上端3 4 cm 3 4 cm 时，将滤纸取出，用铅笔在溶剂时，将滤纸取出，用铅笔在溶剂前沿处画线作记号（见右图）前沿处画线作记号（见右图）现在学习的是第18页，共97页4.展开B.展开方法（下行法）展开方法（下行法）溶剂自纸的溶剂自纸的上端向下降上端向下降（借助于重力（借助于重力的作用），具的作用），具有分离速度快有分离速度快及连续挥发色及连续挥发色谱的优点。谱的优点。玻皿玻皿玻片玻片玻璃棒玻璃棒原点原点剪成锯齿状，便剪成锯齿状，便于溶剂滴下于溶剂滴下现在学习的是第19页，共97页4.展开B.展开方法（环行法）展开方法（环行法）取一张圆形滤纸在直径取一张圆形滤纸在直径的两边各画两根平行线，的两边各画两根平行线，用剪刀沿这两根线剪至用剪刀沿这两根线剪至圆心处，在纸的中央滴圆心处，在纸的中央滴上试液，干后，将滤纸上试液，干后，将滤纸夹在两个大小相同培养夹在两个大小相同培养皿之间，使剪开的纸条皿之间，使剪开的纸条的尾端浸入流动相。的尾端浸入流动相。现在学习的是第20页，共97页4.展开B.展开方法（双向展开法）展开方法（双向展开法）有时用一种溶剂不能将样品有时用一种溶剂不能将样品中组份分开时，可以试用双向展中组份分开时，可以试用双向展开法。该法是用正方形或长方形开法。该法是用正方形或长方形滤纸，在纸的一角上点样，先用滤纸，在纸的一角上点样，先用一种展开剂朝一个方向展开，展一种展开剂朝一个方向展开，展开完毕，待溶剂挥发后，再用另开完毕，待溶剂挥发后，再用另一种展开剂朝与原来垂直的方向一种展开剂朝与原来垂直的方向进行第二次展层。进行第二次展层。现在学习的是第21页，共97页4.显色a.有色物：直接观察各个色斑有色物：直接观察各个色斑b.无色物：无色物：n物理法显色物理法显色：用紫外灯照，观察有无吸收或发出各种不同颜色的：用紫外灯照，观察有无吸收或发出各种不同颜色的荧光斑点，并用铅笔画下斑点的位置及大小。荧光斑点，并用铅笔画下斑点的位置及大小。n化学法显色化学法显色：利用各种物质的特性反应，喷洒适当的显色剂。：利用各种物质的特性反应，喷洒适当的显色剂。如若被分离的物质含有氨基酸，则可喷茚三酮，多数氨基酸如若被分离的物质含有氨基酸，则可喷茚三酮，多数氨基酸呈紫色，个别氨基酸呈黄色。其它化合物所用显色剂可从手呈紫色，个别氨基酸呈黄色。其它化合物所用显色剂可从手册里查阅。册里查阅。现在学习的是第22页，共97页四、应用四、应用例氨基酸的分离（固定相为水）例氨基酸的分离（固定相为水）流动相流动相分离情况分离情况正丁醇：正丁醇：2 mol/L HAc =1 :1酪氨酸、二碘酪氨酸酪氨酸、二碘酪氨酸用水饱和的苄醇用水饱和的苄醇亮氨酸、异亮氨酸亮氨酸、异亮氨酸叔丁醇：甲乙酮：甲叔丁醇：甲乙酮：甲酸：水酸：水16 :16:0.1 :3.9亮氨酸、异亮氨酸亮氨酸、异亮氨酸现在学习的是第23页，共97页四、应用四、应用例例2.糖的分离糖的分离(固定相为水固定相为水)流动相流动相分离情况分离情况醋酸乙脂醋酸乙脂:吡啶吡啶:水水=2:1:1木糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖葡萄糖丁醇丁醇:吡啶吡啶:水水=45:25:40乳糖、半乳糖、葡萄糖乳糖、半乳糖、葡萄糖丁醇丁醇:乙醇乙醇:水水:NH3=40:10 :49:1尿中葡萄糖尿中葡萄糖丁醇丁醇:乙醇乙醇:水水=10:1:2蜜二糖、果糖、葡萄糖、蜜二糖、果糖、葡萄糖、现在学习的是第24页，共97页四、应用四、应用例脂肪酸的分离（固定相为水）例脂肪酸的分离（固定相为水）流动相流动相分离情况分离情况95%乙醇：浓氨水乙醇：浓氨水100:1同系的直链脂肪酸同系的直链脂肪酸正己醇：正己醇：1.5 mol/L 氨水氨水1:1烷氧基酸烷氧基酸流动相流动相1:乙醇：浓氨水乙醇：浓氨水:H2O=80:5:15流动相流动相2：乙二醇乙醚：桉树脑：乙二醇乙醚：桉树脑：88%甲酸甲酸=5:5:2草酸、酒石酸、柠檬酸、苹草酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、羟基醋酸、顺丁烯二果酸、羟基醋酸、顺丁烯二酸、丙二酸、乳酸、琥珀酸、酸、丙二酸、乳酸、琥珀酸、乌头酸、己二酸、延胡索酸、乌头酸、己二酸、延胡索酸、葵二酸葵二酸现在学习的是第25页，共97页四、应用四、应用例例4.醇、酚的分离（固定相为水）醇、酚的分离（固定相为水）流动相流动相分离情况分离情况丁醇：丁醇：5%NaHCO3 1:1甲醇、乙醇、异丙醇、异甲醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、异戊醇、辛醇丁醇、异戊醇、辛醇己烷饱和甲醇己烷饱和甲醇乙醇、异丙醇、丙醇、异乙醇、异丙醇、丙醇、异丁醇、正丁醇丁醇、正丁醇丁醇：乙醇：水丁醇：乙醇：水 4:1.1:1.9乙二醇、丙三醇、甘露糖乙二醇、丙三醇、甘露糖醇、山梨醇、肌醇醇、山梨醇、肌醇现在学习的是第26页，共97页四、应用四、应用流动相流动相分离情况分离情况正丁醇：浓氨水：水正丁醇：浓氨水：水4:1:5磺胺嘧啶、磺胺噻睉、磺胺嘧啶、磺胺噻睉、Sulfamerzine、p,p-sulfonyldianiline正丁醇：醋酸：水正丁醇：醋酸：水 4:1:5对胺基苯甲酸、维生素对胺基苯甲酸、维生素C、N甲基菸甲基菸酰胺、菸碱酰胺、菸酸、潘妥宁、泛酸、酰胺、菸碱酰胺、菸酸、潘妥宁、泛酸、VB6、VB1甲苯：石油醚：乙醇：甲苯：石油醚：乙醇：水水200:100:30:70雌酮、雌二酮、雌三酮、马烯雌酮、脱雌酮、雌二酮、雌三酮、马烯雌酮、脱氢皮质甾酮酸、孕甾酮、顺式睾丸甾酮氢皮质甾酮酸、孕甾酮、顺式睾丸甾酮例例5.其它类的分离（固定相为水）其它类的分离（固定相为水）现在学习的是第27页，共97页四、应用四、应用例例6无机应用（固定相为水）无机应用（固定相为水）流动相流动相分离情况分离情况12 mol/LHCl:甲醇甲醇:丁醇丁醇:甲甲基异丁酮基异丁酮55:35:5:5K+、Rb+、Cs+乙醇：水乙醇：水80:20Li+、Na+、K+10%HCl的水饱和丁醇的水饱和丁醇Zn2+Ga3+In3+Al 3+苯酚苯酚:甲醇甲醇:HCl 5:3:2Al3+Ga3+In3+Tl 3+现在学习的是第28页，共97页四、应用四、应用例例7生物学应用生物学应用黑黑毛毛红红毛毛黄黄毛毛白白毛毛 取不同颜色兔毛取不同颜色兔毛(300 500 mg),干干法灰化法灰化,溶于稀溶于稀HCl 中中,用丙酮用丙酮:丁醇丁醇:HCl=10:4:2,展展开后开后,显色显色现在学习的是第29页，共97页Exercise 1用纸色谱分离混合物中物质用纸色谱分离混合物中物质A A和和B B，已知两者的比移值分别，已知两者的比移值分别为为0.500.50和和0.600.60，问欲使层析后斑点显著分开，斑点间至少间隔，问欲使层析后斑点显著分开，斑点间至少间隔1cm1cm，问滤纸应截取多长？，问滤纸应截取多长？设前沿为设前沿为l，原点到，原点到A、B斑点中心距离分别为斑点中心距离分别为a、b，两，两斑点间至少间隔斑点间至少间隔1cm，那么两斑点中心相距为，那么两斑点中心相距为2.0cm，则可列出：，则可列出：解：解：原点应距滤纸下端原点应距滤纸下端4cm，前沿应距滤纸上端，前沿应距滤纸上端2-3cm，应截取滤纸长，应截取滤纸长20+4+2=26cm,滤纸条应截取滤纸条应截取26-27cm长。长。现在学习的是第30页，共97页Exercise 2纸色谱法分离混合离子纸色谱法分离混合离子,若混合离子极性大小顺若混合离子极性大小顺序为序为ABC,ABC,用弱极性有机溶剂展开后其用弱极性有机溶剂展开后其R Rf f值大小值大小顺序为顺序为_。C,B,A 现在学习的是第31页，共97页552 2 薄层色谱法（薄层色谱法（TLCTLC）一、基本原理和特点一、基本原理和特点二、吸附剂二、吸附剂三、操作技术三、操作技术四、应用四、应用现在学习的是第32页，共97页一、基本原理和特点一、基本原理和特点原理原理:经典的薄层色谱是以吸附剂为固定相的一种液相经典的薄层色谱是以吸附剂为固定相的一种液相色谱法，利用试样组分在流动相（展开剂）和固定相色谱法，利用试样组分在流动相（展开剂）和固定相（吸附剂）之间反复（吸附剂）之间反复吸附吸附、溶解而分离。、溶解而分离。实际上，薄层色谱的固定相不仅仅局限于吸附剂，实际上，薄层色谱的固定相不仅仅局限于吸附剂，也可以在铺好的惰性薄层上均匀地再涂一种作为固也可以在铺好的惰性薄层上均匀地再涂一种作为固定液的液体，进行定液的液体，进行分配分离分配分离。现在学习的是第33页，共97页一、基本原理和特点一、基本原理和特点特点特点:n 装置简单、操作方便装置简单、操作方便n 展开时间短（展开时间短（1060min）n 灵敏度高：可以检出灵敏度高：可以检出0.01gn 显色方法多于纸色谱显色方法多于纸色谱缺点：缺点：Rf值的重复性差值的重复性差定性分析：定性分析：Rf定量分析：定量分析：光度法或荧光法光度法或荧光法现在学习的是第34页，共97页二、吸附剂二、吸附剂要求：要求：n合适的吸附力合适的吸附力n与展开剂、被吸附物质均不起化学反应与展开剂、被吸附物质均不起化学反应n粒度细小而且均匀粒度细小而且均匀 常用的吸附剂有常用的吸附剂有氧化铝、硅胶氧化铝、硅胶。此外，硅藻土、。此外，硅藻土、硅酸盐、杂多酸盐、聚酰胺、纤维素也可用作吸附硅酸盐、杂多酸盐、聚酰胺、纤维素也可用作吸附剂。剂。根据范氏方程，减少涡根据范氏方程，减少涡流扩散项流扩散项现在学习的是第35页，共97页1.1.氧化铝氧化铝 氧化铝可分为中性、碱性和酸性三种，一般常用氧化铝可分为中性、碱性和酸性三种，一般常用碱性氧化铝碱性氧化铝。通常用于分离。通常用于分离碳氢化合物、生物碱类和碳氢化合物、生物碱类和对碱性物质比较稳定的中性和碱性物质对碱性物质比较稳定的中性和碱性物质。酸性化合物。酸性化合物可用酸性氧化铝分离。可用酸性氧化铝分离。氧化铝的活性与含水量密切相关（含一定量的水份时，氧化铝的活性与含水量密切相关（含一定量的水份时，吸附剂表面的吸附中心会被水分子占据）吸附剂表面的吸附中心会被水分子占据）现在学习的是第36页，共97页1.1.氧化铝氧化铝活性活性 含水量含水量()100 150oC,除去除去Al2O3中与羟基结合的部分水份，使中与羟基结合的部分水份，使Al2O3有一定的活性有一定的活性150 300oC，Al2O3活性达活性达 级级300 400oC，Al2O3活性达活性达 级级 600oC，Al2O3进一步脱水并开始烧结进一步脱水并开始烧结一般要求薄板用的活性为一般要求薄板用的活性为 级级现在学习的是第37页，共97页 由于脱水过程受到许多因素的影响，因此，每批由于脱水过程受到许多因素的影响，因此，每批生产的生产的Al2O3，其表面积和表面孔穴结构并不一致，其表面积和表面孔穴结构并不一致，活性也不相同。活性也不相同。Al2O3活性的测定：取20 L染料溶液（偶氮苯30 mg、对甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红、和对氨基偶氮苯各20 mg，溶解于50 mL CCl4中），加到薄板上，用CCl4展层，根据下表确定活性。现在学习的是第38页，共97页活性活性 Rf,偶氮苯偶氮苯 0.59 0.74 0.85 0.95Rf,对对-甲氧基偶氮苯甲氧基偶氮苯 0.16 0.49 0.69 0.89Rf,苏丹黄苏丹黄 0.01 0.25 0.57 0.78Rf,苏丹红苏丹红 0.00 0.10 0.33 0.56Rf,偶氮苯偶氮苯 0.00 0.03 0.08 0.19Al2O3活性表活性表现在学习的是第39页，共97页市售的供薄层色谱用的市售的供薄层色谱用的Al2O3有有:Al2O3 H氧化铝中无粘合剂氧化铝中无粘合剂Al2O3 G氧化铝中含煅石膏（一般氧化铝中含煅石膏（一般5煅石膏）煅煅石膏）煅石膏石膏CaSO4，作为粘合剂，作为粘合剂Al2O3 HF254氧化铝中不含煅石膏，仅含荧光指示氧化铝中不含煅石膏，仅含荧光指示剂（在剂（在254 nm下呈黄绿色荧光）下呈黄绿色荧光）Al2O3 GF254氧化铝中既含煅石膏又含荧光指示剂氧化铝中既含煅石膏又含荧光指示剂（在（在254 nm下呈黄绿色荧光）下呈黄绿色荧光）上述商品可以直接调料涂敷（上述商品可以直接调料涂敷（1份料，份料，2份水调合）份水调合）现在学习的是第40页，共97页2.2.硅胶硅胶硅胶是硅胶是微酸性吸附剂微酸性吸附剂，适用于，适用于酸性、中性酸性、中性物质的分离物质的分离（如有机酸、氨基酸、萜类、甾类），碱性物质则能与硅胶作（如有机酸、氨基酸、萜类、甾类），碱性物质则能与硅胶作用（当用中性溶剂展层，碱性物质有时停留在原点不动，或者用（当用中性溶剂展层，碱性物质有时停留在原点不动，或者得到拖尾的斑点，而不能很好的分离）得到拖尾的斑点，而不能很好的分离）活性活性 含水量（）含水量（）0 5 15 25 35注注硅胶薄层的活化温度不能高于硅胶薄层的活化温度不能高于200oC现在学习的是第41页，共97页硅胶活性的测定硅胶活性的测定：称取二甲黄、苏丹红、靛酚蓝各：称取二甲黄、苏丹红、靛酚蓝各40mg40mg溶于溶于100 mL 100 mL 苯中，将此混合液滴加于薄层上，用石油醚展开苯中，将此混合液滴加于薄层上，用石油醚展开10 cm10 cm，混合物应不动；如用苯展开，则应分成三个斑点，混合物应不动；如用苯展开，则应分成三个斑点，其其R Rf f值分别为：二甲黄值分别为：二甲黄0.580.58，苏丹红，苏丹红0.190.19，靛酚蓝，靛酚蓝0.080.08（展（展层时间层时间30 30 45 min45 min），则认为此硅胶合格。经本法测定的活），则认为此硅胶合格。经本法测定的活性与性与AlAl2 2O O3 3活性活性 级相当。级相当。薄层用薄层用商品硅胶商品硅胶有：硅胶有：硅胶H H（不含粘结剂）、硅胶（不含粘结剂）、硅胶G G（含粘结剂煅石膏）、硅胶（含粘结剂煅石膏）、硅胶HFHF254254（含荧光物质的硅胶）硅（含荧光物质的硅胶）硅胶胶GFGF254254（含有煅石膏和荧光剂）（含有煅石膏和荧光剂）现在学习的是第42页，共97页3.3.吸附剂的选择吸附剂的选择1）根据样品组分的性质）根据样品组分的性质n 亲脂性选择硅胶、氧化铝、乙酰化纤维素、聚酰胺等亲脂性选择硅胶、氧化铝、乙酰化纤维素、聚酰胺等n 亲水性选择离子交换纤维素、硅藻土等亲水性选择离子交换纤维素、硅藻土等n 酸性物质首选硅胶板，碱性物质首选氧化铝板酸性物质首选硅胶板，碱性物质首选氧化铝板n 极性很大的物质解吸难时可用聚酰胺（如酚）极性很大的物质解吸难时可用聚酰胺（如酚）2）根据吸附剂的性质）根据吸附剂的性质n 适宜活性：活性大，易脱尾；活性小，不能分离适宜活性：活性大，易脱尾；活性小，不能分离n 考虑吸附剂对样品的作用：如碱性氧化铝对酯的水解起催化作考虑吸附剂对样品的作用：如碱性氧化铝对酯的水解起催化作用。用。现在学习的是第43页，共97页三、操作技术三、操作技术1.1.薄层板的制备薄层板的制备2.2.样品溶液的配制样品溶液的配制3.3.点样点样4.4.展开展开5.5.显色显色6.6.定性定量分析定性定量分析7.7.常见问题及消除方法常见问题及消除方法现在学习的是第44页，共97页1.1.薄层板的制备薄层板的制备n 玻璃板玻璃板 a.a.平整、去油、去污（可用浓平整、去油、去污（可用浓H H2 2SOSO4 4-K-K2 2CrOCrO7 7洗液浸洗，或洗液浸洗，或丙酮擦洗，自来水洗净后，烘干）丙酮擦洗，自来水洗净后，烘干）b.b.玻璃板的尺寸根据自己的需要自由选择，小的可玻璃板的尺寸根据自己的需要自由选择，小的可用用2.52.5 7.5cm7.5cm的载玻片的载玻片,大的可用大的可用20 20 20cm20cm的玻片。的玻片。n 涂铺液涂铺液 取一定量的吸附剂放入研钵中，加入需要的水或适当取一定量的吸附剂放入研钵中，加入需要的水或适当的溶剂，研磨时间以调成稀糊状为度，当浓度均一后，的溶剂，研磨时间以调成稀糊状为度，当浓度均一后，即成胶状物，色泽洁白为最佳，立即倾入玻璃板上，用即成胶状物，色泽洁白为最佳，立即倾入玻璃板上，用下述方法涂布。下述方法涂布。现在学习的是第45页，共97页1.1.薄层板的制备薄层板的制备n 涂布方法涂布方法 软板的制备软板的制备：干法铺层。：干法铺层。硬板的制备硬板的制备：湿法铺板。方：湿法铺板。方法有法有倾注法，平铺法和涂铺器倾注法，平铺法和涂铺器法三种。目前广为应用的是涂铺法三种。目前广为应用的是涂铺器法，操作简便，薄板厚度均匀，器法，操作简便，薄板厚度均匀，适合于定量分析。适合于定量分析。现在学习的是第46页，共97页1.1.薄层板的制备薄层板的制备n 活化活化 薄板薄板首先风干首先风干，否则湿板一下加热到高温，否则湿板一下加热到高温，烘出的薄板很酥松，使用效果不好。烘出的薄板很酥松，使用效果不好。氧化铝氧化铝G板在板在150 160oC,烘烘4小时小时(级左右级左右)硅胶硅胶G板在板在110oC烘烘1小时小时 薄板经活化后，一定要储藏在密闭的干燥器或烘箱薄板经活化后，一定要储藏在密闭的干燥器或烘箱中备用。中备用。现在学习的是第47页，共97页2.2.样品溶液的制备样品溶液的制备 首先将固体样品粉碎过筛首先将固体样品粉碎过筛：疏松的粉末过：疏松的粉末过4040目筛，目筛，坚实的粉末过坚实的粉末过8080目筛目筛 用适宜的方法和溶剂提取样品组分用适宜的方法和溶剂提取样品组分：其提取方法包：其提取方法包括索式提取器提取法、冷浸法、热回流法、振摇提取括索式提取器提取法、冷浸法、热回流法、振摇提取法、超声提取法。法、超声提取法。样品溶液的精制样品溶液的精制（除去杂质）：溶剂萃取或柱色谱（除去杂质）：溶剂萃取或柱色谱法法 溶液的蒸发与残渣的溶解溶液的蒸发与残渣的溶解（对溶液浓缩）：（常用（对溶液浓缩）：（常用旋转蒸发仪、旋转蒸发仪、KDKD浓缩器、水浴蒸发等）浓缩器、水浴蒸发等）现在学习的是第48页，共97页旋转蒸发仪KD浓缩器现在学习的是第49页，共97页3.3.点样点样 点样方法类似于纸色谱点样方法类似于纸色谱 点样量一般点样量一般110L。点样器有点样器有微量注射器微量注射器，容量毛细管和精密的自动或，容量毛细管和精密的自动或半自动点样仪半自动点样仪 点样的形状一般为圆点，直径小于点样的形状一般为圆点，直径小于3mm切勿损伤切勿损伤薄层表面薄层表面现在学习的是第50页，共97页4.4.展开展开1 1）对展开剂的要求）对展开剂的要求 能够溶解待测组分能够溶解待测组分 能使待测组分与杂质分开能使待测组分与杂质分开 使待测组分的使待测组分的Rf值在值在0.20.8之间，定量测定最好之间，定量测定最好在在0.30.5之间。之间。不能与待测组分或吸附剂发生化学反应不能与待测组分或吸附剂发生化学反应 具有适中的沸点和比较小的粘度具有适中的沸点和比较小的粘度 混合溶剂最好临用前新鲜配制混合溶剂最好临用前新鲜配制。现在学习的是第51页，共97页2 2）展开剂的性质）展开剂的性质A 极性：极性：单一溶剂的极性顺序是：单一溶剂的极性顺序是：石油醚石油醚环己烷环己烷二硫化二硫化碳碳苯苯四氯化碳四氯化碳三氯乙烯三氯乙烯甲苯甲苯二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿乙醚乙醚乙酸乙酯乙酸乙酯丙酮丙酮乙醇乙醇甲醇甲醇水水 混合溶剂的极性参数混合溶剂的极性参数P=APABPB（A是体积分是体积分数数）B 强度强度 在吸附色谱中，用在吸附色谱中，用o表示，指溶剂在单位表面积的标表示，指溶剂在单位表面积的标定活性的吸附剂上的吸附能。分配色谱与极性参数有定活性的吸附剂上的吸附能。分配色谱与极性参数有关。关。现在学习的是第52页，共97页C C 展开剂的选择性展开剂的选择性组别组别溶剂名称溶剂名称脂肪族醚，三级烷胺，四甲基胍，六甲基磷酰胺脂肪族醚，三级烷胺，四甲基胍，六甲基磷酰胺脂肪醇脂肪醇吡啶，四氢呋喃，酰胺（除甲酰胺），乙二醇醚，亚吡啶，四氢呋喃，酰胺（除甲酰胺），乙二醇醚，亚砜砜乙二醇，苯甲醇，甲酰胺，乙酸乙二醇，苯甲醇，甲酰胺，乙酸二氯甲烷，二氯乙烷二氯甲烷，二氯乙烷a磷酸三甲苯酯，脂肪族酮和酯，聚醚，二氧六环磷酸三甲苯酯，脂肪族酮和酯，聚醚，二氧六环b腈，砜，碳酸丙烯酯腈，砜，碳酸丙烯酯硝基化合物，芳香醚，芳烃，卤代芳烃硝基化合物，芳香醚，芳烃，卤代芳烃氟烷醇，间甲苯酚，氟烷醇，间甲苯酚，氯仿氯仿，水，水 根据溶剂分子与样品分子间的四种作用力，将溶剂分根据溶剂分子与样品分子间的四种作用力，将溶剂分为八组。为八组。现在学习的是第53页，共97页3 3）展开剂的选择）展开剂的选择A 总原则：总原则：先用一展开剂，它的极性或强度能够使容量因子先用一展开剂，它的极性或强度能够使容量因子k最好最好在在0.55之间（或之间（或Rf值在值在0.20.6)，然后保持此强度不变，然，然后保持此强度不变，然后根据溶剂的选择性再更换其他的展开剂，直到使待测组后根据溶剂的选择性再更换其他的展开剂，直到使待测组分很好分离。分很好分离。B 二元展开剂的选择二元展开剂的选择 由一个强度较强的溶剂和一个强度近于零的溶剂（强度由一个强度较强的溶剂和一个强度近于零的溶剂（强度调节剂）混合并计算其强度。调节剂）混合并计算其强度。正相正相TLC多用多用正己烷正己烷为强度调为强度调节剂，反相节剂，反相TLC则使用则使用水水。现在学习的是第54页，共97页3 3）展开剂的选择）展开剂的选择C 多元展开剂的选择多元展开剂的选择Glajch提出了确定溶剂强度和选择性的最优化三角形提出了确定溶剂强度和选择性的最优化三角形法法.做法如下：先选三种做法如下：先选三种选择性相差大选择性相差大的纯溶剂，再选一种调节极性的的纯溶剂，再选一种调节极性的纯溶剂组成三个相等洗脱强度的纯溶剂组成三个相等洗脱强度的二元基本溶剂二元基本溶剂A,B,C.BACDEFGHIJ 然后再分别配成然后再分别配成A:B:C=0.5:0.5:0,(D)0.5:0:0.5(E),0:0.5:0.5(F)和和0.33:0.33:0.33(G),0.67:0.16:0.16(H)0.16:0.16:0.67(I),0.16:0.67:0.16(J)的的几种混合溶剂。几种混合溶剂。现在学习的是第55页，共97页以正相以正相TLC法为例：法为例：1）先选择溶剂选择性相差较大的三种溶剂：乙醚先选择溶剂选择性相差较大的三种溶剂：乙醚()、氯仿、氯仿()和二氯甲烷和二氯甲烷()。选。选正己烷为极性调节剂。正己烷为极性调节剂。2)用氯仿用氯仿-正己烷的不同比例在硅胶板上分离样品，发正己烷的不同比例在硅胶板上分离样品，发现用现用氯仿氯仿：正己烷：正己烷34：66的组成比例可使斑点的组成比例可使斑点(待测组待测组分分)的的Rf在在0.30.5之间，算出极性参数：之间，算出极性参数：P=4.10.34+0.10.66=1.46。保持。保持P不变，计算出其他不变，计算出其他两个二元溶剂的体积比。二氯甲烷：正己烷两个二元溶剂的体积比。二氯甲烷：正己烷45：55，乙醚：正己烷，乙醚：正己烷50：50。3)再根据再根据Glajch三角形图，确定其他七种多元体系的体积三角形图，确定其他七种多元体系的体积比。比。现在学习的是第56页，共97页4 4）展开方式）展开方式TLCTLC的展开方式类似于纸色谱。的展开方式类似于纸色谱。矮型色矮型色谱缸谱缸内一般用内一般用近水平近水平上行上行展开，不加展开，不加粘合剂的板层也适合在此展开；粘合剂的板层也适合在此展开；直立直立上行上行一般在长方筒形或双底槽色谱缸一般在长方筒形或双底槽色谱缸中进行，这种展开中进行，这种展开只适合含有粘合剂只适合含有粘合剂的薄层的薄层。现在学习的是第57页，共97页5.5.显色显色1 1）光学检出法）光学检出法 本身是有色物，可以直接观测斑点的位置和颜本身是有色物，可以直接观测斑点的位置和颜色色 本身无色但在紫外线的照射下会发出不同颜色本身无色但在紫外线的照射下会发出不同颜色的荧光的荧光 在可见光和紫外光下都不显示，也没有合适的显色方在可见光和紫外光下都不显示，也没有合适的显色方法，可以用荧光薄板法，可以用荧光薄板(硅胶硅胶HFHF254+366254+366,硅胶硅胶GFGF254254,.),.)进进行分离行分离,欲测物吸收紫外线欲测物吸收紫外线,在荧光背景下呈暗色在荧光背景下呈暗色现在学习的是第58页，共97页5.5.显色显色3）生物自显影）生物自显影 对于抗菌素等具有生物活性的物质，将分离后的薄层与对于抗菌素等具有生物活性的物质，将分离后的薄层与具有适当微生物的琼脂培养基表面接触，经过培养后观察具有适当微生物的琼脂培养基表面接触，经过培养后观察抑菌点。抑菌点。4）放射自显影）放射自显影 在薄层上分离的放射性同位素的辐射线，可使照相底在薄层上分离的放射性同位素的辐射线，可使照相底片感光，照片所呈暗度与斑点的放射活性成正比，因此，片感光，照片所呈暗度与斑点的放射活性成正比，因此，得到的放射显迹图可以定性和定量。得到的放射显迹图可以定性和定量。2)2)蒸气显色法蒸气显色法 利用一些物质的蒸气与样品作用生成不同颜色或产生利用一些物质的蒸气与样品作用生成不同颜色或产生荧光。如多数有机物吸附碘蒸气显示黄色斑点。荧光。如多数有机物吸附碘蒸气显示黄色斑点。现在学习的是第59页，共97页5.5.显色显色5 5）试剂显色法）试剂显色法 薄层色谱中显色最多的方法是薄层色谱中显色最多的方法是光学检出法和试剂显光学检出法和试剂显色法色法 展开后的薄层根据待测化合物的性质选择适当展开后的薄层根据待测化合物的性质选择适当的显色剂使之生成颜色稳定、轮廓清晰、灵敏度的显色剂使之生成颜色稳定、轮廓清晰、灵敏度高的色斑。高的色斑。由于对薄层板的处理方式不同，试剂显色法又分由于对薄层板的处理方式不同，试剂显色法又分为为喷雾显色喷雾显色和和浸渍显色浸渍显色两种。两种。不不加加粘粘合合剂剂的的薄薄板板禁禁用用 有些显色反应需要加热，一般在恒温烤箱内进有些显色反应需要加热，一般在恒温烤箱内进行，温度控制在行，温度控制在100110。现在学习的是第60页，共97页表表 主要显色试剂主要显色试剂试剂试剂配制及使用方法配制及使用方法检出范围检出范围浓浓H2SO4喷雾喷雾,100 120oC ,观察颜色变化观察颜色变化高级醇、醛、高级醇、醛、酮、甾体酮、甾体H2SO4-K2Cr2O75g K2Cr2O7+100mL H2SO4,喷雾喷雾,280oC观观察颜色变化察颜色变化全部有机物全部有机物2,7-二氯荧光二氯荧光黄黄(0.2%乙醇乙醇)喷雾，紫外线照射喷雾，紫外线照射类脂类化合物类脂类化合物I2-KI1g I2+10gKI溶于溶于50mLH2O中，加入中，加入2mLHAc，稀释至，稀释至100mL，喷雾，喷雾生物碱生物碱现在学习的是第61页，共97页试剂试剂配制及使用方法配制及使用方法检出范围检出范围溴甲酚绿溴甲酚绿0.04g溶于溶于100mL乙醇中，以乙醇中，以0.1 mol/L NaOH调至蓝色刚调至蓝色刚消失，消失，pH3.6显黄色显黄色羧基酸羧基酸Ag(NH3)2+2.6gAgNO3溶于溶于50mL水，加水，加入入NH3H2O至沉淀刚好消失至沉淀刚好消失还原性物质、醛、还原性物质、醛、还原糖还原糖茚三酮茚三酮0.5%丙酮溶液丙酮溶液胺类（如麻黄碱、胺类（如麻黄碱、氨基酸等）氨基酸等）FeCl31g溶于溶于100mL酚羟基、鞣质、黄酚羟基、鞣质、黄酮酮磷钼酸磷钼酸5g溶于溶于100mL95%乙醇乙醇脂肪、甾类、类脂、脂肪、甾类、类脂、三萜酸、生物碱三萜酸、生物碱续表续表 主要显色试剂主要显色试剂现在学习的是第62页，共97页6.6.定性定量分析定性定量分析1 1）定性分析定性分析 比移值定性比移值定性：标准物质对照。：标准物质对照。光谱定性光谱定性：薄层扫描仪：薄层扫描仪 各种联用检测仪器联用各种联用检测仪器联用：将斑点吸附转移到：将斑点吸附转移到试管中，用其他方法纯化，然后进行紫外、荧试管中，用其他方法纯化，然后进行紫外、荧光、红外等光谱法定性。光、红外等光谱法定性。现在学习的是第63页，共97页6.6.定性定量分析定性定量分析2 2）定量分析定量分析 目视比较半定量法目视比较半定量法：杂质的限量实验。：杂质的限量实验。测量斑点面积测量斑点面积：要求斑点边缘清晰：要求斑点边缘清晰 从薄层上将被测组分洗脱下来进行定量测定从薄层上将被测组分洗脱下来进行定量测定：先确定斑点，再取下斑点和吸附剂，最后用适先确定斑点，再取下斑点和吸附剂，最后用适当的洗脱剂洗脱分析物，进行测定当的洗脱剂洗脱分析物，进行测定 薄层色谱扫描仪原位定量测定