HBsAg免疫对小鼠TB细胞功能的影响.pptx
实验流程1W1.双向免疫扩散2.酶联免疫吸附试验（ELISA)OVA(1mg/ml)+CFA（500ul）免疫小鼠（腹腔内注射）OVA+CFA（500ul）加强免疫小鼠无菌取脾和胸腺摘眼球取血分离血清2W取脾和胸腺淋巴细胞转化试验 生理盐水（500ul)免疫小鼠（腹腔内注射）生理盐水（500ul）加强免疫小鼠 2W 1W对照组实验组 抗体效价增殖功能第1页/共13页实验内容小鼠摘眼球取血、分离血清淋巴细胞转化试验（一）第2页/共13页教学要求掌握小鼠血清的分离掌握淋巴细胞转化试验的基本原理及基本操作第3页/共13页淋巴细胞转化试验(Lymphocyte transformation test)原理原理原理原理 检测方法检测方法检测方法检测方法 操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤 应用应用应用应用第4页/共13页实验分组及材料 器材器材器材器材11酒精棉球酒精棉球酒精棉球酒精棉球若干若干若干若干11无菌纱布块无菌纱布块无菌纱布块无菌纱布块 1 1块块块块/组组组组11无菌平皿无菌平皿无菌平皿无菌平皿1 1块块块块/组组组组11无无无无 菌菌菌菌 吸吸吸吸 头头头头（大大大大、中中中中、小小小小）4 4盒盒盒盒/room/room11无菌无菌无菌无菌9696孔培养板孔培养板孔培养板孔培养板1 1块块块块/组组组组11可调微量加样器可调微量加样器可调微量加样器可调微量加样器4 4套套套套/room/room11细胞计数板细胞计数板细胞计数板细胞计数板1 1套套套套/组组组组11显微镜显微镜显微镜显微镜1 1台台台台/组组组组11EPEP管管管管若干若干若干若干11眼科剪、小镊子眼科剪、小镊子眼科剪、小镊子眼科剪、小镊子4 4套套套套/room/room1.1.细胞培养箱（细胞培养箱（细胞培养箱（细胞培养箱（37 5%CO37 5%CO2 2)11酶标仪酶标仪酶标仪酶标仪11离心机离心机离心机离心机2 2个个个个/roomroom11超净台超净台超净台超净台2 2个个个个/roomroom 动物及试剂动物及试剂动物及试剂动物及试剂11小鼠小鼠小鼠小鼠 2 2只只只只/组组组组(NS,OVA)NS,OVA)11培养液（培养液（培养液（培养液（IMDM)IMDM)无无无无FCS FCS 100ml/room100ml/room11培培培培养养养养液液液液（IMDM)20%FCS IMDM)20%FCS 30ml/room30ml/room11ConAConA（2.5,5,10g/ml)2.5,5,10g/ml)ml/tube ml/tube 11白白白白 细细细细 胞胞胞胞 计计计计 数数数数 液液液液（2%2%冰冰冰冰 醋醋醋醋 酸酸酸酸）2 2瓶瓶瓶瓶/roomroom11MTTMTT（11二甲亚砜（二甲亚砜（二甲亚砜（二甲亚砜（DMSO)DMSO)5ml/5ml/组组组组分组：分组：每组四人，两人一只小鼠，其中一人胸腺，一人脾脏每组四人，两人一只小鼠，其中一人胸腺，一人脾脏第5页/共13页免疫血清分离过程摘眼球取血RT for 2hrsRotation2000rpm for 20minTransfer serum to a new EPDouble diffusionStore at 4ELISAml EP第6页/共13页淋巴细胞转化实验步骤单细胞悬液的制备：1小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。1于超净台内取出脾和胸腺组织(各1/2)，分别放入预先盛有2ml IMDM培养液的平皿内。1将3-4层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用1000lml EP管中。细胞计数：1取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20l，加到盛有980l计数液的EP管中，在显微镜下计数，计数方法见后。1调细胞浓度至1107/ml，ml，设需要的细胞悬液体积为Aml,可按公式：?/mlA=1.51107NOTE:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。第7页/共13页细胞计数板细胞计数板查出四个大方格的总细胞数(X)算出每个大方格的细胞数：Y=X/4每个大方格的体积为3=10-4ml制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y 104稀释倍数(50)4第8页/共13页细胞培养：1按图所示加样。1将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37 5%C02培养箱中，培养48小时。MTT掺入：（隔一天 下午）1在终止培养前2小时，在显微镜下观察细胞转化情况。1每孔内加入MTT（5mg/ml)10l，加完后轻轻搕板，使MTT和细胞混匀。1在37 5%C02培养箱中继续培养2小时，轻轻吸弃上清，（注意不要将孔底部的颗粒物弃出）。1加入100l 二甲亚砜（DMSO)，将颗粒溶解。结果测定：1结果测量：用酶标仪测定光密度值A570nm（用空白孔调零），记录结果。1.结果判定：SI（刺激指数）=Con A刺激孔 A值/对照孔A值第9页/共13页预习内容自讲自评内容：1.细胞因子检测技术 (理论教材P257P258)2.单克隆抗体制备技术 (理论教材P68;实验教材P106-P109)第10页/共13页课次课次自讲内容及讲解时间自讲内容及讲解时间参考教材参考教材备注备注一一（10.610.6）1.1.抗体制备技术。（抗体制备技术。（20min20min）实验教材实验教材P100-P103P100-P103抗抗体体纯纯化化、单单克克隆隆抗抗体体制制备备、基基因因工工程抗体除外。程抗体除外。2.2.免免 疫疫 细细 胞胞 分分 离离 及及 其其 功功 能能 检检 测测。（45min45min）理论教材理论教材P251-P255P251-P255实验教材实验教材P70-P80P70-P80P255:P255:从从NKNK以后除外。以后除外。三三（10.15)10.15)3.3.细胞因子检测技术。（细胞因子检测技术。（45min45min）理论教材理论教材P257P258 P257P258 4.4.单克隆抗体制备技术。（单克隆抗体制备技术。（30min30min）理论教材理论教材P68P68实验教材实验教材P106-P109P106-P109四四（10.20)10.20)5.5.抗原抗体反应的特点、影响因素、抗原抗体反应的特点、影响因素、分类、原理及应用。分类、原理及应用。(45min)(45min)理论教材理论教材P238P238实验教材实验教材P110-P112P110-P112五五（10.22)10.22)6.6.免免疫疫标标记记技技术术的的分分类类、原原理理及及应应用用。（20min20min）理论教材理论教材P244-P251P244-P251实验教材实验教材P133-P147P133-P147酶免疫技术除外。酶免疫技术除外。7.7.酶酶免免疫疫技技术术的的分分类类、原原理理及及应应用用。（20min20min）理论教材理论教材P244P244实验教材实验教材P135P135重点讲述重点讲述ELISAELISA。六六（10.27)10.27)8.8.细胞毒实验的分类、原理、检测细胞毒实验的分类、原理、检测 方法与应用。方法与应用。(25min)(25min)理论教材理论教材P255-P256P255-P256实验教材实验教材P80-P88P80-P88第11页/共13页 两组一块培养板1-3孔加入10%FCS-IMDM 培养液 100 l 4-6孔加入2.5 g/ml的Con A 100 l 7-9孔加入5 g/ml的Con A 100 l 10-12孔加入10 g/ml的Con A 100 l 每孔加入调好的细胞悬液 100 l NOTE:ConA用10%FCS-IMDM培养液配制 1-31-34-64-67-97-910-1210-12A Aspleen cell+spleen cell+10%IMDM10%IMDMspleen cell+spleen cell+ConA 2.5g/ml ConA 2.5g/mlspleen cell+spleen cell+ConA 5g/mlConA 5g/mlspleen Cell+spleen Cell+ConA 10g/ml ConA 10g/mlB Bthymus cell+thymus cell+10%IMDM10%IMDMthymus cell+thymus cell+ConA 2.5g/ml ConA 2.5g/mlthymus cell+thymus cell+ConA 5g/mlConA 5g/mlthymus Cell+thymus Cell+ConA 10g/ml ConA 10g/mlC C spleenspleen cell+cell+10%IMDM10%IMDMspleen cell+spleen cell+ConA 2.5g/ml ConA 2.5g/mlspleenspleen cell+cell+ConA 5g/mlConA 5g/mlspleen Cell+spleen Cell+ConA 10g/ml ConA 10g/mlD D thymusthymus cell+cell+10%IMDM10%IMDMthymus cell+thymus cell+ConA 2.5g/ml ConA 2.5g/mlthymus cell+thymus cell+ConA 5g/mlConA 5g/mlthymus Cell+thymus Cell+ConA 10g/ml ConA 10g/mlN.S.OVAN.S.OVA加加样样方方法法 返回第12页/共13页感谢您的观看！第13页/共13页
