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第 3 章动物细胞与组织培养第1页/共48页动物的细胞与组织培养 定义：从动物体内取出组织或细胞，模拟机体内生理环境，在体外建立无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能的方法。第2页/共48页1 动物细胞培养群体培养（mass mass cultureculture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluenceconfluence）后形成均匀的单细胞层克隆培养（clonal clonal cultureculture）：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。第3页/共48页群体培养（左）和克隆培养（右）第4页/共48页Definitions of Tissue Culture Termscell culture-the maintenance and growing of dispersed cells outside the organism.Secondary cultureCells taken from a primary culture and passed or divided in vitro.These cells have a limited number of divisions or passages.tissue culture-the maintenance of a tissue or fragment in a way that may allow differentiation and preservation of the architecture and/or function monolayer-single layer of cells growing on a surfaceorgan culture-maintenance of tissues,whole or parts of organs in a way that may allow differentiation and preservation of the architecture and/or functionexplant-an excised fragment of an organ which usually retains some degree of tissue architecture第5页/共48页原代培养（primary culture）：即细胞或组织离开机体后的首次培养。primary culture-started from cells,tissues or organs taken directly from an animal传代（passage）：培养的细胞生长到一定的密度后转移到新的容器中培养或需要更换到新的培养液称为传代或传代培养。subculture-the transplantation of cells from one culture to another(passaging)细胞系（cell line）：原代培养物经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代或传代数有限，可称为有限细胞系。如果可以连续传代则称为连续细胞株原代培养细胞成功传代即为细胞系。cell line-arises from the primary culture at the time of the first subculture-finite life spancontinuous cell line-a cell line which has been transformed-infinite life span细胞株（cell strain）：从培养细胞中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。第6页/共48页2 发展历史动物细胞（组织）培养技术起源于动物细胞（组织）培养技术起源于1919世纪所应用的某些世纪所应用的某些胚胎学技术。胚胎学技术。动物细胞（组织）培养的奠基人是美国生物学家动物细胞（组织）培养的奠基人是美国生物学家HarrisonHarrison。在。在19071907年采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养年采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，保持存活了几周时法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，保持存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程。间，并观察到细胞突起的生长过程。Harrison-isolated pieces of frog embryonic tissue known to give rise to nerve fibres-grew them in frog lymph-observed outgrowth of axons over period of weeks in 1907.法国学者法国学者CarrelCarrel功不可没。他功不可没。他19231923年设计的卡氏培养瓶，年设计的卡氏培养瓶，用鸡胚抽提液培养心肌组织取得成功并维持用鸡胚抽提液培养心肌组织取得成功并维持3434年之久年之久,特特别注意到实验中的无菌操作。别注意到实验中的无菌操作。第7页/共48页表三、实验室中常用的几种细胞系细胞系名称细胞系名称细胞类型细胞类型来源来源3T33T3成纤维细胞成纤维细胞小鼠小鼠HeLaHeLa宫颈癌上皮细胞宫颈癌上皮细胞Henrietta Lacks Henrietta Lacks BHK21BHK21成纤维细胞成纤维细胞叙利亚仓鼠叙利亚仓鼠PtKlPtKl上皮细胞上皮细胞袋鼠袋鼠L6L6成肌细胞成肌细胞大鼠大鼠PCI2PCI2嗜铬细胞嗜铬细胞大鼠大鼠SP2SP2浆细胞浆细胞小鼠小鼠SP2SP20 0骨髓瘤浆细胞骨髓瘤浆细胞小鼠小鼠CHOCHO卵巢细胞卵巢细胞中国地鼠中国地鼠Henrietta Lacks,American black,died of cancer of uterine cervix in 1951 第8页/共48页3 应用领域生产单克隆抗体和疫苗。组织与器官再生、培养。动物细胞基因工程第9页/共48页动物细胞培养生产的生物制品动物细胞培养生产的生物制品 （1 1）病 毒 疫 苗：乙 肝 疫 苗(HbsAg)(HbsAg)、脊 髓 灰 质炎疫苗(Polio)(Polio)、狂犬疫苗(Rabies)(Rabies)等。（2 2）非 抗 体 免 疫 调 节 剂：干 扰 素（IFN IFN）、白 细 胞 介 素（IL IL）、B B 细 胞 生 长 因 子 （BCGF BCGF）、巨 噬 细 胞 激 活 因 子（MANMAN）T T 细胞替代因子（TRFTRF）等。（3 3）多肽生长因子：神经生长因子（NGF NGF）、成纤维细胞生长因子（FGFFGF）、表皮生长因 子（EGFEGF）、血清生长因子（SFSF）等。第10页/共48页（4 4）酶类：组织血纤维溶酶原激活剂（t tPA PA）等。（5 5）激素：红细胞生成素（EPOEPO）、促黄体生成素（LHLH）、促滤胞素（FSHFSH）等。（6 6）肿瘤特异性抗原：癌胚抗原（CEACEA）等。（7 7）单克隆抗体（MCAB MCAB）。（8 8）病毒杀虫剂：杆状病毒等。（9 9）皮肤移植：单细胞培养等。第11页/共48页3.1.1 动物细胞的特点问题一与微生物、植物细胞相比，动物细胞有哪些特殊之处？第12页/共48页动物细胞与微生物细胞相比，主要有以下不同：（1 1）动物细胞比微生物细胞）动物细胞比微生物细胞大大，无细胞壁无细胞壁。（2 2）动物细胞倍增时间长，）动物细胞倍增时间长，生长缓慢生长缓慢，易易 受污染受污染。（3 3）培养过程）培养过程需氧量少需氧量少，对机械搅拌或，对机械搅拌或剪剪 切力敏感切力敏感。（4 4）动物细胞间主要以）动物细胞间主要以聚集体形式聚集体形式存在。存在。（5 5）原代细胞一般繁殖）原代细胞一般繁殖5050代代左右即退化左右即退化 死亡。死亡。第13页/共48页第14页/共48页3.1.2 体外培养 原代培养原代培养（亦称初代培养）（亦称初代培养）传代培养传代培养（亦称继代培养）。（亦称继代培养）。第15页/共48页Primary Cultureretention of the 3D shapeoutgrowth and migration of cells第16页/共48页3.1.3 动物细胞（组织）培养的生长特性 体外培养细胞类型第17页/共48页1 1 粘附型细胞粘附型细胞 anchorageanchoragedependentdependent 粘附生长粘附生长是大多数有机体细胞在体内生存和生是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式。粘附有两种含义：一长发育的基本存在方式。粘附有两种含义：一是细胞之间相互接触；二是细胞与细胞外基质是细胞之间相互接触；二是细胞与细胞外基质结合。结合。动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞是必须动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞是必须附壁即附着在固体表面生长，当细胞布满表面附壁即附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生长，这时若取走一片细胞，存留在后即停止生长，这时若取走一片细胞，存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重新布满创表面上的细胞就会沿着表面生长而重新布满创面面,称为称为单层附壁培养单层附壁培养。第18页/共48页细胞贴壁延展过程细胞贴壁延展过程第19页/共48页Contact inhibitionWhen cells contact each other,they cease their growth.Cells arrest in G0 phase of the cell cycle.Transformed cells will continue to proliferate and pile up each other.第20页/共48页体外培养细胞类型（形态）1 成纤维型2 上皮型3 游走型4 多形型第21页/共48页（一）成纤维细胞型细胞（一）成纤维细胞型细胞 FibroblastFibroblast外形与体内外形与体内成纤维成纤维细胞形状细胞形状相似，细胞大致呈相似，细胞大致呈梭形或不梭形或不规则形规则形。前者贴壁后呈长梭。前者贴壁后呈长梭形，圆形细胞核位于中央，形，圆形细胞核位于中央，胞质外伸出胞质外伸出2 23 3个长短不同个长短不同的突起，生长时呈放射状、的突起，生长时呈放射状、漩涡状走向。漩涡状走向。多数细胞之间多数细胞之间排列疏散排列疏散，有，有较大的细胞间隙。有时也相较大的细胞间隙。有时也相互平行排列，成群细胞呈现互平行排列，成群细胞呈现放射状、旋涡状放射状、旋涡状等形式。心等形式。心肌，平滑肌、血管内皮细胞肌，平滑肌、血管内皮细胞的体外培养常呈此类型。的体外培养常呈此类型。第22页/共48页（二）上皮型细胞 Epithelial cell类似上皮细胞的细胞，特类似上皮细胞的细胞，特点是：点是：扁平扁平状，形态较状，形态较为为规则规则，细胞贴壁后呈，细胞贴壁后呈三角形三角形及不规则扁平的及不规则扁平的多角形多角形，中央有扁圆形，中央有扁圆形核，生长时彼此核，生长时彼此紧密紧密连连接成单层细胞。因为相接成单层细胞。因为相互拥挤而呈现互拥挤而呈现“铺路石铺路石状状”。皮肤的表皮细胞、消化道皮肤的表皮细胞、消化道与呼吸道的上皮细胞、与呼吸道的上皮细胞、肺泡上皮细胞、消化腺肺泡上皮细胞、消化腺上皮细胞、血管内皮细上皮细胞、血管内皮细胞等，胞等，HelaHela第23页/共48页（三）游走型细胞（三）游走型细胞 wandering分散生长，一般不连接成片形成群分散生长，一般不连接成片形成群落；细胞胞质常伸出伪足和突起；落；细胞胞质常伸出伪足和突起；在培养器皿壁上生长位置不固定，在培养器皿壁上生长位置不固定，呈活跃的游走和变形运动，速度快呈活跃的游走和变形运动，速度快且方向不规则。且方向不规则。该类细胞不稳定，该类细胞不稳定，外形不规则且不外形不规则且不断变化断变化，当细胞密度增大、连接成，当细胞密度增大、连接成片时，形状类似于成纤维样细胞型片时，形状类似于成纤维样细胞型或上皮细胞型。或上皮细胞型。表现这种细胞形态的主要是单核巨表现这种细胞形态的主要是单核巨噬细胞系统的细胞，如颗粒性白细噬细胞系统的细胞，如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、某些肿瘤细胞等。胞、某些肿瘤细胞等。第24页/共48页（四）多形型细胞 Polymorphic多形型细胞是一些形态上不规则的细胞。多形型细胞不常见，只有某些像神经组织细胞等难以确定其稳定形态的，才可归于多形细胞。体外培养呈现多形型细胞的细胞最常见的是神经元和神经胶质细胞。第25页/共48页影响细胞形态的因素影响细胞形态的因素能够影响细胞形态学特征的主要因素包括：能够影响细胞形态学特征的主要因素包括：血清成分、培养基成分及添加成分、血清成分、培养基成分及添加成分、培养基的酸碱度、气相环境、温度培养基的酸碱度、气相环境、温度等。例如，一些已分化的细胞在有无血清的培等。例如，一些已分化的细胞在有无血清的培养液中生长，形态特征就会有所差异。养液中生长，形态特征就会有所差异。形态会因条件而改变（来源、生长条件和功能状态不同）。形态会因条件而改变（来源、生长条件和功能状态不同）。第26页/共48页 2 非粘附型细胞（悬浮型细胞）体体外外生生长长不不贴贴壁壁，可可在在培培养养液液中中悬悬浮浮生生长长，因此也叫因此也叫悬浮悬浮型细胞。型细胞。一一些些在在体体内内原原本本就就以以悬悬浮浮状状态态生生长长的的细细胞胞或或微微生生物物，当当接接种种于于体体外外环环境境中中也也可可以以以以悬悬浮浮状状态态生生长长。血血液液白白细细胞胞、淋淋巴巴组组织织细细胞胞，某某些些肿肿瘤瘤细细胞胞、杂杂交交瘤瘤细细胞胞、转转化化细细胞胞系系等等都都属属此此类类细细胞胞。这这类类细细胞胞形形态态学学特特点点是是胞胞体体始始终为终为球形球形。第27页/共48页悬浮培养类似微生物的深层培养。由于是悬浮生长，细胞密度一般都较悬浮培养类似微生物的深层培养。由于是悬浮生长，细胞密度一般都较高，培养的效率也高、操作也容易。高，培养的效率也高、操作也容易。这种方法有多方面的优越性，易于大规模生产，便于过程的控制。这种方法有多方面的优越性，易于大规模生产，便于过程的控制。可惜能在悬浮状态下生长的细胞可惜能在悬浮状态下生长的细胞种类有限种类有限，且不太方便观察。，且不太方便观察。第28页/共48页3.2 动物细胞培养 的基本技术第29页/共48页3.2.1 体外培养的条件3.2.1.1 与微生物细胞培养相比动物 细胞培养的特殊性大多数哺乳动物细胞只有大多数哺乳动物细胞只有附着附着在固体或半固体的表面才能生长。在固体或半固体的表面才能生长。动物细胞对于动物细胞对于营养要求更加苛刻营养要求更加苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需要糖或半乳糖外，还需要血清血清。第30页/共48页对于培养环境的适应性更差，对环境极其对于培养环境的适应性更差，对环境极其敏感敏感，包括，包括 pH pH、溶解氧、温度、剪切力、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需严格监控。等都比微生物有更高的要求，一般需严格监控。动物细胞动物细胞生长缓慢生长缓慢，因此培养时间较长。，因此培养时间较长。对环境的影响又比微生物为大，因此常用空气、氧、二氧化碳和氮的混合气体进行对环境的影响又比微生物为大，因此常用空气、氧、二氧化碳和氮的混合气体进行供氧和调节供氧和调节pHpH。第31页/共48页培养条件TemperaturepHDissolved gasNutrients第32页/共48页培养基2020世纪世纪4040年代以后，从事动物组织培养的各国科学家把研究的重点集中在培养基的改造上。年代以后，从事动物组织培养的各国科学家把研究的重点集中在培养基的改造上。19511951年，年，Earle等人开发了供动物细胞体外培养的培养基。等人开发了供动物细胞体外培养的培养基。MediaThe choice of media is cell type specific and often empirical-no all purpose medium.Should provide:nutrients,buffering capacity,isotonic,and be sterile第33页/共48页天然培养基动物血清、组织提取液、鸡胚胎提取液等动物血清、组织提取液、鸡胚胎提取液等优点优点：营养价值高：营养价值高缺点缺点：成分复杂、来源有限、成本较高：成分复杂、来源有限、成本较高小（胎）牛血清小（胎）牛血清蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素、多种生长因子蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素、多种生长因子等成分。等成分。第34页/共48页合成培养基Earle 于1951年首次使用。优点：成分已知、易控制缺点：无法替代一些未知成分解决途径合成培养基中添加小牛血 清，彼此互补第35页/共48页无血清培养基血清培养基的优点血清培养基的优点：含有丰富的利于细胞生长的成分：含有丰富的利于细胞生长的成分血清培养基缺点血清培养基缺点：对后期产物的分离、提纯及检测造成干扰。来源有限、成本较高：对后期产物的分离、提纯及检测造成干扰。来源有限、成本较高无血清培养基无血清培养基：试图全部替代血清成分，尤其是生长因子（例如胰岛素）、激素（例如生长激素）等。：试图全部替代血清成分，尤其是生长因子（例如胰岛素）、激素（例如生长激素）等。第36页/共48页 培养过程图解第37页/共48页细胞系生长过程的3个主要阶段（一）原代（初代）培养期 指从体内取出组织接种培养到第一次传代培养这个阶段，一般持续1-4周。在这个阶段，细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。组织和细胞刚离体，生物学特性变化不大，具有二倍体遗传特性，最接近和反映体内生长特性，很适合做药物测试，细胞分化等实验研究。第38页/共48页（二）传代期 原代培养细胞一经传代后便称为细胞系，在全生命期中该阶段的持续时间最长。一般情况下，当传代10-5010-50次后，细胞增殖逐渐缓慢，以致完全停止。第39页/共48页（三）衰退期 该阶段细胞仍然生存，但是增殖很慢或不增殖。细胞形态轮廓增强，最后开始衰退凋亡。第40页/共48页n 动物细胞培养过程生长曲线第41页/共48页Kinetics of growth phaseLogarithmic scale!Cells reach confluence(cover all available surface)每代细胞的生长曲线：潜伏期对数生长期停止期（平台期）第42页/共48页 每代贴附生长细胞的生长过程分为以下几个时期游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）第43页/共48页游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）第44页/共48页潜伏期:此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性第45页/共48页小结动物细胞培养的特点无血清培养基在实验研究中的特殊意义细胞类型及生长特点细胞系生长阶段和各阶段特点细胞系生长曲线及各期特点第46页/共48页THANKS!第47页/共48页感谢您的观看！第48页/共48页