基因工程的工具酶57297.pptx

3 基因工程工具酶基因工程工具酶Instrumentalenzymeofgeneengineering掌握：工具酶的特性和用途掌握：工具酶的特性和用途掌握：工具酶的特性和用途掌握：工具酶的特性和用途 1.1.1.1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 2.DNA 2.DNA 2.DNA 2.DNA连接酶连接酶连接酶连接酶 3.DNA 3.DNA 3.DNA 3.DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 4.DNA 4.DNA 4.DNA 4.DNA修饰酶修饰酶修饰酶修饰酶重点：限制性核酸内切酶、重点：限制性核酸内切酶、重点：限制性核酸内切酶、重点：限制性核酸内切酶、DNADNADNADNA连接酶特性和用途连接酶特性和用途连接酶特性和用途连接酶特性和用途难点：限制性核酸内切酶、难点：限制性核酸内切酶、难点：限制性核酸内切酶、难点：限制性核酸内切酶、DNADNADNADNA连接酶特性和用途连接酶特性和用途连接酶特性和用途连接酶特性和用途 应用于基因工程的各种酶的总称应用于基因工程的各种酶的总称，包括核酸序列，包括核酸序列分析、标记探针、载体构建、目的基因选取、重组的、分析、标记探针、载体构建、目的基因选取、重组的、DNADNA制备等程序中所需要的酶类。主要是制备等程序中所需要的酶类。主要是限制性核酸限制性核酸内切酶内切酶和和DNADNA连接酶连接酶，末端转移酶末端转移酶、单链核酸酶单链核酸酶和和反反转录酶转录酶。所以把这些酶称为所以把这些酶称为“基因工程工具酶基因工程工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。改造、优化、而产生的生物工程产品。3.1 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 50年代后年代后Luria和和Human(1952)Bertani和和Weigle(1953)发现发现细菌的细菌的“限制限制”现象现象：Phage（k）感染感染E.coli k不感染不感染E.coliB(E.coliB限制限制（k）)仍有少量仍有少量(K)可在可在E.coliB中生存，是因中生存，是因E.coliB对对(K)DNA进行了修饰。进行了修饰。E.coli BE.coli B修饰修饰(k)(k)*感染感染E.coli(B)-E.coli(B)-细菌如何对细菌如何对噬菌体进行限制和修饰噬菌体进行限制和修饰?3.1.1细细菌菌的的限限制制-修修饰饰系系统统细菌的限制细菌的限制修饰系统修饰系统 1962年年W.Arber(瑞士瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是发现，寄主对噬菌体的修饰是在在Phage的的DNA上。上。1965年，年，Arber发现修饰与发现修饰与的降解有关，提出：细的降解有关，提出：细胞中存在位点特异性胞中存在位点特异性限制酶限制酶和特异性和特异性甲基化酶甲基化酶，即，即细胞中有限制细胞中有限制修饰系统修饰系统(R-MRestriction-modificationsystem)。R-M系统是细菌安内御外的积极措施。系统是细菌安内御外的积极措施。限制限制修饰的酶学假说修饰的酶学假说(B)(B)酶切位点酶切位点不被修饰不被修饰噬菌体噬菌体DNA被切割被切割酶切位点酶切位点被修饰被修饰Methylation基因组基因组DNA不被切割不被切割n n识别双链识别双链识别双链识别双链DNADNADNADNA分子中的特定序列，并切割分子中的特定序列，并切割分子中的特定序列，并切割分子中的特定序列，并切割DNADNADNADNA双链双链双链双链n n主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNADNADNADNA的入侵的入侵的入侵的入侵限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶1968年，年，Meselson和和Yuan从大肠杆菌从大肠杆菌K和和B中发现了中发现了I型限制性型限制性核酸内切酶核酸内切酶1970年，年，Smith和和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶HindII，使得，使得DNA分子的体外精确切割成分子的体外精确切割成为可能。为可能。1978年，年，W.Arber、H.O.Smith(美美)，Nathans(美美)因发现限制因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔诺贝尔奖金。奖金。截止到目前为止，已经分离出截止到目前为止，已经分离出400余种余种II类酶，搞清识别位点类酶，搞清识别位点的有的有300种，商品化的约有种，商品化的约有100种，而实验室常用的有种，而实验室常用的有20种。种。3.1.2限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶的分类1.1.限制修饰活性限制修饰活性2.2.内切酶的蛋白内切酶的蛋白 质结构质结构3.3.限制辅助因子限制辅助因子4.4.切割位点切割位点5.5.特异性切割特异性切割6.6.基因克隆中基因克隆中I I 型型单一多功能的酶单一多功能的酶3 3种不同亚基种不同亚基ATPATP、MgMg2+2+和和S-S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸距特异性位点距特异性位点1000bp1000bp不是不是无用无用II II 型型限制酶和修饰酶分开限制酶和修饰酶分开单一成分单一成分MgMg2+2+特异性位点及其附近特异性位点及其附近是是非常有用非常有用III III 型型双功能酶双功能酶2 2种亚基种亚基ATPATP、MgMg2+2+和和S-S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸特异性位点特异性位点3 3端端24-26bp24-26bp处处是是有用有用3.1.3II型限制性核酸内切酶的特点型限制性核酸内切酶的特点1、识别位点的特异性、识别位点的特异性:每种酶都有其特定的每种酶都有其特定的DNA识别识别位点，通常是由位点，通常是由48个核苷酸组成的特定序列个核苷酸组成的特定序列（靶序（靶序列）列）例如：例如：Hind5-GTPyPuAC3Mbo5-GATC3GANC 2 2、识别序列的对称性、识别序列的对称性、识别序列的对称性、识别序列的对称性:靶序列通常具有双重旋转靶序列通常具有双重旋转靶序列通常具有双重旋转靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构回文结构回文结构回文结构。33、切割位点的规范性、切割位点的规范性、切割位点的规范性、切割位点的规范性:双链双链双链双链DNADNA被酶切后，分布被酶切后，分布被酶切后，分布被酶切后，分布在两条链上的在两条链上的在两条链上的在两条链上的切割位点旋转对称切割位点旋转对称切割位点旋转对称切割位点旋转对称（可形成粘性末（可形成粘性末（可形成粘性末（可形成粘性末端或平末端的端或平末端的端或平末端的端或平末端的DNADNA分子）。分子）。分子）。分子）。4、识别序列中的碱基被甲基化修饰后会影响部分、识别序列中的碱基被甲基化修饰后会影响部分酶的切割作用效果。酶的切割作用效果。3.1.4限制性内切酶的切割方式限制性内切酶的切割方式限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀分子手术刀分子手术刀”“切哪里切哪里”?磷酸二酯键磷酸二酯键ATGCATGC脱氧核苷酸链脱氧核苷酸链磷酸二酯键磷酸二酯键基因的剪刀基因的剪刀限制性内切酶（简称限制酶）限制性内切酶（简称限制酶）怎样切？怎样切？例：大肠杆菌例：大肠杆菌(E.coli)(E.coli)的一种限制酶的一种限制酶能能识别识别GAATTCGAATTC序列序列，并在，并在G G和和A A之间切开。之间切开。限制酶限制酶限制限制限制限制酶酶酶酶几种几种IIII型限制性核酸内切酶的酶切位点型限制性核酸内切酶的酶切位点PstIProvindencia stuartii 164 CTGCAGGACGTCHaemophilus influenzae Rd 什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？被限制酶切开的被限制酶切开的被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNADNADNA两条单链的切口，带有两条单链的切口，带有两条单链的切口，带有两条单链的切口，带有几个几个几个几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸伸出的核苷酸伸出的核苷酸，它们之间正好，它们之间正好，它们之间正好，它们之间正好互补配对互补配对互补配对互补配对，这，这，这，这样的切口叫样的切口叫样的切口叫样的切口叫黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端。3333粘性末端；粘性末端；粘性末端；粘性末端；5555粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端53练一练练一练CB5 5、原核、原核 6 6、核苷酸、核苷酸 7 7、磷酸二酯键、磷酸二酯键 8 8、黏性末端、黏性末端 9 9、平末端、平末端3.1.5限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名-1973Smith和和Nathams1、寄主菌属名寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli表示为表示为Eco,流感嗜血菌流感嗜血菌Haemophilus influenzae表表示为示为Hin；2、用、用1个正体个正体字母表示字母表示菌株菌株的类型，比如的类型，比如EcoR、Hind，若酶存，若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子；在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子；3、该菌株（种）中发现的不同的酶按照顺序以罗马字母编号、该菌株（种）中发现的不同的酶按照顺序以罗马字母编号I,II,III等。等。3.1.6同裂酶和同尾酶同裂酶和同尾酶n n同裂酶同裂酶（isoschizomer）：是指来源不同的）：是指来源不同的但却具有但却具有相同的识别序列相同的识别序列，切割，切割DNA后后产产生相同末端（或不同末端）生相同末端（或不同末端）的一组限制酶。的一组限制酶。Kpn Kpn I I 5GGTAC C35GGTAC C3Asp Asp 718 718 5GGTAC C3 5GGTAC C3Xma Xma I I 55 C CCGGG C CCGGG 33Sma Sma I I 55 CCC GGG CCC GGG 33同序同切同序同切同序异切同序异切n n同尾酶同尾酶同尾酶同尾酶（isocaudamerisocaudamer）：是指来源不同、）：是指来源不同、）：是指来源不同、）：是指来源不同、识别序识别序识别序识别序列也不同列也不同列也不同列也不同但切割后产生但切割后产生但切割后产生但切割后产生相同的粘性末端相同的粘性末端相同的粘性末端相同的粘性末端一类限制一类限制一类限制一类限制酶。酶。酶。酶。经同尾酶消化的经同尾酶消化的DNADNA末端连接示意图末端连接示意图5XXXXGGATCCXXXXXX33XXXXCCTAGGXXXXXX5BamHI5XXXXGGATCCXXXXXX33XXXXCCTAGGXXXXXX55XXXXAGATCTXXXXXX33XXXXTCTAGAXXXXXX5BglII5XXXXAGATCTXXXXXX33XXXXTCTAGAXXXXXX55XXXXAGATCCXXXXXX33XXXXTCTAGGXXXXXX55XXXXAGATCCXXXXXX33XXXXTCTAGGXXXXXX5BamHIBglII3.1.7限制性内切酶识别序列出现的几率及限制性内切酶识别序列出现的几率及酶切片段的估算酶切片段的估算3.1.8影响限制性内切酶活性的因素影响限制性内切酶活性的因素n nDNA纯度纯度n nDNA的甲基化程度的甲基化程度n nDNA的分子结构的分子结构n n限制性核酸内切酶的缓冲液限制性核酸内切酶的缓冲液n n酶切消化反应的时间和温度酶切消化反应的时间和温度n n反应体积和甘油浓度反应体积和甘油浓度一个酶单位（一个酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为缓冲液和反应温度，通常为37）下，）下，1min内引起内引起1mol底物发生反应的底物发生反应的酶量。酶量。酶单位的定义和影响酶活性的因素酶单位的定义和影响酶活性的因素Buffer(10X)2.0 LWater16.5 LDNA1.0 LEnzyme0.5 LVolume20.0 L酶切反应的基本步骤酶切反应的基本步骤电泳电泳紫外分析紫外分析371h加反应液加反应液CKM1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT酶量的确定：酶量的确定：2-3 倍才能保证完全消化；DNA识别位点的密度识别位点的密度有关有关酶切操作注意事项酶切操作注意事项n n选择正确的酶选择正确的酶选择正确的酶选择正确的酶n nDNADNA的纯度和浓度的纯度和浓度的纯度和浓度的纯度和浓度n n反反反反应应应应体体体体系系系系甘甘甘甘油油油油的的的的量量量量5%5%（酶酶酶酶保保保保存存存存在在在在5050甘甘甘甘油油油油中中中中，故故故故所所所所加加加加酶酶酶酶液体积最多为酶切反应总体积的液体积最多为酶切反应总体积的液体积最多为酶切反应总体积的液体积最多为酶切反应总体积的1/101/10）。）。）。）。n n酶保存在酶保存在酶保存在酶保存在-20-200 0C C；使用时在；使用时在；使用时在；使用时在冰浴冰浴冰浴冰浴上操作。上操作。上操作。上操作。n n反应体系各成分都加完后，反应体系各成分都加完后，反应体系各成分都加完后，反应体系各成分都加完后，最后加酶最后加酶最后加酶最后加酶。n n每次取酶液用新的枪头，防止交叉污染。每次取酶液用新的枪头，防止交叉污染。每次取酶液用新的枪头，防止交叉污染。每次取酶液用新的枪头，防止交叉污染。n n防止任何可能引起酶蛋白变性的因素，如：气泡、去污剂防止任何可能引起酶蛋白变性的因素，如：气泡、去污剂防止任何可能引起酶蛋白变性的因素，如：气泡、去污剂防止任何可能引起酶蛋白变性的因素，如：气泡、去污剂星活性（星活性（staractivity）指限制性内切酶指限制性内切酶在非标准条件下在非标准条件下，对与识别序，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的异性的DNA片段的现象。片段的现象。易产生星活性的内切酶用易产生星活性的内切酶用*标记。如：标记。如：EcoRI*造成星活性参数造成星活性参数甘油浓度甘油浓度12-20%，酶与，酶与DNA比例，离子强度，比例，离子强度，45%聚乙二醇聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，有机溶剂，8%二甲基亚枫，二甲基亚枫，二价阳离子，二价阳离子，12%乙醇。乙醇。限制性内切酶的应用限制性内切酶的应用1、重组、重组DNA前的切割前的切割2、构建新质粒、构建新质粒3、构建物理图谱、构建物理图谱4、DNA分子杂交分子杂交5、制备、制备DNA探针探针6、亚克隆以用作序列分析、亚克隆以用作序列分析7、基因定位，、基因定位，DNA同源性研究。同源性研究。pBR322物理图谱物理图谱4363练习题练习题n n为了绘制长为为了绘制长为为了绘制长为为了绘制长为3.0kb3.0kbBamBamHH限制性片段的限制性图谱，分别用限制性片段的限制性图谱，分别用限制性片段的限制性图谱，分别用限制性片段的限制性图谱，分别用EcoREcoR、HpaHpa、EcoEcoRR+Hpa Hpa 消化这一片段的三个样品，然后通过消化这一片段的三个样品，然后通过消化这一片段的三个样品，然后通过消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离凝胶电泳分离凝胶电泳分离凝胶电泳分离DNADNA片段，溴化乙锭染色后观察片段，溴化乙锭染色后观察片段，溴化乙锭染色后观察片段，溴化乙锭染色后观察DNADNA带型。请根据这带型。请根据这带型。请根据这带型。请根据这些结果绘制一个限制性图谱，要标明些结果绘制一个限制性图谱，要标明些结果绘制一个限制性图谱，要标明些结果绘制一个限制性图谱，要标明EcoEcoRR和和和和HpaHpa 识别位点间的识别位点间的识别位点间的识别位点间的相对位置，以及它们之间的距离（相对位置，以及它们之间的距离（相对位置，以及它们之间的距离（相对位置，以及它们之间的距离（kbkb）。）。）。）。EcoEcoRRHpaHpa EcoEcoR R+Hpa Hpa 1.7kb0.9kb0.4kb1.6kb1.4kb1.2kb0.9kb0.4kb0.5kb3.2DNA连接酶连接酶 环形环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种连接这种Nick的酶存在。的酶存在。NickNick1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化在化在2条条DNA链之间形成链之间形成磷酸二酯键磷酸二酯键的酶的酶DNA连接连接酶（酶（ligase）。DNA连接酶连接酶：由大肠杆菌基因组由大肠杆菌基因组DNA编码，以编码，以NAD+作为能源辅助因子。作为能源辅助因子。；只能连接粘性末端T4DNA连接酶：连接酶：由大肠杆菌由大肠杆菌T4噬菌体噬菌体DNA编编码，以码，以ATP作为能源辅助因子。作为能源辅助因子。1970年：容易制备，而且可以连接平末端年：容易制备，而且可以连接平末端DNA分分子及单链子及单链DNA(RNA)分子，所以在基因克隆中应分子，所以在基因克隆中应用广泛。用广泛。DNA连接酶作用的特点连接酶作用的特点A.A.连接的两条链必须分别具有连接的两条链必须分别具有 33端自由羟基端自由羟基（-OHOH）和）和5 5 端磷酸基团端磷酸基团（-P-P），而且只有这两个基），而且只有这两个基团彼此相邻时才能进行连接反应；团彼此相邻时才能进行连接反应；B.B.在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗耗能过程能过程，因此连接反应必须有能量分子的参与，通，因此连接反应必须有能量分子的参与，通常有两种能量分子，即常有两种能量分子，即ATPATP和和NAD+NAD+。是两条链是两条链因此不能将两条单链连接起来或使单链因此不能将两条单链连接起来或使单链因此不能将两条单链连接起来或使单链因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。环化起来。环化起来。环化起来。OH P OH P 是相邻的是相邻的因此不能封闭因此不能封闭因此不能封闭因此不能封闭gapgap，只能封闭，只能封闭，只能封闭，只能封闭nick.nick.gapNONickOKDNA 连接酶连接的作用机制连接酶连接的作用机制E(E(酶酶酶酶)ATPEATPEAMPAMPppippiE(E(酶酶酶酶)NADENADEAMPAMPNMNNMN E EAMPAMPDNADNADNADNAAMPAMPE EDNADNA上上上上的的的的33OHOH对对对对被被被被活活活活化化化化的的的的磷磷磷磷原原原原子子子子进进进进行行行行亲亲亲亲核核核核攻攻攻攻击击击击，形形形形成成成成磷磷磷磷酸酸酸酸二二二二酯酯酯酯键，同时释放出键，同时释放出键，同时释放出键，同时释放出AMPAMP。DNA连接反应的条件连接反应的条件4 过夜加反应液 连接反应最佳温度为连接反应最佳温度为3737，但是此时粘性末端间氢键结合不，但是此时粘性末端间氢键结合不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，EcoRI EcoRI 粘性末端连接粘性末端连接部位只有部位只有4 4个碱基对，很容易断开。所以个碱基对，很容易断开。所以通常在通常在4-154-15连接。连接。影响连接效率的因素有：影响连接效率的因素有：A.A.温度（最主要的因素）温度（最主要的因素）B.ATPB.ATP的浓度的浓度(10 M-1 M)C.C.连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）D.D.反应时间（通常连接过夜）反应时间（通常连接过夜）E.E.插入片段和载体片段的摩尔比插入片段和载体片段的摩尔比粘性末端粘性末端DNA片段的连接片段的连接NickNick平末端平末端DNA片段的末端加尾连接法片段的末端加尾连接法33553355末端核苷酸转移酶末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP33553355AAAAATTTTDNADNA聚合酶聚合酶和和T4DNAT4DNA连接酶连接酶 同聚物加尾法同聚物加尾法用用5 5 末端特异的核酸外切酶处理末端特异的核酸外切酶处理DNADNA片断片断在在A A和和B B分别中加入分别中加入dATPdATP和和dTTPdTTP同聚物尾巴同聚物尾巴10401040个碱基个碱基平末端平末端DNA片段加接头连接法片段加接头连接法 衔接物衔接物(linker)(linker)，是有人工化学合成的一段是有人工化学合成的一段10-1210-12个核苷酸个核苷酸的的DNADNA双链，其中包含有双链，其中包含有1 1个或几个限制性酶切位点。使用时只须个或几个限制性酶切位点。使用时只须将衔接物和目的片段的将衔接物和目的片段的55端用端用多核苷酸激酶多核苷酸激酶处理使之磷酸化，处理使之磷酸化，然后用然后用T4DNAT4DNA连接酶进行连接，就可获得能产生粘性末端的连接酶进行连接，就可获得能产生粘性末端的DNADNA片片段。段。CCGAATTCGGGGCTTAAGCC磷酸化磷酸化CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHOHPPPOHOHT4连接酶连接酶CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHPOHEcoRICCGAATTCGGGGCTTAAGCCAATTCGGGCCCCGGGCTTAA接头接头载体去磷防止自连的应用示例载体去磷防止自连的应用示例POHPOHOHOHOHOHPOHPOHOHOHOHOH连接酶连接酶连接酶连接酶连接酶连接酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶2Pi寄主修复缺口寄主修复缺口载体自连或产载体自连或产生二聚体等生二聚体等双衔接物连接双衔接物连接法的基本程序法的基本程序cDNA链的合成链的合成通过通过DNA聚合酶合成第二链聚合酶合成第二链加入加入SalI衔接物衔接物SI核酸酶作用后的末端单链突出序列，核酸酶作用后的末端单链突出序列，由由Klenow补齐，加入第二衔接物补齐，加入第二衔接物EcolI衔接物缺点衔接物缺点 在用在用DNA衔接物连接法时，如果待克衔接物连接法时，如果待克隆隆DNA的片断或基因内部，含有与所加衔的片断或基因内部，含有与所加衔接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因切断。切断。DNA接头（接头（adapter）连接法：）连接法：19781978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的。年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的。年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的。年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的。它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对体分子。对体分子。对体分子。对DNADNA接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端末端末端末端5-P5-P，暴露出，暴露出，暴露出，暴露出5-OH5-OH，不能产生稳定的二聚体分子。，不能产生稳定的二聚体分子。，不能产生稳定的二聚体分子。，不能产生稳定的二聚体分子。DNA接头接头DNA接头连接法接头连接法1.大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I2.Klenow片段片段3.T4DNA聚合酶聚合酶4.T7DNA聚合酶聚合酶5.逆转录酶（反转录酶）逆转录酶（反转录酶）6.TaqDNA聚合酶聚合酶3.3DNA聚合酶聚合酶Kornberg1956年首先从大肠杆菌年首先从大肠杆菌E.Coli 细胞中分离出来的。细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括它是一种多功能性的酶，包括3 3种不同的酶活力：种不同的酶活力：A.5-3聚合酶活性聚合酶活性以双链以双链DNA为模板，催化单核苷酸结合到引为模板，催化单核苷酸结合到引物的物的3末端，并不断延伸。末端，并不断延伸。B.5-3外切酶活性外切酶活性将双链将双链DNA中游离的中游离的5末端逐个切去。末端逐个切去。C.3-5外切酶活性外切酶活性将游离的双链或单链将游离的双链或单链DNA的的3端降解。不过端降解。不过对于双链的降解可被对于双链的降解可被5-3的多聚活性所抑制。的多聚活性所抑制。大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I（E.ColiDNApolI）大肠杆菌三种大肠杆菌三种DNA聚合酶特性比较聚合酶特性比较大肠杆菌聚合酶大肠杆菌聚合酶的应用示例的应用示例n n缺口平移：缺口平移：双链双链DNADNA的单链缺口在的单链缺口在DNADNA聚合酶聚合酶的的5-35-3外切作用下，外切作用下，从缺口的从缺口的55端逐步水解核苷酸时，酶的聚合活性则利用缺口的端逐步水解核苷酸时，酶的聚合活性则利用缺口的33端游端游离羟基逐个加上相应的单核苷酸，使得缺口向下游移动。离羟基逐个加上相应的单核苷酸，使得缺口向下游移动。内切酶内切酶大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的三种用途的三种用途A.制备制备DNA探针探针利用其利用其3-5的外切酶活性及其聚合酶活性。的外切酶活性及其聚合酶活性。B.用于用于DNA连接后的大缺口填充连接后的大缺口填充利用利用5-3的聚合酶活性。的聚合酶活性。C.用于用于DNA的序列分析的序列分析利用利用5-3的聚合酶活性。的聚合酶活性。Klenow片段片段Klenow片段片段大肠杆菌聚合酶大肠杆菌聚合酶I I全酶经全酶经枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶处理后产生处理后产生的大片段酶分子，它仍然有的大片段酶分子，它仍然有5353的聚合酶活性和的聚合酶活性和3 3 5 5 的的核酸外切酶活性，但失去了核酸外切酶活性，但失去了5353的外切酶活性。的外切酶活性。Klenow片段的主要用途片段的主要用途A.A.修补限制性酶消化修补限制性酶消化DNADNA形成的形成的33隐蔽末端隐蔽末端B.B.标记标记DNADNA片段的末端片段的末端C.C.cDNAcDNA克隆中第二链克隆中第二链cDNAcDNA的合成的合成D.D.DNADNA序列的测定序列的测定GAACTTAAT4DNA聚合酶的特点聚合酶的特点T T4 4DNADNA聚合酶聚合酶 从从T4T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，它噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，它和和KlenowKlenow片段一样具有片段一样具有5353的聚合酶活性和的聚合酶活性和3 5 3 5 的的核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I I 的活性的活性高高200200倍。倍。特别是，特别是，T4DNAT4DNA聚合酶还有第三种活力聚合酶还有第三种活力取代反应：取代反应：如果反应体系中仅存在一种如果反应体系中仅存在一种dNTPdNTP，这时，这时T4DNAT4DNA聚合酶就会表现出聚合酶就会表现出3 3 5 5 外切酶活力，从双链外切酶活力，从双链DNADNA的的33开始降解，直到露出和开始降解，直到露出和缺乏的那中缺乏的那中dNTPdNTP互补的碱基，然后就在此位置发生合成和取代反互补的碱基，然后就在此位置发生合成和取代反应。应。CGTCGCGCAGCGCGTGCAGCGdTTPMg+CGGCAGCGdTTPMg+T4DNA聚合酶的用途聚合酶的用途1.1.以取代反应标记延伸末端（以取代反应标记延伸末端（33末端）或平头末末端）或平头末 端的双链端的双链DNADNA片段片段2.2.用于用于DNADNA序列分析序列分析T7DNA聚合酶聚合酶1000倍倍逆转录酶逆转录酶Reversetranscriptase逆转录酶是逆转录酶是 一种可以有效地将一种可以有效地将mRNAmRNA转录成为转录成为DNADNA的酶，其产物称的酶，其产物称为为cDNA(complementary DNA).cDNA(complementary DNA).实际上，它也是一种实际上，它也是一种RNARNA依赖的依赖的DNADNA聚合酶。聚合酶。逆转录酶首先是逆转录酶首先是19701970年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。这两个课题组的论文都发在了同一期的这两个课题组的论文都发在了同一期的NatureNature杂志上。杂志上。主要用途是主要用途是 将将mRNAmRNA转录成转录成cDNAcDNA以制备基因片段。以制备基因片段。TaqDNA聚合酶和聚合酶和PCR 53变性变性 3553引物引物35复性复性535335引物引物3553延伸延伸533535 总结总结1.碱性磷酸酶碱性磷酸酶2.核酸外切酶核酸外切酶3.核酸酶核酸酶S1（nucleaseS1）4.DNase5.RNase6.T4多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶7.末端转移酶（末端转移酶（terminaltransferase）3.4其他其他DNA修饰酶修饰酶碱性磷酸酶的特性碱性磷酸酶的特性 从从细菌细菌中分离的碱性磷酸酶简称中分离的碱性磷酸酶简称BAP（BacterialAlkalinePhosphatase），从），从小牛肠小牛肠中分离的简称中分离的简称CAP（CalfAlkalinePhosphatase）.其主要功能是将其主要功能是将DNA或或RNA5端的磷酸切除。端的磷酸切除。其主要用途有：其主要用途有：A、在用、在用32P标记标记DNA5端之前，去除端之前，去除5端的磷酸；端的磷酸；B、在、在DNA重组技术中，去除重组技术中，去除DNA片段的片段的5磷酸，防磷酸，防止载体的自身环化。止载体的自身环化。载体去磷防止自连的应用示例载体去磷防止自连的应用示例-32PATPATP5POH3532POH33HOP53HO32P5 III 5POH35HOOH35POH33HOP53HOOH53HOP5碱性磷酸酶碱性磷酸酶(I)与磷酸激酶与磷酸激酶(II)活性活性 磷酸激酶的交换反应磷酸激酶的交换反应T4多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶1.催化反应类型催化反应类型1)激酶活性（激酶活性（5-磷酸化酶）：可将磷酸化酶）：可将ATP中的中的位的磷酸位的磷酸基转移到基转移到ss-DNA，ds-DNA和和RNA分子的分子的5-羟基端，羟基端，在这反应过程中可有两种方式进行（在这反应过程中可有两种方式进行（pH7.5-8）.转移反应；转移反应；.交换反应交换反应2)3-磷酸酶活性（磷酸酶活性（pH5-6）2.用途用途1)5-端末端标记端末端标记2)分子克隆过程中以获得分子克隆过程中以获得5-磷酸基末端，便于连接酶反磷酸基末端，便于连接酶反应应核酸酶核酸酶SI的特性的特性 这是一种从米曲霉（这是一种从米曲霉（Aspergillus oryzae）中分）中分离的可以降解单链离的可以降解单链DNA或或RNA的外切酶的外切酶。其主要用途有：其主要用途有：A、在、在cDNA合成过程中，切开合成过程中，切开cDNA的发夹末端；的发夹末端；B、载体构建过程中，切去、载体构建过程中，切去DNA片段的单链尾巴，片段的单链尾巴，形成平末端结构。形成平末端结构。发夹结构的切除发夹结构的切除单链尾巴的切除单链尾巴的切除末端转移酶的特性末端转移酶的特性l末末端端转转移移酶酶是是一一类类不不依依赖赖于于DNA模模板板的的DNA聚聚合酶。合酶。l该该类类酶酶可可以以在在没没有有模模板板链链存存在在的的情情况况下下，将将核核苷苷酸酸连连接接到到DNA的的在在3羟羟基基，特特别别是是对对于于平平末末端的双链端的双链DNA末端加尾十分有效。末端加尾十分有效。l最最常常见见的的用用途途是是在在酶酶切切产产生生的的平平末末端端加加尾尾以以便便于创造粘性的互补末端。于创造粘性的互补末端。平末端平末端DNA片段的末端加尾连接法片段的末端加尾连接法3.5核酸探针的标记核酸探针的标记(gene probe)n n核酸分子探针核酸分子探针是指用放射性核素或其他标是指用放射性核素或其他标记物标记的，能与特定的靶分子发生特异记物标记的，能与特定的靶分子发生特异性相互作用的性相互作用的DNA或或RNA片段。片段。分类分类n n基因组基因组DNA探针；病毒探针；病毒DNA等等n ncDNA探针（最常用）探针（最常用）n n寡核苷酸探针：寡核苷酸探针：10-50bpn nRNA探针探针探针的标记物探针的标记物n n理想的标记物：理想的标记物：理想的标记物：理想的标记物：敏感度高；特异性强；不影响探敏感度高；特异性强；不影响探敏感度高；特异性强；不影响探敏感度高；特异性强；不影响探针分子的主要理化特性；标记、检测方法简单、针分子的主要理化特性；标记、检测方法简单、针分子的主要理化特性；标记、检测方法简单、针分子的主要理化特性；标记、检测方法简单、保存时间长；对环境无污染、对人体无损害；价保存时间长；对环境无污染、对人体无损害；价保存时间长；对环境无污染、对人体无损害；价保存时间长；对环境无污染、对人体无损害；价格低廉。格低廉。格低廉。格低廉。分类分类分类分类n n放射性标记物放射性标记物放射性标记物放射性标记物n n非放射性标记物非放射性标记物非放射性标记物非放射性标记物 将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。n n 常用于标记探针的标识物：常用于标记探针的标识物：同位素同位素：3232P P ,35 35S S ,3 3H-dNTPH-dNTP等；等；非同位素非同位素：地高辛：地高辛-dNTP-dNTP，生物素，生物素-dNTP-dNTP。缺口平移或切口平移缺口平移或切口平移Nick TranslationOHpOH+PPDNAdNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTP Bio-dNTP随机引物标记探针随机引物标记探针53553DNA32p-dNTP,Bio-Dntp6bp primerKlenow,dNTP变性变性-复姓复姓末端标记法末端标记法n nT4多核苷酸激酶法多核苷酸激酶法nn9 9、静夜四无邻，荒居旧业贫。、静夜四无邻，荒居旧业贫。3 3月月-23-233 3月月-23-23Wednesday,March 22,2023Wednesday,March 22,2023nn1010、雨中黄叶树，灯下白头人。、雨中黄叶树，灯下白头人。03:13:0003:13:0003:13:0003:13:0003:1303:133/22/2023 3:13:00 AM3/22/2023 3:13:00 AMnn1111、以我独沈久，愧君相见频。、以我独沈久，愧君相见频。3 3月月-23-2303:13:0003:13:0003:1303:13Mar-23Mar-2322-Mar-2322-Mar-23nn1212、故人江海别，几度隔山川。、故人江海别，几度隔山川。03:13:0003:13:0003:13:0003:13:0003:1303:13Wednesday,March 22,2023Wednesday,March 22,2023nn1313、乍见翻疑梦，相悲各问年。、乍见翻疑梦，相悲各问年。3 3月月-23-233 3月月-23-2303:13:0103:13:0103:13:0103:13:01March 22,2023Marc