研究生课时色谱技术发展及应用.pptx
化学学科化学学科合成化学合成化学分析化学分析化学理论与计算化学理论与计算化学仪器分析仪器分析现代分离方法现代分离方法电化学分析电化学分析光谱分析光谱分析CELCGC知识内容立足点知识内容立足点第1页/共78页经典色谱法经典色谱法Chromatography1905年俄国植物学家M.G.茨维特柱色谱纸色谱薄层色谱一、色谱法的发展一、色谱法的发展MichaelTswett(1872-1919),aRussianbotanist,discoveredthebasicprinciplesofcolumnchromatography.Heseparated plant pigmentsbyelutingamixtureofthepigments on a column ofcalcium carbonate.Thevariouspigmentsseparatedintocoloredbands;hence the namechromatography.石油醚第2页/共78页现代色谱法现代色谱法1952年气相色谱分析法NationalInstituteforMedicalResearchLondon,UnitedKingdomMartinAJPRowettResearchInstituteBucksburn(Scotland),UnitedKingdomSyngeRLM第3页/共78页色谱法的发展历史色谱法的发展历史年代年代发明者发明者发明的色谱方法或重要应用发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱色谱概念概念1931Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分离用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和和g-胡萝卜素胡萝卜素1938Izmailov,Shraiber最先使用最先使用薄层色谱薄层色谱法法1938Taylor,Uray用用离子交换色谱离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素法分离了锂和钾的同位素1941Martin,Synge提出色谱提出色谱塔板理论塔板理论；发明液；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）流动相（即气相色谱）1944Consden等等发明了发明了纸色谱纸色谱1949Macllean氧化铝中加淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段氧化铝中加淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段1952Martin,James从理论和实践方面完善了从理论和实践方面完善了气气-液分配色谱液分配色谱法法1956VanDeemter等等提出色谱提出色谱速率理论速率理论，并应用于气相色谱，并应用于气相色谱1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世1958Golay发明毛细管柱气相色谱发明毛细管柱气相色谱1959Porath,Flodin发表凝胶过滤色谱的报告发表凝胶过滤色谱的报告1964Moore发明发明凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型型电导检测的新型离子色谱离子色谱法法1981Jorgenson等等创立了创立了毛细管电泳毛细管电泳法法第4页/共78页色谱法起过关键作用的色谱法起过关键作用的诺贝尔奖诺贝尔奖研究工作研究工作年代年代获奖学科获奖学科获奖研究工作获奖研究工作1937化学化学类胡萝卜素化学，维生素类胡萝卜素化学，维生素A和和B1938化学化学类胡萝卜素化学类胡萝卜素化学1939化学化学聚甲烯和高萜烯化学聚甲烯和高萜烯化学1950生理学、医学生理学、医学性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离1951化学化学超铀元素的发现超铀元素的发现1955化学化学脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素1958化学化学胰岛素的结构胰岛素的结构1961化学化学光合作用时发生的化学反应的确认光合作用时发生的化学反应的确认1970生理学、医学生理学、医学关于神经元触处迁移物质的研究关于神经元触处迁移物质的研究1970化学化学糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物中糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物中的作用的作用1972化学化学核糖核酸化学酶结构的研究核糖核酸化学酶结构的研究1972生理学、医学生理学、医学抗体结构的研究抗体结构的研究第5页/共78页色谱法分类色谱法分类按固定相的形态分类按固定相的形态分类柱色谱：柱色谱：填充柱、整体柱、毛细管或开管柱平面色谱：平面色谱：薄层色谱和纸色谱按色谱动力学过程分类按色谱动力学过程分类淋洗色谱法淋洗色谱法置换色谱法置换色谱法迎头色谱法迎头色谱法第6页/共78页按两相的物理形态、分离机理等分类按两相的物理形态、分离机理等分类色谱法分类色谱法分类第7页/共78页色谱法特点及与其他分离分析方法比较色谱法特点及与其他分离分析方法比较分离效率高；分析速度快；检测灵敏度高；样品用量少；选择性好；多组分同时分析；易于自动化；定性能力较差。色谱法的优缺点：色谱法的优缺点：第8页/共78页色谱法特点及与其他分离分析方法比较色谱法特点及与其他分离分析方法比较（1）色谱、精馏与萃取：平衡分离方法。（2）色谱法与精馏、萃取比较：速度快、效率、选择性高。（3）精馏不能分离沸点相同的组分，萃取不能分离在溶剂中溶解度相同的组分；色谱法可分离沸点、溶解度相同的组分，可分离物理、化学性质相近、其他分离方法不能或难以分离的组分。（4）色谱法每次处理样品量少。与精馏、萃取比较与精馏、萃取比较第9页/共78页与化学分析比较与化学分析比较（1）不受化学性质限制，是一种分离分析方法。（2）化学分析本身不具备分离功能。（3）化学分析一般不适用于分析多组分的混合物。（4）化学分析定量方法简易；色谱法定量测定较复杂。第10页/共78页与光谱、质谱方法比较与光谱、质谱方法比较（1）光谱、质谱用于物质定性鉴定，色谱法定性功能差。（2）色谱法最主要特点是适于多组分复杂混合物分离分析。（3）色谱仪价格比分子光谱、质谱仪低得多，适用范围广。（4）色谱检测器比分子光谱法灵敏度更高，比质谱灵敏度低。第11页/共78页 现代分离方法两重含义现代分离方法两重含义样品样品前处理前处理方法：方法：各种各种提取、分离提取、分离技术技术液液提取LLE、液相微萃取LLME固相萃取SPE、固相微萃取SPME微波辅助溶剂提取、加速溶剂提取超声辅助溶剂提取现代现代分离分析分离分析方法方法:气相色谱GC、高效液相色谱H(U)PLC、毛细管电泳CE、超临界流体色谱SFC第12页/共78页复杂样品分析思路复杂样品分析思路获取样品中所有或大多数组分的信息 基因组学、蛋白组学、代谢组学、中药分析等基因组学、蛋白组学、代谢组学、中药分析等获取样品中一个或多个组分的信息 环境污染物分析、食品中农药兽药分析、体液中药物分析、材料分析等环境污染物分析、食品中农药兽药分析、体液中药物分析、材料分析等第13页/共78页举例：举例：Journal of Chromatography B,881882(2012)3441 Development and validation of a sensitive solid-phase-extraction(SPE)method using high-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry(LCMS/MS)for determination of risedronate concentrations in human plasma利塞膦酸钠 第14页/共78页第15页/共78页1918年J.J.Thomson发明了第一台质谱；1966年Munson和Field提出了CI电离技术；1981年出现了快原子轰击（FAB）电离技术；随后出现了各种软电离技术：如基质辅助激光解吸电离源（MALDI）；电喷雾电离源（ESI）；大气压化学电离源（APCI）；感应耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）；富立叶变换质谱仪（FT-ICRMS）；二、质谱法的发展二、质谱法的发展第16页/共78页1.唯一可以唯一可以确定分子量确定分子量的方法，特别是现代生物的方法，特别是现代生物质谱适用于生物大分子分子量（数十万）定；质谱适用于生物大分子分子量（数十万）定；2.极高灵敏度极高灵敏度，检测限达，检测限达10-14g；质谱法特点质谱法特点第17页/共78页按离子源分类按离子源分类第18页/共78页1.电子轰击源电子轰击源(electron-impactsources,EI)硬电离硬电离 一般有机化合物的电离电位为715eV，被具有电子能量70eV的加速电子轰击后，除了失去或得到一个电子形成分子离子以外，处于激发态的分子离子进一步裂解形成碎片离子和游离基，也可能失去一个中性分子。即70eV能量时，得到丰丰富富的的指指纹纹图图谱谱，灵敏度最大。适当降低电离能，可得到较强的分子离子信号，有助于确定分子量。EI电离：将具有一定能量的电子直接作用于样品分子，使 其电离，且效率高，有助于质谱仪获得高灵敏度 和高分辨率。EI图谱特征：第19页/共78页灯丝灯丝电子束电子束试样高温气化EI离子源第20页/共78页EI源源：可变的离子化能量：可变的离子化能量(1070eV)电子能量电子能量 电子能量电子能量 分子离子增加分子离子增加碎片离子增加碎片离子增加标准质谱图标准质谱图基本都是采用基本都是采用EI源源(70eV)获得获得EI适用于适用于Mr103的易挥发有机物的易挥发有机物EI优点：灵敏度高，适用性强，图谱重现性好，灵敏度高，适用性强，图谱重现性好，有标准图谱对照。有标准图谱对照。缺陷：气化时造成分子热裂解，图谱复杂，分气化时造成分子热裂解，图谱复杂，分子离子峰难寻找。子离子峰难寻找。第21页/共78页（1）分子离子分子离子(Molecularion)EI源离子类型源离子类型分子离子分子离子中性分子中性分子确定分子量确定分子量和分子式和分子式（2）同位素离子同位素离子(isotopicion)根据质谱图上根据质谱图上同位素离子峰与分子离子峰的相对强度，可同位素离子峰与分子离子峰的相对强度，可以推测化合物的分子式以推测化合物的分子式(Beynon表表)。同位素离子峰鉴定分子中氯、溴、硫原子同位素离子峰鉴定分子中氯、溴、硫原子：(a+b)n第22页/共78页C6H13Br,Mr=164含硫的样品含硫的样品32S:33S:34S=100:0.8:4.4第23页/共78页（3）碎片离子碎片离子(fragment ion)1)断裂断裂带有电荷的官能团与相连的带有电荷的官能团与相连的碳原子之间的断裂碳原子之间的断裂断裂方式断裂方式均裂均裂：XY=X+Y异裂异裂：XY=X+Y-半异裂半异裂：X+Y=X+Y已电离已电离含饱和杂原子含饱和杂原子+CH3CH2ICH3CH2+I+均裂均裂异裂异裂CH3CH2+I-C第24页/共78页含不饱和杂原子含不饱和杂原子均裂均裂第25页/共78页烯烃烯烃(烯丙断裂烯丙断裂)烷基苯烷基苯(苄基断裂苄基断裂)2)断裂断裂碳原子和碳原子和碳原子之间的键的断裂碳原子之间的键的断裂第26页/共78页3)断裂断裂较易发生较易发生第27页/共78页（4）重排离子重排离子(rearrangemention)麦氏麦氏(Mclafferty)重排重排R1=H、R、OH、OR、NR2第28页/共78页（5）亚稳离子亚稳离子(metastableion):m*离子源内离子源内亚稳离子亚稳离子（m1速度，速度，m2质量）质量）m1m2m*m/z离子源后飞行中离子源后飞行中特点：强度低、宽、跨几个质量数，m/z非整数，易辨认用处：证明m1m2裂解过程第29页/共78页2.化学电离源化学电离源(chemicalionizationsources,CI)甲烷甲烷电离电离甲烷甲烷离子与分子反应生成离子与分子反应生成加合离子加合离子软电离软电离反应气体反应气体有甲烷、丙烷、氨气、异丁烷等有甲烷、丙烷、氨气、异丁烷等90%第30页/共78页加合离子加合离子与样品分子反应与样品分子反应准分子离子准分子离子:(M1)+(M+1)+(M-1)+气体分子气体分子试样分子试样分子准分子离子准分子离子电子电子(M+17)+,(M+29)+第31页/共78页CI电离规律：电离规律：CI电离与样品化合物类型及反应气体有关：（1）反应气体影响：甲烷：有M+H+、M-H-、M+C2H5+或M+C3H5+异丁烷：有M+H+、M+C4H9+氨：有M+H+、M+NH4+（2）化合物结构影响：电负性强的元素电子捕获（或再分解）生成负离子：有M-、M-H-及其分解离子。CI源会产生一些碎片离子，碎片会进一步离子-分子反应第32页/共78页CI源特点：解释CI谱时，要综合分析CI谱、EI谱和所用的反应气，推断出准分子离子峰。优点：优点：图谱简单，易测得分子量（主要任务），正、图谱简单，易测得分子量（主要任务），正、负离子模式灵敏度相当。适用于易汽化的样品。负离子模式灵敏度相当。适用于易汽化的样品。缺点：缺点：不适于难挥发成分的分析，没有标准谱库。不适于难挥发成分的分析，没有标准谱库。第33页/共78页M=390COOC8H17COOC8H17第34页/共78页3.大气压电离大气压电离（Atmosphericpressureionization,API）API是主要应用于HPLC和质谱联用时的电离方法,两者都是很软的电离方法，易于得到样品的分子量。有ESI和APCI两种方式。最软电离最软电离 样品从具有雾化气套管的毛细管端流出时在电场和雾化气的吹带作用下喷成无数的带电微液滴，一定温度下，液滴中的溶剂快速蒸发，液滴直径不断变小，表面电荷密度不断增大。最终使溶剂和样品离子从液滴中被排挤出，样品离子进入分析器被检测。（1）电喷雾电离源电喷雾电离源(Electrospray Ionizaton，ESI)第35页/共78页高电场高电场强静电场（3-5KV），形成高度荷电雾状小液滴，经过反复的溶剂挥发-液滴裂分后，产生单电荷或多电荷离子。ESI离子源第36页/共78页ESI特点：特点：最软电离技术最软电离技术单电荷或单电荷或多电荷离子多电荷离子利于极性强、不稳定的生物大分子的测定利于极性强、不稳定的生物大分子的测定东莨菪碱ESIMS图谱第37页/共78页ESI源离子类型有机小分子（有机小分子（1000Da以下）：以下）：一级质谱（一级质谱（MS）：单电荷准分子离子，很少碎片单电荷准分子离子，很少碎片（1）分子离子峰：M+或M-（2）准分子离子峰（加合离子）：和溶液组成有关M+H+、M-H-、M+Na+、M+K+、M+NH4+碱性化合物易生成质子化的分子M+H+；酸性化合物，易生成去质子化离子M-H-。（3）聚合离子：2M+H+、2M+Na+、2M-H-、3M+H+二级质谱及多级质谱（二级质谱及多级质谱（MS/MS）：裂解规律同EI相似，但主要丢失为中性分子，很少丢失自由基。第38页/共78页生物大分子：生物大分子：一级质谱（MS）为多电荷多离子，计算拟合获得分子量；二级质谱及多级质谱（MS/MS）产生特征碎片离子。图1马心肌红蛋白的ESI质谱图图2溶菌酶样品的ESI质谱图第39页/共78页（2）大气压化学电离大气压化学电离(Atomspheric pressure chemistry ionization,APCI)APCI结构与电喷雾源大致相同，不同之处在于APCI喷咀的下游放置一个针状放电电极，通过放电电极的高压放电，使空气中某些中性分子电离，产生H3O+，N2+，O2+和O+等离子，溶剂分子也会被电离，这些离子与分析物分子进行离子-分子反应，使分析物分子离子化。APCI电离机理：质子转移和电荷交换产生正离子；质子脱离和电子捕获产生负离子等。第40页/共78页APCI示意图示意图第41页/共78页APCI应用特点应用特点：（1）主要用来分析中等、弱极性小分子化合物。（2）有些分析物由于结构和极性方面的原因，ESI不能产生足够强的离子，可采用APCI方式增加离子产率，APCI是ESI的补充。（3）与CI不同，APCI无须加热样品使之汽化，因而应用范围更广。APCI电离特征电离特征：主要产生的是单电荷离子M+H+或M-H-，分析的化合物分子量一般小于1000Da，很少有碎片离子，主要是准分子离子。第42页/共78页银杏叶中聚戊烯醇化合物APCI-MSM-CH2OH第43页/共78页4.基质辅助激光解析质谱基质辅助激光解析质谱（Matrix-assistedLaserDesorptionIonization，MALDI）用小分子有机物作基质，将样品溶液和基质混合均匀，干燥成为晶体或半晶体后送入离子源内。用一定波长的脉冲式激光照射，基质分子能有效地吸收激光能量，瞬间由固态转化为气态，基质离子与样品相互碰撞使样品离子化，而得以进行质谱分析。MALDI示意图示意图第44页/共78页常用基质：2,5-二羟基苯甲酸、芥子酸、烟酸、2-氰基4-羟基肉桂酸等MALDI特点：准分子离子峰很强，碎片离子峰很少，能直接测定难于电离的样品，特别是生物大分子物质如多肽、核酸、蛋白等。适于结构复杂、不易气化的大分子，并引入辅助基质减少过分碎裂。一般采用固体基质，基质样品比为10000/1。根据分析目的不同使用不同的基质和波长。第45页/共78页5.快原子轰击快原子轰击（fast atom bombardment,FAB）FAB电离原理：样品溶液与甘油、硫代甘油、3-硝基苄醇等高沸点的溶剂混合滴加于样品靶上。由铯枪（或Ar、Xe）产生的高能快原子轰击到样品靶上时，部分能量导致样品气化和电离。生成的离子束由一加速电压（数kV）引出，进入质量分析器，按不同的质荷比（m/z）被分开，并检测器检出。第46页/共78页第47页/共78页FAB电离特点：（1）准分子离子为主，少许碎片离子；（2）常见的离子有M+H+、M-H-；（3）加合离子有M+Na+、M+K+，样品滴在Ag靶上时，会出现M+Ag+，用甘油作为基质，生成的离子中还会有样品分子和甘油生成的加合离子。（4）既可以得到正离子，也可以得到负离子。（5）在基质中加入不同的添加剂，会影响离子的强度。加入乙酸，三氟乙酸等会使正离子增强，加入NH4OH会使负离子增强。第48页/共78页FAB应用特点：FAB是一种软电离技术，被分析样品不须经过气化而直接电离，故常用于分析极性强、不易气化和热稳定性差的样品，如氨基酸、多肽、糖类、维生素、抗菌素等。苯芴醇FAB-MS分子式：分子式：C30H32Cl3NO分子量：分子量：528.94第49页/共78页质谱法的应用质谱法的应用定性分析定性分析标准谱图检索定性：EI(70eV)标准谱库：书库、数据库、网络检索相对分子质量测定：根据电离方式、测试条件和化合物分子结构特点，获得分子量未知化合物的结构分析未知化合物的结构分析分子量的确定：分子离子峰的识别分子式的确定：高分辨质谱法和同位素丰度法分子结构的确定：计算不饱和度，特征离子和特征碎片丢失定量分析定量分析质谱直接定量分析：应用少复杂混合物定量分析：GC-MS、LC-MS、CE-MS.第50页/共78页三、气相色谱法及气质联用三、气相色谱法及气质联用1、气相色谱法（、气相色谱法（GC）英国生物化学家MartinATP等人在研究液液分配色谱的基础上，于1952年创立的一种极有效的分离方法，它可分析和分离复杂的多组分混合物。目前，高效能的色谱柱，高灵敏度的检测器及微处理机的使用，使得GC成为一种分析速度快、灵敏度高、应用范围广的分析方法。如气相色谱-质谱（GC-MS）、气相色谱-Fourier红外光谱(GC-FTIR）、气相色谱-原子发射光谱（GC-AES）联用等。第51页/共78页GC特点特点1.高选择性：可用在性质极为相似物质（如同位素、同系物、烃类异构体等）的分离与测定。2.高效能：可以分析极为复杂的物质，如：石油烃、燃烧产物等3.高灵敏度：可检测出10-1110-13g的物质量，因而可对痕量组分进行分析。如：大气污染监测10-910-12级的毒物；农副产品、水果、食品、水质中的10-610-9g的农药残留量。第52页/共78页GC进展进展灵敏度高：灵敏度高：比一维色谱提高20-70倍；分辨率高、峰容量大：分辨率高、峰容量大：两柱峰容量乘积分离效率高、快速：分离效率高、快速：（1）全二维气相色谱技术：）全二维气相色谱技术：非极性柱+极性柱串联，调节极性和温度实现正交化色谱分离。特点：特点：第53页/共78页（2）顶空气相色谱法）顶空气相色谱法（headspacegaschromatography）静态法：静态法：恒温密闭系统，平衡时，测定气相组成；动态法：动态法：吹扫-捕集法，采用吸附剂吸附，加热解吸。原理：原理：试样置于密闭恒温系统中，气-液（固）两相达到热力学平衡时，测定气相组成。特点：特点：对液体或固体试样中的挥发性成分分析方式：方式：第54页/共78页应用应用1：在职业病和法庭分析中，经常测定体液中苯、甲苯和二甲苯等有毒成分。司法部制定了分析水、尿和血中苯类化合物的静态分析方法方法：方法：5mL青霉素小瓶中取1mL试样，加0.4g内标物和1g硫酸铵至饱和，加盖密封，置于80恒温器中30min，取0.6mL顶空进样分析。色谱柱：2m2mm；80-100目；固定液为PEG20M柱温：100，10/min程序升温到110第55页/共78页应用应用2：血样中酒精分析，检查司机是否酒驾。方法：方法：样品平衡温度：平衡时间：30min色谱柱：30m0.53mm；石英毛细管柱固定液：聚二甲苯硅氧烷第56页/共78页应用应用3：将塑料食品包装袋剪成30mm10mm，装入100mL玻璃注射器，80预热20min，用空气稀释为100mL，恒温10min后进样分析。色谱柱：500mm3mm；80-100目填充柱固定液：20%PEG20M柱温：80最小检查浓度为0.31mg/m2固体样品（塑料、食品等）顶空分析：塑料食品包装袋中的甲苯残留量测定方法：方法：第57页/共78页（3）裂解气相色谱法）裂解气相色谱法（pyrolysisgaschromatography，PyGC）原理：原理：一定条件下，高分子及非挥发性有机化合物遵循一定的裂解规律，即特定的样品能够产生特征的裂解产物及产物分布，采用GC分析，鉴定裂解产物，对样品进行表征。方法：方法：样品置于裂解器中，严格控制条件，快速加热，使之迅速分解为可挥发的小分子产物，然后直接将裂解产物送入色谱柱分离，获得定性和定量数据。第58页/共78页流程：流程：载气六通阀压力表气化室色谱柱裂解器GC检测器质谱仪数据处理数据处理进样第59页/共78页特点：特点：分离效率高灵敏度高分析速度快：快速裂解、快速分析、无信息丢失信息量大：裂解条件与裂解产物关系；样品组成与裂解产物；裂解机理和反应动力学研究适合各种形态样品：粘稠液体、粉末、纤维、固体树脂、涂料、塑料等简单易行应用：应用：较大分子量、结构复杂、难挥发和难溶解物质的分析鉴定，如聚合物分析热裂解+GC+MS（IR、NMR）是研究高分子化合物的有力工具；在高分子、生物医学、环境科学、考古学、地球化学和炸药等领域应用广泛。第60页/共78页GC应用应用石化分析：石化分析：汽油单体烃分析等环境分析：环境分析：多氯联苯、氯化硼烷等多组分生物药剂：生物药剂：药物吸收、分布、代谢、排泄及毒性和剂型关系白酒分析：白酒分析：醇、醛、酸、酯等GC发展前景发展前景GC色谱柱开发：色谱柱开发：选择性、寿命、成本、规格等专用分析系统：专用分析系统：芯片化、模块化、快速、可靠和自动化、网络化专用分析软件开发：专用分析软件开发：专用化、网络化和远程支持性能等第61页/共78页2、气相色谱、气相色谱-质谱联用质谱联用1957年HolmesJC和MorrellFA开发GC-MS联用技术兼顾GC和MS的优点：快速多组分定性定量分析测定分子量同时还具有：（1）GC进样：提高混合物分离、定性和定量效率（2）MS检测：提高适用性、选择性和灵敏度（3）专属性好：t、m/z及强度三维信息，定性能力强GC-MS特点：特点：（和（和GC、MS比较）比较）第62页/共78页GC-MS能解决的问题：（1）复杂混合物的成分分析石油烃类及非烃类、化工原料组成、酒中醇、醛、酸和酯、天然产物萜类和甾类、中草药成分、烟草成分、香精香料配方等（2）杂质成分的鉴定和定量分析；含量低，加大进样量或浓缩（3）目标混合物残留的定量分析：环境保护、疾病控制、药物代谢、兴奋剂、毒品、食品安全等GC-MS应用：应用：第63页/共78页1、高效液相色谱法（、高效液相色谱法（HPLC）高压泵高压泵流动相流动相溶剂溶剂废液废液色谱柱色谱柱检测器检测器WatersUPLC超高效液相色谱仪超高效液相色谱仪经典经典LCHPLC固定相粒径固定相粒径流动相驱动方式流动相驱动方式流动相流速流动相流速150-200m重力或低压泵重力或低压泵很慢很慢3-10m高压泵高压泵快快(110mL/min)20世纪60年代末70年代初发展起来四、液相色谱法及液质联用四、液相色谱法及液质联用第64页/共78页基本理论基本理论塔板理论速率理论A涡流扩散项B/u分子扩散项（忽略）Cu传质阻力项第65页/共78页分离模式分离模式吸附色谱法（液固吸附色谱LSC）分配色谱法（液-液分配色谱LLC+键合相色谱）离子交换色谱法（IEC）化学键合相色谱尺寸排阻（凝胶）色谱法SEC、GPC亲和色谱第66页/共78页HPLC特点特点高效液相色谱法的优点高效液相色谱法的优点（与经典液相色谱法与气相色谱法比较）（1）分离效能高分离效能高（2）选择性高）选择性高（3）检测灵敏度高）检测灵敏度高（4）分析速度快）分析速度快（5）应用广泛，适于沸点高、热稳定性差的物质）应用广泛，适于沸点高、热稳定性差的物质（占（占70-80%），特别是蛋白质、核酸、氨基酸、多），特别是蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。和分析。High performance liquid chromatography,HPLC第67页/共78页方法特点方法特点（1）分离分析同时完成：）分离分析同时完成：融分离和检测于一体，可以实现融分离和检测于一体，可以实现复杂复杂混合物的多组分同混合物的多组分同时分析。时分析。（2）多种检测器，适用对象广：）多种检测器，适用对象广：紫外紫外UV、二极管阵列、二极管阵列PAD、荧光、化学发光、电化学、荧光、化学发光、电化学、质谱质谱MS等。等。（3）仪器联用，多重信息，定性能力强：）仪器联用，多重信息，定性能力强：LC-MS(NMR、IR)保留时间定性、光谱定性、质谱及串联质谱定性等。保留时间定性、光谱定性、质谱及串联质谱定性等。（4）仪器联用，灵敏度高，专属性好：）仪器联用，灵敏度高，专属性好：强大的分离功能和质谱的高灵敏度、高专属性。强大的分离功能和质谱的高灵敏度、高专属性。（5）分离模式多，适用范围广：）分离模式多，适用范围广：生物、药物、食品、环境、材料、农业、医学等。生物、药物、食品、环境、材料、农业、医学等。第68页/共78页HPLC-PAD图谱 光谱定性 峰纯度检验第69页/共78页根据被根据被分析样品的特性分析样品的特性选择适用于样品分析的选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析一种高效液相色谱分析方法方法。选择一根适用的选择一根适用的色谱柱色谱柱，确定柱的规格（柱内，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。选择适当的或优化的分离操作条件，确定选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动流动相相的组成、流速及洗脱方式。的组成、流速及洗脱方式。由获得的由获得的色谱图色谱图进行定性分析和定量分析。进行定性分析和定量分析。建立建立HPLC分析方法的步骤分析方法的步骤第70页/共78页分析方法分析方法定性分析对照定性：纯物质色谱保留对照定性经验规律和文献值定性联机定性定量分析归一化法外标法(校准曲线法)内标法第71页/共78页主要应用主要应用定性分析定性分析已知化合物鉴定：合成产物、天然化合物成分分析质量标准：中药、食品标准指纹图谱定量分析定量分析复杂样品目标化合物定量分析：众多国家和国际标准 方法，如食品、药品、环境、卫生、工业等理论研究理论研究化学平衡性质：保留时间溶解热、熵变及焓变动力学过程：峰扩宽程度扩散系数、反应速率常数物化性质：保留体积或峰面积相对分子质量、表面积、孔 率分布及液膜厚度第72页/共78页LC-MS（MSn）特点特点灵敏度高选择性好专属性好快速SIM、SRM等测试模式灵活多样MSn丰富的分子结构信息，无对照品，也能定性分析图谱直观样品前处理简单多组分同时定性或定量测定多电荷离子的产生适合于分析大分子2、液相色谱、液相色谱-质谱联用技术质谱联用技术（liquidchromatography-massspectrometry,LC-MS）第73页/共78页主要应用主要应用（1）药物：药物合成：药物合成：反应过程监测、中间体、目标化合物及副反应产 物分析等。药物筛选及极性优化：药物筛选及极性优化：药物分析：药物分析：极性、不稳定、难气化、大分子药物等。药物代谢：药物代谢：母药及其代谢物的鉴定、结构分析及定量分析；药代动力学、毒理动力学研究。中药研究：中药研究：活性成分分析 质量控制指纹图谱临床研究：临床研究：第74页/共78页（2）生物：（1）肽和蛋白质的氨基酸序列分析、平均分子量测定；（2）糖蛋白分子量和结构分析；（3）生物成像研究1988年美国年美国JohnFenn发表发表ESI-MS的肽及蛋的肽及蛋白质分析论文，白质分析论文，2002年获得诺贝尔化学奖。年获得诺贝尔化学奖。第75页/共78页3.食品：有效成分分析：质量控制食品安全毒物分析：农药、兽药残留；添加剂；霉菌（黄曲霉毒素）4.环境：环境污染分析：毒物残留监测5.法医刑侦：投毒和毒品检测 第76页/共78页Thank you for your attention!第77页/共78页感谢您的观看！第78页/共78页
