常用分子生物学技术的原理及应用PPT.pptx

核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在在DNA复复性性过过程程中中，把把不不同同DNA单单链链分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，或或把把DNA与与RNA放放在在一一起起，只只要要在在DNA或或RNA的的单单链链分分子子之之间间有有一一定定的的碱碱基基配配对对关关系系，就就可可在在不不同同的的分分子子之之间间形形成成杂化双链杂化双链的这种现象的这种现象。一、分子杂交与印迹技术的原理杂交的原理实质是核酸分子的变性与复性过程第1页/共125页复性RNADNA第2页/共125页（一）印迹技术1.具体步骤SouthernE1975年首次应用 Southern EM.Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.J Mol Biol，1975,98(3):503-517.原始文献出处：第3页/共125页（一）印迹技术1.具体步骤SouthernE1975年首次应用琼脂糖分离的DNA片段变性为单链将一张NC膜放在胶上，上面放吸水纸巾利用毛细作用使胶中的DNA片段转移到NC膜上，使之成为固相化分子。载有DNA单链分子的NC膜可在杂交液与另一种DNA或RNA分子（探针）杂交，具有互补序列的RNA或DNA结合到存在于NC膜的DNA分子上，经检测分析可显现出杂交分子的区带。第4页/共125页2.印迹(blotting)定义将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）或直接放在固相化介质上并加以检测分析的技术。3.应用广泛用于DNA、RNA、蛋白质的检测4.发展电转移印迹技术、真空吸引转移印迹等第5页/共125页（二）探针技术探针(probe)的概念是带有特殊可检测标记（放射性核素、生物素或荧光染料）的核酸片段，它具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可以用来检测核酸样品中是否存在某一特定的基因。探针的种类n寡核苷酸探针寡核苷酸探针n基因组基因组DNA探针探针ncDNA探针探针nRNA探针探针第6页/共125页将探针与固定在NC膜上的DNA或RNA进行结合反应，探针的序列如与NC膜上的核酸序列相互补，就可结合到膜上的相应区带，经放射自显影或其他检测手段就可判断膜上是否有同源的核酸分子存在。探针技术的概念第7页/共125页二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹技术(Southernblotting)（二）RNA印迹技术(Northernblotting)（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)第8页/共125页（一）（一）Southern blottingM1 2转移缓冲液Whatman滤纸凝胶Whatman滤纸纸巾玻璃板重物支持物500g1 2与探针同源杂交的基因DNA片段基因组DNADNA酶切片段内切酶NC或尼龙膜NC膜或尼龙膜第9页/共125页基因组DNA的定性与定量分析。如对在基因组中特异基因的定位及检测等。重组质粒和噬菌体的分析。Southertblotting用途第10页/共125页放射自显影照片第11页/共125页（二）RNA印迹技术(Northernblotting)相同点：AlwineJC,et al.MethodfordetectionofspecificRNAsinagarosegelsbytransfertodiazobenzyloxymethyl-paper（重氮苄氧甲基纸）andhybridizationwithDNAprobes.Proc Natl Acad Sci USA,1977,74(12):5350-5354原始文献出处名称相对于Southern blotting转移的是RNA转移前无需酶切转移效率较高变性方法不同点原理均为毛细作用。第12页/共125页（二）RNA印迹技术Northernblotting用途检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。第13页/共125页Northern blotting结果第14页/共125页由于基因组测序的完成及基因芯片技术的成熟以上两种技术应用的越来越少第15页/共125页（三）蛋白质的印迹技术(免疫印迹)首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小分开，再将蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上，蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。与DNA和RNA印迹相似之处第16页/共125页蛋白质的转移只有靠电转移。蛋白质的检测以抗体作探针。用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，底物显色来检测蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度。或用同位素标记第二抗体，放射自显影法检测蛋白区带的信号。与DNA和RNA印迹不同之处第17页/共125页Westernblotting应用检测样品中的特异蛋白质的存在。细胞中特异蛋白质的定量分析。蛋白质分子的相互作用研究。第18页/共125页第19页/共125页第20页/共125页第21页/共125页辣根过氧化酶（HRP）使试剂中的发光物（Luminol）氧化并发光，而试剂中含有增强剂这使得发光增强了1000倍。经HRP标记的抗体与膜上的蛋白直接（标记一抗）反应。当加入免疫印迹化学发光试剂后，Luminol发生氧化降解，并发射波长为428nm的光，此光可经X光胶片感光记录下来。第22页/共125页Westernblotting应用SDS-PAGE purified recombinant human CK2(重组人酪蛋白激酶2)subunit and its Western blotting用已知的特异抗体检测目的基因蛋白重组人酪蛋白激酶2 第23页/共125页三种印迹技术的比较Westernblotting垂直槽Northernblotting水平槽Southernblotting水平槽第24页/共125页斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA芯片技术(DNAchip)其他印迹技术第25页/共125页斑点印迹斑点印迹(dot blotting)ADotblotisatechniqueinmolecularbiologyusedtodetectbiomolecules.Itrepresentsasimplificationofthenorthernblot,southernblot,orwesternblotmethods.Inadotblotthebiomoleculestobedetectedarenotfirstseparatedbyelectrophoresis.Instead,amixturecontainingthemoleculetobedetectedisapplieddirectlyonamembraneasadot.Thisisthenfollowedbydetectionbyeithernucleotideprobes(foranorthernblotandsouthernblot)orantibodies(forawesternblot).第26页/共125页Thetechniqueofferssignificantsavingsintime,aschromatographyorgelelectrophoresis,andthecomplexblottingproceduresforthegelarenotrequired.However,itoffersnoinformationonthesizeofthetargetbiomolecule.Furthermore,iftwomoleculesofdifferentsizesaredetected,theywillstillappearasasingledot.DotblotsthereforecanonlyconfirmthepresenceorabsenceofabiomoleculeorbiomoleculeswhichcanbedetectedbytheDNAprobesortheantibody.第27页/共125页第28页/共125页原位杂交原位杂交(in situ hybridization)In situ hybridization(ISH)isatypeofhybridizationthatusesalabeledcomplementaryDNAorRNAstrand(i.e.,probe)tolocalizeaspecificDNAorRNAsequenceinasectionoftissue,or,ifthetissueissmallenough,intheentiretissue.DNAISHcanbeusedtodeterminethestructureofchromosomes.FluorescentDNAISH(FISH)can,forexample,beusedinmedicaldiagnosticstoassesschromosomalintegrity.RNAISH(hybridizationhistochemistry)isusedtomeasureandlocalizemRNAsandothertranscriptswithintissuesectionsorwholemounts.第29页/共125页A：正常细胞，两绿两红.B：一个t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信号，一绿一红两融合.D：一个t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信号，两红两绿一融合，这由于异常染色体上面的BCR和ABL基因分离造成的.E：一个t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信号和一个额外的Ph 染色体。一红一绿三融合.第30页/共125页DNA芯片将多种已知序列的DNA排列在一定大小的固相支持物上用于检测细胞或组织样品中的核酸种类的技术。第31页/共125页第第 二二 节节 PCR技术的原理与应技术的原理与应用用（PolymeraseChainReaction，PCR）聚合酶链反应第33页/共125页PCR技术是1985年由美国科学家KaryBMullis建立的体外扩增基因片段的方法，它具有特异、敏感、产率高、简便、重复性好、易自动化等突出优点，是分子生物学技术中一项具有革命性的创举。PCR方法被美国Science杂志评为1989年的十大科技成就之一，而TaqDNA聚合酶被评选为象征1989年的“年分子”(themoleculeofyear)。第34页/共125页The Nobel Prize in Chemistry 1993for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry MichaelSmithLaJolla,CA,USAKaryB.MullisUniversityofBritishColumbiaVancouver,Canadaforhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)methodforhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies第35页/共125页5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA一、PCR技术的工作原理55555555第36页/共125页Cycle355555555555555552530次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。第37页/共125页n模板DNAn特异性引物n耐热DNA聚合酶ndNTPsnMg2+PCR体系基本组成成分第38页/共125页PCR反应循环变性95C左右延伸适温退火Tm-5C经过30个左右的循环后，PCR的扩增倍数为(1+x)n,x=75%,n为循环数.第39页/共125页2.利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段。3.利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有一定同源性的基因片段。4.利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机克隆基因。1.与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片段。二、PCR技术的主要用途（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆第40页/共125页（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析二、PCR技术的主要用途第41页/共125页三、几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术(RT-PCR)（二）原位PCR技术(ISP)（三）实时PCR技术(real time PCR)第42页/共125页RT-PCR技术AAnATTnT55mRNA反转录酶mRNAcDNA3TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3DNApolyIcDNA核酸酶S1双链cDNA35355加热变性加入特异性引物DNA聚合酶PCR扩增出大量的产物第43页/共125页原位原位PCR技术技术(ISP)原位PCR技术就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列。PCR技术是在DNA聚合酶的作用下，经过模板的变性、退火和引物延伸三种循环，将引物引导下的特异性靶序列迅速地进行扩增，经过扩增的靶序列（一般能扩增106倍），很容易在凝胶电泳或Southern印记杂交中显示出来，因此，PCR技术具有灵敏度高，特异性强的优势，随着热循环自动化的提高与稳定也使得PCR技术的操作简便易行。但是，PCR技术是在液相中进行的，在扩增前，需将细胞破坏，从中提取核酸作为模板，因此很难将PCR的结果与组织细胞的形态结构联系起来，同时，也很难判断含特异性靶序列的细胞类型。第44页/共125页原位PCR技术成功地将PCR技术和原位杂交技术结合起来，保持了两项技术的优势又弥补了各自的不足。原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数极扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。第45页/共125页multidrug resistance associated-protein(mrp)genemultidrug resistance associated-protein(mrp)genemultidrugresistanceassociatedprotein第46页/共125页实时实时PCR技术技术(real time PCR)常规常规PCR反应中产物以指数形式增加，在比较不同反应中产物以指数形式增加，在比较不同来源样品的来源样品的DNA或或cDNA含量时，产物的堆积将影含量时，产物的堆积将影响对检测样品中原有模板含量差异的准确判断，因响对检测样品中原有模板含量差异的准确判断，因此只能作为半定量手段应用。此只能作为半定量手段应用。实时实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量亦被称为定量PCR。Realtime PCR 常用的两种方法分别为常用的两种方法分别为SYBR green（荧光染料掺入法）和（荧光染料掺入法）和Taqman probe（探针（探针法）法）。第47页/共125页SYBR green（荧光染料掺入法）（荧光染料掺入法）在在PCR反应体系中，加入过量反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺荧光染料特异性地掺入入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。产物的增加完全同步。第48页/共125页第49页/共125页1、灵敏度高：使用、灵敏度高：使用SYBR可使荧光效果增可使荧光效果增 强到强到1000倍以上。倍以上。2、通用性好，不需要设计探针，方法简、通用性好，不需要设计探针，方法简 便，省时，价格低廉。便，省时，价格低廉。3、通用型方法，在国内外科研中普遍使、通用型方法，在国内外科研中普遍使 用。用。4、高通量大规模的定量、高通量大规模的定量PCR检测。检测。5、专一性要求不高的定量、专一性要求不高的定量PCR检测。检测。此方法适用于：第50页/共125页Taqman probe（探针法）（探针法）PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团报告荧光基团和一个淬灭淬灭荧光基团荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。第51页/共125页探针法技术原理第52页/共125页1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好，特异性更高。复性好，特异性更高。2、适用于扩增序列专一的体系的检测。、适用于扩增序列专一的体系的检测。3、样品中靶基因含量过低的定量、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。检测。4、靶基因的特异序列较短，无论怎样优化引、靶基因的特异序列较短，无论怎样优化引物设计条件都不能解决。物设计条件都不能解决。5、存在与靶基因同源的序列，在、存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。此方法适用于：第53页/共125页第第 三三 节节核核 酸酸 序序 列列 分分 析析Nucleic acid sequence analysis第54页/共125页核酸序列分析的基本原理化学裂解法(Maxam-Gilbert法)DNA链的末端合成终止法(Sanger法)第55页/共125页一、化学裂解法(Maxam-Gilbert法)基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记DNA的5末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。第56页/共125页(Sanger双脱氧链终止法)HOPOPOPOCH2OOOOHOHOHOA,C,GorT13OH5双脱氧核苷三磷酸脱去二、DNA链末端合成终止法Sanger1958年和1980年两次获Nobel奖第57页/共125页第58页/共125页第59页/共125页The Nobel Prize in Chemistry 1980forhisfundamentalstudiesofthebiochemistryofnucleicacids,withparticularregardtorecombinant-DNAfortheircontributionsconcerningthedeterminationofbasesequencesinnucleicacidsPaulBergWalterGilbertFrederickSanger1/2oftheprize1/4oftheprize1/4oftheprizeStanfordUniversityStanford,CA,USAHarvardUniversity,BiologicalLaboratoriesCambridge,MA,USAMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdom第60页/共125页三、DNA自动测序用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记4种ddNTP，然后进行Sanger测序反应，产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离。通过4种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出4种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。第61页/共125页目前所用自动测序技术目前所用自动测序技术同位素标记到荧光标记同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电平板电泳到毛细管电泳泳多色荧光标记毛细管电泳单色荧光标记平板电泳同位素标记平板电泳A C G TA CGT测序图谱TATTGCATTGTCTGCATTGTCT第62页/共125页DNA测序仪示意图测序仪示意图computeranalysis凝胶中DNA移动方向样品槽激光器输入光学系统成象透镜聚焦透镜高灵敏度相机旋光镜/棱镜组件第63页/共125页DNA自动测序结果举例第64页/共125页ABIPRISM310型DNA测序仪第65页/共125页目前所用测序技术的缺点1、测序的原理是DNA链终止法，这注定了一个反应所测序列不可能太长，目前为1000个核苷酸左右。2、测序反应费时费力科学家们完成第一个人类基因组测序整整花了13年的时间，耗费了30亿美元的费用。3、测序准确度不高DNA聚合酶造成的碱基错配，DNA序列判读错误。4、测序基于PCR反应，需要引物，并且有些结构复杂的难于进行PCR反应的片段不能测序。第66页/共125页下一代测序技术下一代测序技术下一代测序技术又称为二代测序技术，其代表技术为罗氏公司(Roche)的454测序仪(RocheGSFLXsequencer),Illumina公司的Solexa基因组分析仪(IlluminaGenomeAnalyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABISOLiDsequencer)。第67页/共125页特点特点测序策略主要基于循环芯片测序法（循环芯片测序法（Cyclic-array sequencing），），即制备DNA文库，单分子扩增，在固相载体上形成DNA簇阵列，并行地利用DNA聚合酶或者连接酶进行酶促反应（模板变性、引物退火杂交、延伸或连接），同时读取反应产生的特异性荧光信号，最终得到超大量的DNA序列信息。高通量并行测序。例如，RocheGSFLXsequencer一次就可对上百万条DNA分子同时进行序列测定，一次运行通量达到400Mb以上，而传统测序（一代测序）一轮测序的通量仅为80Kb左右。单分子测序。传统测序（一代测序）是对多个DNA分子的混合物进行测序，其测序结果是多个DNA分子综合的序列信息；而二代测序先对单个DNA分子进行PCR以放大DNA分子数量（相当于单个DNA分子的克隆复制），再对这些DNA分子进行测序，就可以得到原来单个DNA分子的序列信息。第68页/共125页新型纳米孔测序法新型纳米孔测序法新型纳米孔测序法（新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而可以在此基础上使用许单个核酸聚合物通过，因而可以在此基础上使用多种方法来进行高通量检测。此外，纳米级别的孔多种方法来进行高通量检测。此外，纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，所以测序的准确径保证了检测具有良好的持续性，所以测序的准确度非常高。对于长达度非常高。对于长达1,000个碱基的单链个碱基的单链 DNA分子、分子、RNA分子或者更短的核酸分子而言，分子或者更短的核酸分子而言，根本无需进行根本无需进行扩增或标记就可以使用纳米孔测序法进行检测，这扩增或标记就可以使用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜、快速地进行使得便宜、快速地进行DNA测序成为可能。测序成为可能。如果对如果对现有纳米孔测序法进行进一步发展和改进，那么它现有纳米孔测序法进行进一步发展和改进，那么它将有望成为第三代测序技术（也可称为下、下一代将有望成为第三代测序技术（也可称为下、下一代测序技术），从而帮助人们实现测序技术），从而帮助人们实现24小时内只花费小时内只花费 1,000美元完成二倍体哺乳动物基因组测序这一目标。美元完成二倍体哺乳动物基因组测序这一目标。第69页/共125页基基 因因 文文 库库Gene Library第四节第70页/共125页基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)基因文库(genelibrary)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。第71页/共125页一、基因组DNA文库基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。用于构建基因组文库的载体有噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。第72页/共125页cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。二、cDNA文库第73页/共125页第74页/共125页第 五 节 生 物 芯 片 技 术Biologicalchiptechnology第75页/共125页是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNAmicroarray)。一、基因芯片n基因芯片(genechip)第76页/共125页第77页/共125页 将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片蛋白质芯片(proteinchip)第78页/共125页Theworldshighest-densityproteinmicroarray,carrying22,000humanproteins第79页/共125页第六节生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study第80页/共125页一、蛋白质相互作用研究技术各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）酵母双杂交荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选n常用蛋白质相互作用的研究技术第81页/共125页标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。第82页/共125页方法原理方法原理该方法利用一种带有特定标签（tag）的纯化融合蛋白作为钓饵，在体外与待检测的纯化蛋白温育，然后用可结合蛋白标签的琼脂糖珠将融合蛋白沉淀回收，洗脱液经电泳分离并染色。如果两种蛋白有直接的结合，待检测蛋白将与融合蛋白同时被琼脂糖珠沉淀（pull-down），在电泳胶中见到相应条带。第83页/共125页标签融合蛋白沉淀实验流程示意图第84页/共125页GST pull-down assay其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”。目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)。洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白。“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行，操作方便。第85页/共125页Schematicofpull-downassayusingbacterialexpressionofbaitproteinandcell-freeexpressionforthepreyprotein.第86页/共125页（二）免疫共沉淀（二）免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）免疫沉淀（immunoprecipitation）是利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理在完整细胞内生理性相互作用性相互作用的有效方法。第87页/共125页原理原理当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。第88页/共125页实验流程示意图实验流程示意图第89页/共125页优缺点优缺点优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。第91页/共125页GST pull-down assay 与与Co-immumoprecipitation 联合应用举例联合应用举例第92页/共125页（三）酵母双杂交技术（三）酵母双杂交技术（yeast two-hybrid system）酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母酵母中进中进行的，研究行的，研究活细胞内活细胞内蛋白质相互作用，对蛋蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告报告基因基因的表达产物敏感地检测得到。的表达产物敏感地检测得到。它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。关系的技术。该技术既可用来研究该技术既可用来研究哺乳动物哺乳动物基因组编码的基因组编码的蛋白质之间的相互作用，也可用来研究蛋白质之间的相互作用，也可用来研究高等高等植物植物基因组编码的蛋白质之间的相互作用。基因组编码的蛋白质之间的相互作用。第93页/共125页1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridsystem)。1 酵母双杂交系统的建立酵母双杂交系统的建立第94页/共125页该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子的参与，真核生物转录因子含有两个不同的结构域：转录激活因子DNA结合结构域(BD)(DNAbindingdomain)转录激活结构域(AD)(activationdomain)第95页/共125页 这两个结构域各具功能，互不影响,单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。第96页/共125页Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活因子，天然的Gal4分子是由一条由881个氨基酸残基组成的多肽链。两个结构域中的DNA-BD由位于N-末端的1147位多肽构成，能识别位于Gal4效应基因的上游激活序列(upstreamactivationsequence，UAS)。此外，在其N-端还具有一段核定位序列。AD由位于C-末端的768881位多肽构成。当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能恢复Gal4作为转录因子的活性。第97页/共125页Fields和Song将两个融合蛋白分别构建在穿梭质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋白SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。其中，SNF1是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是已知可以相互作用的。第98页/共125页当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报告基因LacZ的酵母菌株后，通过SNFl与SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD与Gal4的AD靠近,形成一个大的复合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。Gal4的DNA-BD可识别位于Gal4效应基因的UAS，并可与之结合；Gal4的AD则可与转录复合物中其他成分结合，激活UAS下游报告基因LacZ的转录。第99页/共125页酵母转录因子（Gal4）与BD-fusion-诱饵（bait）与AD-fusion-猎物或靶蛋白（preyortargetprotein）报告基因（reportergene）-LacZ（编码-半乳糖苷酶）第100页/共125页2酵母双杂交系统的原理ADYADYXDNA-BDGAL4UASPromoterlacZreportergenetranscriptionGAL4UASPromoterlacZreportergeneGAL4UASPromoterlacZreportergeneXDNA-BDX-Gal是-半乳糖苷酶(-galactosidase)的显色底物，在-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物，所以可以轻易的检测出LacZ基因的表达。第101页/共125页第102页/共125页 表达“诱饵”和“猎物”蛋白；检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报告基因。3酵母双杂交系统的基本策略第103页/共125页4酵母双杂交系统的优点（1）高敏感性采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白过量表达；激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物，之后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定；通过mRNA使信号放大；检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。第104页/共125页（2）真实性检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。（3）简洁性融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤。（4）广泛性采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。第105页/共125页分析已知蛋白之间的相互作用对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点突变或缺失突变再进行双杂交。用已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发现新的相互作用蛋白。分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。绘制蛋白质相互作用系统图谱5酵母双杂交系统的应用现状第106页/共125页例如：利用酵母双杂交发现新的相互作用蛋白质将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-文库载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。第107页/共125页电泳