仪器分析讲稿(第3章液相)-3bcmx.pptx

08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 第三章第三章 高效液相色高效液相色谱谱分析（分析（HPLCHPLC）3.13.1高效液相色谱的特点高效液相色谱的特点一、定义：液相色谱法是指一、定义：液相色谱法是指流动相为液体流动相为液体的色谱技术。高效的色谱技术。高效液相色谱是液相色谱是2020世纪世纪7070年代急剧发展起来的一项高效、快速年代急剧发展起来的一项高效、快速的分离技术。（液相色谱的分离技术。（液相色谱+气相色谱理论气相色谱理论+高压泵、高效固高压泵、高效固定相定相+高灵敏检测器）。高灵敏检测器）。二、特点二、特点1.1.高压高压:可达可达15015035010350105 5 Pa Pa2.2.高速高速:例，分离例，分离2020种氨基酸，经典色谱法要种氨基酸，经典色谱法要2020多小时，用多小时，用HPLCHPLC只需只需1 1小时小时.3.3.高效高效：3 3万塔板万塔板/米（米（GC2000GC2000塔板塔板/米）米）4.4.高灵敏度高灵敏度：紫外检测器紫外检测器1010-9-9 g g；荧光检测器；荧光检测器1010-11-11g g08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 三、应用范围三、应用范围气相色气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非高沸点化合物、非挥发性物性物质、热不不稳定化合物、离子型化定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析合物及高聚物的分离、分析较为困困难。致使其。致使其应用受到一定用受到一定程度的限制，程度的限制，据据统计只有大只有大约20%的有机物能用气相色的有机物能用气相色谱分分析析；而液相色；而液相色谱则不受不受样品品挥发度和度和热稳定性的限制，它非定性的限制，它非常适合分子量常适合分子量较大、大、难气化、不易气化、不易挥发或或对热敏感的物敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的占有机物的70-80%。因此，高效液相色因此，高效液相色谱法，只要求法，只要求试样能制成溶液，而不需要能制成溶液，而不需要气化，不受气化，不受试样挥发性的限制。性的限制。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 3.23.2影响色影响色谱峰峰扩展及色展及色谱分离的因素分离的因素与与GC 比比较65/1；基基本本概概念念及及理理论基基础与与GC一一致致；主主要要区区别：流：流动相不同相不同.液相色液相色谱中中对色色谱峰峰扩展及色展及色谱分离影响的因素：分离影响的因素：一、柱内展一、柱内展宽1.涡流流扩散散项：He=2dp :填充不均匀因子；填充不均匀因子；dp填充粒度直径填充粒度直径 高高效效液液相相色色谱法法的的固固定定相相是是高高效效填填料料，其其颗粒粒直直径径比比气气相相色色谱法法更更小小；且且装装柱柱多多采采用用匀匀浆法法装装柱柱，填填充很均匀，充很均匀，变得很小，所以得很小，所以He值比比较小。小。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 2.纵向向扩散散项65/-1：Hd=CdDm/u；当当试样分子在色分子在色谱柱内被流柱内被流动相相带向前向前时，由于分子本身运，由于分子本身运动所引起的所引起的纵向向扩散同散同样引致色引致色谱峰的峰的扩展。由于分子在展。由于分子在液体中的液体中的扩散系数散系数Dm比在气体中小比在气体中小4-5个数量个数量级，在在LC中可忽略中可忽略,GC中重要。中重要。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 3、传质阻力项 组分分子在固定相与流分分子在固定相与流动相之相之间传质缓慢引起局部不平衡慢引起局部不平衡，从而引起峰，从而引起峰扩展。展。（1）固定相）固定相传质阻力阻力项（主要（主要发生在液液分配色生在液液分配色谱中）中）当流当流动相中的相中的试样分子分子扩散散进入到涂入到涂渍在在载体表面的固定体表面的固定液内液内进行行质量交量交换时，由于渗入固定液膜的深度不同，其，由于渗入固定液膜的深度不同，其返回到流返回到流动相中的相中的时间也不同，因而引起峰也不同，因而引起峰扩展。展。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 采取措施：采取措施：1）液）液-液分配色液分配色谱：薄的固定相：薄的固定相层；吸附、排阻、离；吸附、排阻、离子交子交换色色谱：小的：小的颗粒填料。粒填料。2）采用）采用扩散系数大的液相固定相。散系数大的液相固定相。3）减小流）减小流动相的流速，改善相的流速，改善传质。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析（2）流）流动相相传质阻力阻力项(二种形式二种形式:在流在流动的流的流动相中的相中的传质和滞留的流和滞留的流动相中的相中的传质)i.流流动的流的流动相中的相中的传质阻力阻力项Hm 当流当流动相流相流经色色谱柱内的填充物柱内的填充物时，靠近填充物，靠近填充物颗粒表粒表面的流速面的流速较慢，而流路通道中心的流速慢，而流路通道中心的流速则较快，快，移移动速速度不一度不一样从而引起峰形从而引起峰形变宽。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 ii.ii.滞留的流动相中的传质阻力项滞留的流动相中的传质阻力项H Hsmsm 由于固定相的多孔性能使流动相滞留在其微孔内，微孔内的由于固定相的多孔性能使流动相滞留在其微孔内，微孔内的流动相称为滞留区流动相（静止状态，不流动）。当流动相流动相称为滞留区流动相（静止状态，不流动）。当流动相中的试样分子与固定相进行质量交换时，必须先从流动相扩中的试样分子与固定相进行质量交换时，必须先从流动相扩散进入到滞留区。如果固定相中微孔既小又深，则滞留就越散进入到滞留区。如果固定相中微孔既小又深，则滞留就越严重，传质就越慢，对峰扩展影响也越大。严重，传质就越慢，对峰扩展影响也越大。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化可归纳为：由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化可归纳为：H=A+B/u+CuH=A+B/u+Cu 由由于于B/uB/u这这一一项项可可以以忽忽略略不不计计，影影响响柱柱效效的的主主要要因因素素是是传传质质阻力项阻力项，高效液相色谱的方程可写成：，高效液相色谱的方程可写成：H=A+CuH=A+Cu 提提高高柱柱效效的的方方法法：（1 1）减减小小固固定定相相的的颗颗直直径径，可可明明显显提提高高柱柱效效；（2 2）降降低低流流动动相相粘粘度度或或提提高高柱柱温温，可可增增大大DmDm；（3 3）在在一一定定范范围围内内减减小小流流速速，有有利利于于于于减减小小H H；（4 4）提提高高装装柱技术，提高柱内填充料的均匀性而减小柱技术，提高柱内填充料的均匀性而减小A A项。项。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 1.1.固定相与装柱方法的选择：固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （dp10m,5mdp10m,5m目前应用最广泛）目前应用最广泛）首选化学键合相，匀浆法装柱首选化学键合相，匀浆法装柱2.2.流动相及其流速的选择：流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相选粘度小、低流速的流动相甲醇，甲醇，约约1ml/min 1ml/min 3.3.柱温的选择：柱温的选择：选室温选室温2525左右左右HPLCHPLC法中分离条件的选择法中分离条件的选择08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 HPLCHPLC与与GCGC的的H-uH-u曲曲线见图3-13-1：（1 1）两两者曲者曲线形形状状相相似，都有一似，都有一个个H H最小最小值；（2 2）HPLCHPLC的的H H最小最小值比比GCGC的最小的最小值小一小一个个数数量量级以上，柱效更高；以上，柱效更高；（3 3）HPLCHPLC的最佳流的最佳流速速u u比比GCGC的最佳流速的最佳流速u u也小一也小一个数个数量量级以上。以上。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 二二、柱柱外外展展宽：指指色色谱柱柱外外各各种种因因素素引引起起的的峰峰扩展展.a.柱前展柱前展宽：主要由：主要由进样所引起；所引起；进样方方式式：将将试样注注入入色色谱柱柱的的顶端端滤塞塞上上或或注注入入进样器的液流中。器的液流中。由由于于进样器器的的死死体体积以以及及进样时的的液液流流扰动引引起起色色谱峰不峰不对称和展称和展宽。解解决决：试样注注入入柱柱顶端端中中心心点点或或填填料料中中心心12mm处。b.柱柱后后展展宽：主主要要由由接接管管、检测器器流流通通池池体体积所所引起引起.解解决决：连接接管管的的体体积、检测器器的的死死体体积应尽尽可可能能小小.08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 3.3高效液相色高效液相色谱的主要的主要类型及其分离原理型及其分离原理类型型：液：液-液色液色谱；液；液-固色固色谱；离子交；离子交换色色谱；离子；离子对色色谱；离子色；离子色谱；空；空间排阻色排阻色谱08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 一一.液液-液分配色液分配色谱法及化合法及化合键合相色合相色谱 1.特点特点：a.流流动相和固定相都是液体相和固定相都是液体b.两相两相应互不相溶，有明互不相溶，有明显的分界面的分界面 2.分离机制：分离机制：试样组分溶于流分溶于流动相后相后,在固定相和在固定相和流流动相之相之间的相的相对溶解度存在差异溶解度存在差异，溶，溶质在两相在两相间进行分配。行分配。K=cs/cm=kVm/Vs 分离的分离的顺序序决定于分配系数的大小，分配系数大决定于分配系数的大小，分配系数大的的组分保留分保留值大大.而且流而且流动相的种相的种类对分配系数分配系数有有较大的影响大的影响.08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 3.解决固定液流失解决固定液流失问题方法：方法：1)采用正或反相色采用正或反相色谱a.正相液正相液-液色液色谱法法：流：流动相的极性相的极性小于小于固定液的极性（流固定液的极性（流疏固疏固亲；适用于分离极性物；适用于分离极性物质）b.反相液反相液-液色液色谱法法：流：流动相的极性相的极性大于大于固定液的极性（流固定液的极性（流亲固疏；适用于分离非极性物固疏；适用于分离非极性物质）2)采用化学采用化学键合固定相合固定相化学化学键合固定相合固定相：将固定相上的各种不同有机基：将固定相上的各种不同有机基团通通过化学反化学反应共价共价键合到硅胶（担体）表面的合到硅胶（担体）表面的游离游离羟基上，形成化学基上，形成化学键合固定相合固定相.目前反相目前反相键合相色合相色谱法，已成法，已成为高效液相色高效液相色谱中中应用最广泛的一个分支。用最广泛的一个分支。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 二二.液液-固色固色谱法（或液法（或液-固吸附色固吸附色谱法）法）1.特点特点：流：流动相相为液体，固定相液体，固定相为吸附吸附剂。2.分离机制：根据物分离机制：根据物质吸附作用的不同来吸附作用的不同来进行分离。行分离。吸附作用大即分配系数大的吸附作用大即分配系数大的组分，吸附分，吸附剂对它的吸它的吸附力附力强，保留，保留值就大就大,出峰晚，后出来出峰晚，后出来.3.作用作用：a.适用分离相适用分离相对分子分子质量中等油性量中等油性试样。b.对具具有有不不同同官官能能团的的化化合合物物和和异异构构体体有有较高高的的选择性。性。缺点缺点：由于非：由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾性等温吸附常引起峰的拖尾现象象.08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 三、离子三、离子对色色谱法法 1.特点特点：离子：离子对色色谱法法对各种各种强极性的有机酸或有极性的有机酸或有机碱的分离，分离效能高，分析速度快，操作机碱的分离，分离效能高，分析速度快，操作简便便.2.分离机制分离机制：将一种或多种与溶：将一种或多种与溶质电荷相反的离子荷相反的离子（称（称为对离子或反离子）加到流离子或反离子）加到流动相或固定相中，相或固定相中，使其与溶使其与溶质离子离子结合形成疏水型离子合形成疏水型离子对化合物，从化合物，从而控制溶而控制溶质离子的保留行离子的保留行为。X+水相水相+Y水相水相X+Y有机有机相相试样离子离子X进入柱内以后，与入柱内以后，与对离子离子Y生成疏水性离子生成疏水性离子对XY，后者在疏水性固定相表面分配或吸附。，后者在疏水性固定相表面分配或吸附。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 3.离子离子对色色谱法分法分类正相离子正相离子对色色谱法法(极性固定相，非常性流极性固定相，非常性流动相）相）反相离子反相离子对色色谱法（非极性固定相，极性流法（非极性固定相，极性流动相相v如含有如含有对离子离子Y的甲醇水（或乙的甲醇水（或乙腈水）溶水）溶液）。液）。可见保留值随KXY和Y-水相的增大而增大。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 4.应用用：解决了以往：解决了以往难分离混合物的分离分离混合物的分离问题.如酸、碱和离子、非离子的混合物，特如酸、碱和离子、非离子的混合物，特别是一是一些生化些生化试样如核酸、核苷、儿茶酚胺、生物碱如核酸、核苷、儿茶酚胺、生物碱及及药物的分离了。物的分离了。还可借助离子可借助离子对的生成的生成给试样引入紫外吸收或引入紫外吸收或发荧光的基光的基团，提高，提高检测的灵敏度。的灵敏度。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 四四.离子交离子交换色色谱法法 1.分离机制分离机制70/2；离子交；离子交换树脂上可脂上可电离的离子离的离子与流与流动相中具有相同相中具有相同电荷的溶荷的溶质离子离子进行可逆交行可逆交换，依据，依据这些离子些离子对交交换剂具有不同的具有不同的亲和力而和力而将它将它们分离。分离。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 3.a.分配系数分配系数D愈大，表示溶愈大，表示溶质的离子与离子交的离子与离子交换剂的相互作用愈的相互作用愈强。b.亲合力高的，在柱中保留合力高的，在柱中保留值就愈大就愈大.4.应用用：a.凡在溶凡在溶剂中能中能够解离的物解离的物质。b.已成功地分离氨基酸、核酸、蛋白已成功地分离氨基酸、核酸、蛋白质等等.08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 五、离子色五、离子色谱法法 1.构成：构成：固定相固定相:离子交离子交换树脂脂流流动相相:电解解质溶液溶液检测器器:电导检测器器主配件：抑制柱（抑制主配件：抑制柱（抑制流流动相中相中强电解解质背景背景离子的干离子的干扰）。）。2.流程流程图：fig3-208级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 双柱型原理：离子交换原理双柱型原理：离子交换原理(以分离阴离子为例）。以分离阴离子为例）。1)分离柱：离子交换分离柱：离子交换(阴离子交换剂）阴离子交换剂）ROH+Na+Br-(待测待测)RBr-+Na+OH-（交换）（交换）R RBr-Br-+Na+OH+Na+OH (洗洗脱脱剂)R ROH-+Na+Br-OH-+Na+Br-（洗（洗脱脱）2)抑制柱抑制柱:消除本底电导影响（阳离子交换剂）消除本底电导影响（阳离子交换剂）RH+Na+OH-(流动相流动相)RNa+H2O RH+Na+Br-(流动相流动相)RNa+H+Br-洗洗脱脱液液(NaOH)转转化化为为低低电电导导的的水水，消消除除本本底底电电导导影影响响；待待测测离离子子(Br-)转化为具有更大淌度的酸转化为具有更大淌度的酸(HBr)，提高检测灵敏度。，提高检测灵敏度。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 a.双柱型：化学抑制型离子色双柱型：化学抑制型离子色谱法（高法（高电导洗脱洗脱液：阳离子用无机酸如液：阳离子用无机酸如HCl,阴离子用阴离子用NaOH)；b.单柱型：非抑制型，用低柱型：非抑制型，用低电导的洗脱液的洗脱液(阴离阴离子用苯甲酸子用苯甲酸盐或或邻苯二甲酸苯二甲酸盐等稀溶液，阳离等稀溶液，阳离子用稀硝酸、乙二胺硝酸子用稀硝酸、乙二胺硝酸盐稀溶液，不用抑制稀溶液，不用抑制柱）；柱）；3.应用用：离子色离子色谱法是目前唯一快速、灵敏和准确的多法是目前唯一快速、灵敏和准确的多组分分析的方法因而得到广泛重分分析的方法因而得到广泛重视和迅速和迅速发展。展。从无机和有机阴离子到金属阳离子，从有机阳从无机和有机阴离子到金属阳离子，从有机阳离子到糖离子到糖类、氨基酸等均可用、氨基酸等均可用该法分析法分析.08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 六、空六、空间排阻色排阻色谱法法 1.固定相：凝胶固定相：凝胶 2.机制机制73/-9：类似于分子似于分子筛作用，分离只与凝胶的孔径作用，分离只与凝胶的孔径分布和溶分布和溶质的流体力学体的流体力学体积和分子大小有关和分子大小有关.排阻法是建立在分子大小的基排阻法是建立在分子大小的基础上的。上的。组分分中太大的分子不能中太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，先入胶孔而受到排阻，先出峰；出峰；组分中太小的分子可以分中太小的分子可以进入所有胶体入所有胶体微孔中，最后出峰。微孔中，最后出峰。洗脱次序将取决于相洗脱次序将取决于相对分子分子质量的大小，相量的大小，相对分子分子质量大的先洗脱，相量大的先洗脱，相对分子分子质量小的量小的后洗脱。后洗脱。分子的形状也分子的形状也对保留有重要的作用。保留有重要的作用。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 3.分离示意分离示意图，fig3-3 a.排斥极限排斥极限A点点74/2;3:b.全渗透极限全渗透极限B点点74/2;6:相相对分子分子质量介于上述量介于上述两个极限之两个极限之间的化合物，的化合物，将按相将按相对分子分子质量降低的量降低的次序被洗脱而可以分离次序被洗脱而可以分离.4.特点特点75/2;3:1）试样色色谱峰全部在溶峰全部在溶剂的保留的保留时间前出峰。前出峰。2）用于分离相）用于分离相对分子分子质量大的化量大的化合物（合物（约为2000以上）；以上）；3）只能分离相）只能分离相对分子分子质量差量差别在在10%以上的分子。以上的分子。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 3.4 液相色液相色谱法固定相法固定相 色色谱柱是色柱是色谱法的心法的心脏，固定相及装柱技，固定相及装柱技术是关是关键.一、液一、液-液色液色谱法、法、键合相色合相色谱法及离子法及离子对色色谱法固定相法固定相1.全多孔型担体：直径小于全多孔型担体：直径小于10m,由由nm级的硅胶微粒堆聚而的硅胶微粒堆聚而成成为5m直径的全多孔型担体。直径的全多孔型担体。颗粒小，柱效高。粒小，柱效高。2.表表层多孔型担体：直径多孔型担体：直径为3040m的的实心核心核(玻璃微珠玻璃微珠)，表表层上附有一上附有一层厚度厚度约为12 m的多孔硅胶，填柱容易，重的多孔硅胶，填柱容易，重现性好，但性好，但试样容量低。目容量低。目前前510m直径是使用最广泛的高效填料。直径是使用最广泛的高效填料。3.化学化学键合固定相（合固定相（P76及及P69）定定义：用化学反：用化学反应的方法通的方法通过化学化学键把有机分子把有机分子结合到担合到担体表面体表面.08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 化学键合固定相化学键合固定相根据在硅胶表面的化学反根据在硅胶表面的化学反应不同，不同，键合固定相合固定相可分可分为：硅氧碳：硅氧碳键型（型（Si-O-C)；硅氧硅碳；硅氧硅碳键型（型（Si-O-Si-C);硅碳硅碳键型（型（Si-C)；硅氮；硅氮键型（型（Si-N)。硅硅烷化反化反应：08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 化学键合固定相的特点：化学键合固定相的特点：（1）表面没有液坑，比一般液体固定相）表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多；快得多；（2）无固定液流失，增加了色）无固定液流失，增加了色谱柱的柱的稳定性和寿命；定性和寿命；（3）可以）可以键合不同的官能合不同的官能团，能灵活地改，能灵活地改变选择性，性，应用于多种色用于多种色谱类型及型及样品的分析；品的分析；（4）有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的）有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和器和馏分的收集。分的收集。分离机制分离机制77/2：既不是全部吸附：既不是全部吸附过程，亦不是典型的液程，亦不是典型的液-液分配液分配过程，而是双重机制兼而有之，只是按程，而是双重机制兼而有之，只是按键合量合量的多少而各有的多少而各有侧重重.08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 二、液二、液-固吸附色固吸附色谱法固定相法固定相目前目前较常用常用5-10m的硅胶微粒（全多孔型）的硅胶微粒（全多孔型）.三、离子交三、离子交换色色谱法固定相法固定相 1.薄膜型离子交薄膜型离子交换树脂，以薄壳玻珠脂，以薄壳玻珠为担体，表面涂担体，表面涂1%离离子交子交换树脂脂.2.离子交离子交换键合固定相：用化学反合固定相：用化学反应将离子交将离子交换基基团键合在合在惰性担体表面。惰性担体表面。a.键合薄壳型：担体，薄壳玻珠；合薄壳型：担体，薄壳玻珠；b.键合微粒担体型：担体，微粒硅胶合微粒担体型：担体，微粒硅胶.四、排阻色四、排阻色谱法固定相法固定相a.软质凝胶：葡萄糖凝胶；凝胶：葡萄糖凝胶；琼脂糖凝胶；脂糖凝胶；(水流水流动相相,常常压)b.半硬半硬质凝胶：交凝胶：交联聚苯乙聚苯乙烯凝胶；凝胶；(有机溶有机溶剂，较高高压)c.硬硬质凝胶：多孔硅胶；多孔玻珠；凝胶：多孔硅胶；多孔玻珠；(高速高速)08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 3.5 液相色液相色谱法流法流动相相1.重要性：重要性：GC载气气仅三四种，要提高柱效三四种，要提高柱效选择性，主要是改性，主要是改变固定相的性固定相的性质；LC则不同，当固定相不同，当固定相选定定时，流，流动相的种相的种类，配比能，配比能显著地影响分离效果，因此著地影响分离效果，因此流流动相的相的选择很重要。很重要。2.选择流流动相相应注意的因素注意的因素79/2：5点点，08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 选择流流动相的注意因素：相的注意因素：（1）流）流动相的相的纯度：一般是采用分析度：一般是采用分析纯试剂，必要，必要时需需进一步一步纯化，以除去干化，以除去干扰的的杂质。（2）应避免使用会引起柱效避免使用会引起柱效损失或保留失或保留值特性特性变化化的溶的溶剂。（固定相不能吸附溶。（固定相不能吸附溶剂或与流或与流动相互溶。相互溶。）（3）对试样要有适宜的溶解度，否要有适宜的溶解度，否则会在柱会在柱头易易产生沉淀。生沉淀。（4）溶）溶剂的粘度小些的粘度小些为好，否好，否则会降低会降低试样组分的分的扩散系数，造成散系数，造成传质速率速率缓慢，柱效下降。慢，柱效下降。（5）应柱柱检测器相匹配器相匹配（溶（溶剂不能被相不能被相应的的检测器器检测出来）出来）08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 3.溶溶剂的的选择79/-3：a.依据依据：溶：溶剂的极性是重要依据。的极性是重要依据。b.溶溶剂极性极性顺序，水最大，煤油最小。序，水最大，煤油最小。c.采用多元采用多元组合溶合溶剂系系统作作为流流动相（底相（底液和洗脱液）（底液和洗脱液）（底剂决定基本的色决定基本的色谱分离分离情况；洗脱情况；洗脱剂则调节试样组分的滞留并分的滞留并对几个具有几个具有选择性的分离作用）性的分离作用）d.根据不同的方法根据不同的方法选择合适的底液和洗脱合适的底液和洗脱液液08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 选用溶剂的依据：溶剂的极性。选用溶剂的依据：溶剂的极性。正相色正相色谱：底：底剂（弱极性）洗脱（弱极性）洗脱剂（极性（极性较强）反相色反相色谱：水（主体）有机溶：水（主体）有机溶剂调节剂。离子交离子交换色色谱：组分保留分保留值通通过流流动相的离子相的离子强度（度（盐的的浓度）和度）和pH来控制。增加来控制。增加盐的的浓度，保度，保留留值降低；阳离子交降低；阳离子交换柱流柱流动相相pH增加，保留增加，保留值增加，阴离子交增加，阴离子交换柱相反。柱相反。排阻色排阻色谱：所用的溶：所用的溶剂必必须与凝胶本身非常相似与凝胶本身非常相似，这样才能才能润湿凝胶并防止吸附作用。湿凝胶并防止吸附作用。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 3-6 3-6 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 high performance liquid chromatographhigh performance liquid chromatograph08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 液相色谱仪（液相色谱仪（2 2）08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 液相色谱仪（液相色谱仪（3 3）08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 液相色谱仪（液相色谱仪（4 4）08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 3.6 高效液相色高效液相色谱仪一、概述一、概述80/1：高效液相色：高效液相色谱仪一般都具一般都具备贮液器、高液器、高压泵、梯度洗提装置、梯度洗提装置、进样器、色器、色谱柱、柱、检测器、恒温器、器、恒温器、记录仪等主要部件。等主要部件。二、二、结构示意构示意图，fig3-4.三、部件介三、部件介绍 1.高高压泵（压力力150 350105 Pa）要求要求：a.流量要流量要稳定；定；80/-1b.压力平力平稳无脉无脉动；81/2.c.对流速要有一定的可流速要有一定的可调范范围.81/4.动画08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 类型：型：a.往复式柱塞往复式柱塞泵是目前广泛使用的是目前广泛使用的恒流恒流泵.机理机理特点特点81/-2;6:1)不受整个色不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有体系中其余部分阻力稍有变化的影响，化的影响，连续供供给恒定体恒定体积的流的流动相相；2）可方便地通）可方便地通过改改变柱塞冲程的大小或往复的柱塞冲程的大小或往复的频率来率来调节流流量；量；3）由于死体）由于死体积小（小（约0.1mL），更），更换溶溶剂方便，很适用于梯方便，很适用于梯度洗提度洗提.不足不足：1）输出有脉冲波出有脉冲波动，会干，会干扰检测器正常工作；器正常工作；2）由于）由于产生生基基线噪声而影响噪声而影响检测的灵敏度的灵敏度.08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 b.气气动放大放大泵恒恒压泵原理：原理：p1SA=p2SB 其工作原理其工作原理:这是一种恒是一种恒压泵。特点特点82/-6:1）能供）能供给无脉冲的无脉冲的稳定定流量的流量的输出出.2）液缸体）液缸体积大，更大，更换流流动相不方便；相不方便；3）不便于梯度洗提）不便于梯度洗提.4）适合匀）适合匀浆法填装色法填装色谱柱。柱。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 2.梯度洗提（梯度洗脱、梯度淋洗）装置梯度洗提（梯度洗脱、梯度淋洗）装置82/a.作用：作用：与与GC 中的程序升温一中的程序升温一样.（P22、23）b.定定义83/1：所：所谓梯度洗提，就是梯度洗提，就是载液中含有两种以上液中含有两种以上不同极性的溶不同极性的溶剂，在分离在分离过程中按一定的程序程中按一定的程序连续改改变载液中溶液中溶剂的配比和极性，通的配比和极性，通过载液中极性的液中极性的变化来改化来改变被分离被分离组分的分离因素，以分的分离因素，以提高分离效果提高分离效果。应用梯度用梯度洗提洗提还可以使分离可以使分离时间缩短，分辨能力增加，短，分辨能力增加，还可提高可提高最小最小检测量和定量分析的精度。量和定量分析的精度。外梯度外梯度（低（低压梯度）：先混合后梯度）：先混合后输入色入色谱柱；柱；内梯度内梯度（高（高压梯度）：先梯度）：先泵入梯度混合室再入色入梯度混合室再入色谱柱；柱；08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 3.进样装置装置 a.重要性重要性83/1：进样方式及方式及试样体体积对柱效有很柱效有很大影响大影响.要要获得良好的分离效果和重得良好的分离效果和重现性，需要性，需要将将试样“浓缩”地瞬地瞬间注入色注入色谱柱入担体的中心柱入担体的中心成一个点。成一个点。b.进样方式方式1）注射器）注射器进样装置：装置：由于不能承受高由于不能承受高压，所以需用停流，所以需用停流进样方法，但方法，但该方式无法取得精确的保留方式无法取得精确的保留时间，峰形的重，峰形的重现性性亦亦较差差.08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 2）高高压定量定量进样阀通通过进样阀（通常是六通（通常是六通阀）直接向）直接向压力系力系统内内进样而不而不必停止流必停止流动相的一种装置（相的一种装置（fig3-7）a.进样准准备：1和和6，2和和3连通，通，试样由由5、4注入定量管注入定量管；b.进样：阀芯芯顺时针旋旋转600，这时1和和2，3和和4，5和和6连通，通，试样送入柱中送入柱中.特点：特点：进样准确，重准确，重现性好，适于定量分析性好，适于定量分析.08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 4.色色谱柱柱a.参数：参数：id，4.6或或3.9 mm；L=15-30cm；填料填料颗粒度，粒度，5-10 m；n=5000-10000 b.发展展趋势1）减小填料粒度，）减小填料粒度，3-5 m；2）减小柱内径，）减小柱内径，1mm；c.装填方式装填方式1）干法，填料粒度大于）干法，填料粒度大于20 m；2）湿法（匀）湿法（匀浆法），粒度小于法），粒度小于20 m；(生成匀生成匀浆，高，高压装柱）装柱）08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 5.检测器器要求要求84/-1：具有灵敏度高、重：具有灵敏度高、重现性好、响性好、响应快、快、现性范性范围宽、适、适用范用范围广、广、对流流动相和温度波相和温度波动不敏感、死体不敏感、死体积小等特小等特点点.a.紫外光度紫外光度检测器器85/11）原理，被分析）原理，被分析试样组分分对特定波特定波长紫外光的紫外光的选择性吸收性吸收，组分分浓度与吸光度关系遵守比度与吸光度关系遵守比尔定律定律2）光路）光路图，图3-8；3）特点特点85/3；a.具有很高灵具有很高灵敏度；敏度；b.对温度和流速不敏感，温度和流速不敏感，可用于梯度洗提可用于梯度洗提.缺点缺点：不适用于：不适用于对紫外光紫外光不吸收的不吸收的试样.4）发展展85-1；光；光电二极管二极管211/1024个个阵列列检测器器.08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展；光光电电二二极极管管阵阵列列检检测测器器：211/1024个个二二极极管管阵阵列列，各各检检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Analytical 仪器仪器分析分析分析分析 b.荧光光检测器器86/1）原理：）原理：许多物多物质，特，特别是具有是具有对称共称共轭结构的构的有机芳有机芳环分子受紫外光激分子受紫外光激发后，能后，能辐射出比紫外射出比紫外光波光波长较长的的荧光，某些不光，某些不发射射荧光的物光的物质亦可亦可通通过化学衍生化学衍生转变成能成能发出出荧光的物光的物质而得到而得到检测。2）光路）光路图：图3-11；3）特点：）特点：荧光光检测器比紫外光度器比紫外光度检测器的灵敏度器的灵敏度要高要高2个数量个数量级。但。但线性范性范围仅103，利用可，利用可调谐的激光作光源（的激光作光源（激光激光诱导荧光光）可）可使使检测灵敏度和准确度都得到提高。灵敏度和准确度都得到提高。08级仪器分析教程（2009-2010学年)Instrumental Anal