药物定量分析与分析方法验证 .ppt

药物定量分析与分析方法验药物定量分析与分析方法验证证 现在学习的是第1页，共66页 一、掌握定量分析方法验证的效能指标。一、掌握定量分析方法验证的效能指标。二、熟悉定量分析样品的前处理方法。二、熟悉定量分析样品的前处理方法。三、了解定量分析样品的前处理方法的进展三、了解定量分析样品的前处理方法的进展 及在药物分中的应用。及在药物分中的应用。基本要求基本要求现在学习的是第2页，共66页第一节定量分析样品的前处理方法第一节定量分析样品的前处理方法第二节第二节 生物样品分析的前处理技术生物样品分析的前处理技术第三节第三节 分析方法的效能指标分析方法的效能指标主要内容主要内容现在学习的是第3页，共66页定量分析方法特点定量分析方法特点 一、容量分析法一、容量分析法 （一）容量分析法的（一）容量分析法的特点特点 方法简便易行方法简便易行 方法耐用性高方法耐用性高 测定结果准确（测定结果准确（RSDRSD0.2%0.2%）现在学习的是第4页，共66页（二）容量分析法的（二）容量分析法的计算计算问题问题 1.1.滴定度（滴定度（T T）的概念的概念 每每1 1mlml规定浓度的滴定液相当于被测物质的量规定浓度的滴定液相当于被测物质的量(mg)mg)2.2.滴定度的计算滴定度的计算 aA aA+bB cC bB cC+dD dD T T（mg/mlmg/ml）=m=m a/b M 3.3.百分含量的计算百分含量的计算 （1 1）直接滴定法）直接滴定法 D%=D%=V V F F T/WT/W 100%100%F F=实际标定的浓度实际标定的浓度/规定的浓度规定的浓度 （2 2）间接滴定法（回滴定法；剩余滴定法）间接滴定法（回滴定法；剩余滴定法）D%=D%=（V VO O V VB B)F F T T/W W 100%100%现在学习的是第5页，共66页1 1乙乙酰酰水水杨杨酸的含量酸的含量测测定：取本品定：取本品1.504.g1.504.g，准，准确加入确加入氢氢氧化氧化钠钠滴定液滴定液(0.5mol/L)50.0ml(0.5mol/L)50.0ml，水浴，水浴上煮沸上煮沸15min15min，放冷后以酚，放冷后以酚酞为酞为指示指示剂剂，用硫酸，用硫酸滴定液滴定液(0.25mol/L,F=1.004)(0.25mol/L,F=1.004)滴定，并将滴定滴定，并将滴定结结果用空白果用空白实验实验校正，每校正，每1ml1ml氢氢氧化氧化钠钠滴定液滴定液(0.5mol/L)(0.5mol/L)相当于相当于45.04mg45.04mg乙乙酰酰水水杨杨酸。酸。样样品消品消耗硫酸滴定液耗硫酸滴定液(0.25mol/L,F=1.004)17.05ml(0.25mol/L,F=1.004)17.05ml，空白消耗空白消耗49.95ml49.95ml，求本品的含量？，求本品的含量？现在学习的是第6页，共66页2 2盐酸氯丙嗪片剂的含量测定：取本品盐酸氯丙嗪片剂的含量测定：取本品20片，片，精密称定为精密称定为8.100g，研细，精密称取，研细，精密称取0.4800g片片粉，置于粉，置于500ml量瓶中，加酸及水溶解并稀释至量瓶中，加酸及水溶解并稀释至刻度，取上清液刻度，取上清液5.00ml，置，置100ml量瓶中，加水量瓶中，加水至刻度，在至刻度，在254nm测得吸收度为测得吸收度为0.540，已知盐，已知盐酸氯丙嗪在酸氯丙嗪在254nm的的E为为915，标示量为，标示量为50mg/片，计算标示量百分数？片，计算标示量百分数？现在学习的是第7页，共66页复方酮康唑乳膏中丙酸氯倍他索的含量测定：按复方酮康唑乳膏中丙酸氯倍他索的含量测定：按HPLC法，法，取本品约取本品约4 g，精密称定（，精密称定（4.0125g）,加无水乙醇适量，加无水乙醇适量，水浴加热使溶解，并稀释至水浴加热使溶解，并稀释至50.0ml，滤过，精密量取续，滤过，精密量取续滤液滤液10 l，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取丙酸氯，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取丙酸氯倍他索对照品适量，精密称定，加无水乙醇溶解并定量稀倍他索对照品适量，精密称定，加无水乙醇溶解并定量稀释制成每释制成每1 ml中含丙酸氯倍他索中含丙酸氯倍他索20.2g的溶液，摇匀，的溶液，摇匀，同法测定。按外标法以峰面积计算。测得对照液中丙酸氯同法测定。按外标法以峰面积计算。测得对照液中丙酸氯倍他索的峰面积为倍他索的峰面积为778；供试液中丙酸氯倍他索的峰面积；供试液中丙酸氯倍他索的峰面积为为768。已知乳膏规格：。已知乳膏规格：10mg酮康唑和酮康唑和0.25mg丙酸氯倍丙酸氯倍他索他索/g，计算丙酸氯倍他索相当于标示量的百分含量，计算丙酸氯倍他索相当于标示量的百分含量?现在学习的是第8页，共66页对乙酰氨基酚的含量测定：取本品，精密称定对乙酰氨基酚的含量测定：取本品，精密称定（101.2mg），置），置500mL量瓶中，加甲醇量瓶中，加甲醇100mL溶解，加水至刻度，摇匀。精密吸取溶解，加水至刻度，摇匀。精密吸取5mL，置，置100mL量瓶中，加水至刻度，作为供试液。另用量瓶中，加水至刻度，作为供试液。另用相同溶剂配制对乙酰氨基酚对照液相同溶剂配制对乙酰氨基酚对照液（10.2g/mL），于），于244nm处，以水为空白，分处，以水为空白，分别测定供试液和对照液的吸光度，按公式别测定供试液和对照液的吸光度，按公式10C（A样样/A对对）计算供试品中对乙酰氨基酚的）计算供试品中对乙酰氨基酚的mg数。数。式中式中C代表对照液浓度。测得供试液的吸光度为代表对照液浓度。测得供试液的吸光度为 0.435，对照溶液为，对照溶液为0.441。计算对乙酰氨基酚的。计算对乙酰氨基酚的百分含量？并解释上述计算公式中百分含量？并解释上述计算公式中10的由来的由来?现在学习的是第9页，共66页（一）紫外（一）紫外-可见分光光度法（可见分光光度法（200200nmnm760nm)760nm)灵敏度高，可达灵敏度高，可达10-4g/ml 10-7g/ml 1.特点特点 准确度高，准确度高，SRD（%）为为2%5%5%专属性差专属性差 简便易行：仪器价格低廉，操作简单，易简便易行：仪器价格低廉，操作简单，易 普及，应用范围广。普及，应用范围广。2.2.比耳比耳-朗伯定律朗伯定律 A=ECLA=ECL 二、光谱分析法二、光谱分析法现在学习的是第10页，共66页 3.3.仪器校正和检定仪器校正和检定 波长校正用汞灯中较强谱线波长校正用汞灯中较强谱线237.38,253.65,275.28,296.73,237.38,253.65,275.28,296.73,313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07 313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07nmnm与与576.96576.96nmnm 或用仪器中氘灯的或用仪器中氘灯的486.02486.02nmnm与与656.10656.10nmnm进行校正。进行校正。吸收度的检定：用吸收度的检定：用K K2 2CrOCrO7 7(60mg)+0.005mol/LH(60mg)+0.005mol/LH2 2SOSO4 4液至液至10001000mlml 波长波长(nm)235(nm)235(最小最小)257()257(最大最大)313()313(最小最小)350()350(最大最大)E E1%1%1 1cmcm 124.5 144.0 48.62 106.6 124.5 144.0 48.62 106.6 杂散光检查：杂散光检查：试剂试剂 浓度浓度(g/ml)g/ml)测定波长测定波长 透光率透光率(%)(%)NaI 1.00 220nm NaI 1.00 220nm 0.8 0.8 NaNO NaNO2 2 5.00 340nm 5.00 340nm 0.8 0.8现在学习的是第11页，共66页 4.4.对溶剂的要求对溶剂的要求:220 220240nm 241240nm 241250nm 251250nm 251300nm 300nm300nm 300nm以上以上 溶剂溶剂+吸收池吸收池A 0.41 0.41 0.20 0.20 0.10 0.10 0.050.05 5.5.测定方法测定方法 要求供试品溶液的要求供试品溶液的A A应在应在0.3 0.3 0.70.7 对照品比较法：对照品比较法：C Cx x=(=(A Ax x/A Ar r)C Cr r;含量含量%=%=C Cx xD/WD/W100%100%常用方法常用方法 吸收系数法：吸收系数法：计算分光光度法：计算分光光度法：现在学习的是第12页，共66页（二）荧光分光光度法（二）荧光分光光度法 灵敏度高灵敏度高，可达，可达10-10g/ml 10-12g/ml 在在低浓度低浓度进行测定，防止进行测定，防止F与与C不成正比及自熄灭作用不成正比及自熄灭作用 1.特点特点 用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减 灵敏度高，但灵敏度高，但干扰因素多干扰因素多。制备荧光制备荧光衍生物衍生物，可提高其灵敏度和选择性。，可提高其灵敏度和选择性。用样品用样品量少量少，操作，操作简单简单，方法，方法快速快速，应用，应用范围范围较较广广。现在学习的是第13页，共66页2.荧光分析仪荧光分析仪 有二个单色光器有二个单色光器激发单色光器与发射单色光激发单色光器与发射单色光 器；且激发光源、样品池和检测器成直角。器；且激发光源、样品池和检测器成直角。3.含量测定含量测定 常用的方法对照品比较法常用的方法对照品比较法:Ci=(Ri-Rib)/(Rr-Rrb)C Cr r Ch.P收载收载地高辛片、利血平片、洋地黄毒苷片。地高辛片、利血平片、洋地黄毒苷片。现在学习的是第14页，共66页 三、色谱分析法三、色谱分析法 按分离原理分为按分离原理分为：吸附；分配；离子交换；排阻色谱：吸附；分配；离子交换；排阻色谱 方法分类方法分类 按分离方法分为按分离方法分为：PC；TLC；柱色谱；柱色谱；GC；HPLC（一）（一）HPLC法法 1.对对HPLC仪器一般要求仪器一般要求 色谱柱、流动相按品种项下要求。色谱柱、流动相按品种项下要求。色谱柱的理论板数：色谱柱的理论板数：n 2.系统性试验系统性试验 分离度：分离度：R 拖尾因子：拖尾因子：T 重现性：重现性：现在学习的是第15页，共66页 内标法加校正因子测定供试品中主成分含量内标法加校正因子测定供试品中主成分含量3.测定方法测定方法 标准曲线法标准曲线法 外标法测定供试品中主成分含量外标法测定供试品中主成分含量 外标一点法外标一点法 应用示例：应用示例：RP-HPLC法测定盐酸黄酮哌酯片含量，用标准曲线法法测定盐酸黄酮哌酯片含量，用标准曲线法 如头孢拉丁；头孢羟氨苄；头孢唑啉钠用外标一点法如头孢拉丁；头孢羟氨苄；头孢唑啉钠用外标一点法现在学习的是第16页，共66页 （二）（二）GC法法 1.对对GC仪器一般要求仪器一般要求 载气为载气为氮气氮气；色谱柱为填充或毛细管柱；色谱柱为填充或毛细管柱 色谱柱的理论板数：色谱柱的理论板数：n 2.系统性试验系统性试验 分离度：分离度：R 拖尾因子：拖尾因子：T 现在学习的是第17页，共66页 内标法加校正因子测定供试品中主成分含量内标法加校正因子测定供试品中主成分含量 3.测定方法测定方法 标准曲线法标准曲线法 外标法测定供试品中主成分含量外标法测定供试品中主成分含量 外标一点法外标一点法 应用示例：应用示例：Ch.P(2000)收载的月桂卓酮、维生素收载的月桂卓酮、维生素E及其片剂、注及其片剂、注 射剂、甲酚皂溶液等均采用射剂、甲酚皂溶液等均采用GC法中的内标法加校正法中的内标法加校正 因子测定含量。因子测定含量。现在学习的是第18页，共66页 1.1.为什么要对定量分析的样品进行前处理？为什么要对定量分析的样品进行前处理？含卤素有机药物含卤素有机药物 R-X（F，Cl,Br,I）金属有机药物金属有机药物 R-O-Me（有机酸或酚的有机酸或酚的 含金属有机药物含金属有机药物 金属盐；结合不牢固）金属盐；结合不牢固）有机金属药物有机金属药物 R-Me（结合牢固）结合牢固）2.常用的处理方法常用的处理方法 不经有机破坏的分析方法不经有机破坏的分析方法 药物分析中常用的分析方法药物分析中常用的分析方法 经有机破坏的分析方法经有机破坏的分析方法概述概述现在学习的是第19页，共66页（一）直接测定法（一）直接测定法 例如：富马酸亚铁例如：富马酸亚铁 溶于热稀矿酸，采用铈量法溶于热稀矿酸，采用铈量法 ，邻二氮菲，邻二氮菲作指示剂作指示剂 不经有机破坏的分析方法不经有机破坏的分析方法现在学习的是第20页，共66页（二）经水解后测定法（二）经水解后测定法 1.直接回流后测定法直接回流后测定法 例如：三氯叔丁醇的含量测定例如：三氯叔丁醇的含量测定 CCl3-C(CH3)2-OH+4NaOH (CH3)2CO+3NaCl+HCOONa+2H2O NaCl +AgNO3 AgCl +NaNO3 AgNO3 +NH4SCN AgSCN +NH4NO3 2.用硫酸水解后测定法用硫酸水解后测定法 例如：硬脂酸镁的含量测定例如：硬脂酸镁的含量测定 Mg(C17H35COO)2 +H2SO4 MgSO4 +2C17H35COOH H2SO4 +2NaOH Na2SO4 +2H2O 现在学习的是第21页，共66页（三（三）经氧化还原后测定法经氧化还原后测定法 1.碱性还原后碱性还原后测定测定 例如：泛影酸的含量测定例如：泛影酸的含量测定 2.酸性还原后酸性还原后测定测定 例如：碘番酸的含量测定例如：碘番酸的含量测定 Zn还原还原 后银量法后银量法 现在学习的是第22页，共66页 3.利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量 （1）含锑药物）含锑药物 例如：葡萄糖酸锑的含量测定例如：葡萄糖酸锑的含量测定 Sb5+2KI Sb3+2K+I2 I2 +2Na2S2O3 2NaI +Na2S4O6 （2）含铁药物含铁药物 2Fe3+2KI 2Fe2+2K+I2 I2 +2Na2S2O3 2NaI +Na2S4O6H+现在学习的是第23页，共66页经有机破坏的分析方法经有机破坏的分析方法1.适合对象：适合对象：含金属、含金属、X、N、S、P等有机药物，与等有机药物，与C原原子结合牢固子结合牢固2.分类：分类：湿法破坏：湿法破坏：主要用于含主要用于含N有机药物；主要以硫酸作为有机药物；主要以硫酸作为分解剂，并结合氧化剂（硝酸、高氯酸、过氧化氢、分解剂，并结合氧化剂（硝酸、高氯酸、过氧化氢、高锰酸钾等）高锰酸钾等）干法破坏：干法破坏：现在学习的是第24页，共66页凯氏定氮法原理NH2硝化生成硝化生成NH4：与碱作用，通过蒸馏释放出与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于，收集于H3BO3 溶液中溶液中 用已知浓度的用已知浓度的H2SO4（或（或HCl）标准溶液滴定，根据酸消耗的量）标准溶液滴定，根据酸消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量现在学习的是第25页，共66页消解剂消解剂1.作用：作用：缩短消解时间，避免铵盐分解。缩短消解时间，避免铵盐分解。2.硫酸钾：硫酸钾：提高硫酸沸点，以提高消解温度；提高硫酸沸点，以提高消解温度；3.催化剂：催化剂：汞盐、硒盐、铜盐等，其中以硫酸铜最汞盐、硒盐、铜盐等，其中以硫酸铜最常用。常用。4.对于含氮杂环结构，消解中需要加入辅助氧化剂，对于含氮杂环结构，消解中需要加入辅助氧化剂，使分解完全并缩短消解时间，常用为使分解完全并缩短消解时间，常用为30%过氧化过氧化氢和高氯酸。氢和高氯酸。现在学习的是第26页，共66页现在学习的是第27页，共66页注意事项1.样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以免被检样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。样消化不完全，结果偏低。2.消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢过氧化氢（H2O2）2-3ml，促使氧化。，促使氧化。3.在整个消化过程中不要用强火。保持和缓沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在在整个消化过程中不要用强火。保持和缓沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。4.如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用。因此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸氨作用。因此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。的量。5.加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。作碱性反应的指示剂。6.混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。甲基红乙醇溶液。7.氨是否完全蒸馏出来，可用氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性。试纸试馏出液是否为碱性。现在学习的是第28页，共66页干法破坏1.适用范围：适用范围：主要用于含主要用于含X、S、P等有机药物，也等有机药物，也用于含硒和砷盐的检查用于含硒和砷盐的检查2.分类：分类：1）高温炽灼法：）高温炽灼法：高温灼烧灰化转变成无机元素或盐；高温灼烧灰化转变成无机元素或盐；主要用于：含主要用于：含X、P和砷盐检查和砷盐检查2）氧瓶燃烧法）氧瓶燃烧法现在学习的是第29页，共66页高温炽灼法高温炽灼法药物类型辅助添加物（促进灰化）检查方法-I无水碳酸钠紫色碘蒸气F、Br、Cl无水碳酸钠（或钾）卤素鉴别P氧化锌钼蓝比色法砷盐无水碳酸钠砷盐检查法现在学习的是第30页，共66页1.原理：原理：将待测元素有机药物在密闭的燃烧瓶中充分燃烧，彻将待测元素有机药物在密闭的燃烧瓶中充分燃烧，彻底分解成底分解成CO2和水，而待测元素转化成不同价态的氧化物（或无和水，而待测元素转化成不同价态的氧化物（或无氧酸），被适当吸收液吸收后采用适宜方法分析。氧酸），被适当吸收液吸收后采用适宜方法分析。2.仪器装置：仪器装置：500ml,1000ml,2000ml,磨口、硬质玻璃锥形瓶磨口、硬质玻璃锥形瓶3.吸收液的选择：吸收液的选择：用于用于X、S、Se等的鉴别、检查、含量测定时等的鉴别、检查、含量测定时多数是多数是H2O或或H2O-NaOH；少数为少数为H2O-NaOH-H2O2氧燃瓶燃烧法氧燃瓶燃烧法现在学习的是第31页，共66页吸收液的选择吸收液的选择药物类型燃烧产物吸收液检查方法FHFH2O茜素氟蓝比色ClHClH2O-NaOH银量法BrBr2、HBrH2O-NaOH（H2SO3）银量法IH2O-NaOH（H2SO3）碘量法SSO3H2O浓H2O2沉淀法PP2O5H2O少量硝酸钼蓝比色法现在学习的是第32页，共66页一、生物样品内药物分析的性质、意义和任务一、生物样品内药物分析的性质、意义和任务（一）生物样品内药物分析的性质（一）生物样品内药物分析的性质 生物样品内药物分析，又称体液药物分析、生物药生物样品内药物分析，又称体液药物分析、生物药物分析，是随着临床药学、临床药理学的发展和需要而建物分析，是随着临床药学、临床药理学的发展和需要而建立起来的一门新兴学科。旨在通过各种分析手段，了解药立起来的一门新兴学科。旨在通过各种分析手段，了解药物在生物样品内的数量和质量变化，获得药物代谢动力学物在生物样品内的数量和质量变化，获得药物代谢动力学的各种参数、药物在生物样品内的生物转化、代谢的方式的各种参数、药物在生物样品内的生物转化、代谢的方式和途径等信息，从未为药品生产、临床医疗、实验研究等和途径等信息，从未为药品生产、临床医疗、实验研究等方面对栓研究的药物作出估计与评价，对药物的改进与发方面对栓研究的药物作出估计与评价，对药物的改进与发展作出贡献。展作出贡献。生物样品分析的前处理技术生物样品分析的前处理技术现在学习的是第33页，共66页二、生物样品内药物分析的对象与特点二、生物样品内药物分析的对象与特点（一）生物样品内药物分析的对象（一）生物样品内药物分析的对象 生物样品内药物分析的目标，不仅是母体药物也包括代谢产物，因生物样品内药物分析的目标，不仅是母体药物也包括代谢产物，因为代谢产物常具有生理活性，弄清它们的种类、结构、数量及分布情况，为代谢产物常具有生理活性，弄清它们的种类、结构、数量及分布情况，可了解药物在生物体内的变化及消除规律，这对安全用药和正确评价药可了解药物在生物体内的变化及消除规律，这对安全用药和正确评价药物质量也是非常重要的。物质量也是非常重要的。由于新药进入临床试验之前，或者对老药在某一方面的重新评价，一般由于新药进入临床试验之前，或者对老药在某一方面的重新评价，一般要求现在动物体上进行实验，所以生物样品内药物分析对象不仅是人体，要求现在动物体上进行实验，所以生物样品内药物分析对象不仅是人体，也包括动物体。也包括动物体。生生物物样样品品脏器组织脏器组织体液体液血液血液、尿液、唾液、毛发、乳汁、尿液、唾液、毛发、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等胃液、胰液、淋巴液、粪便等现在学习的是第34页，共66页（二）生物样品内药物分析的特点（二）生物样品内药物分析的特点 与常规药物分析相比，生物样品内药物分析在灵敏度与常规药物分析相比，生物样品内药物分析在灵敏度和选择性等方面有较高的要求。微量药物存在于大量生物介和选择性等方面有较高的要求。微量药物存在于大量生物介质中，样品中含内源性干扰杂质，这些干扰物质又随疾病情质中，样品中含内源性干扰杂质，这些干扰物质又随疾病情况不同而有所不同。很多药物在生物样品内经过代谢可产生况不同而有所不同。很多药物在生物样品内经过代谢可产生一种或多种代谢物，母体药物和代谢物又能同生物大分子结一种或多种代谢物，母体药物和代谢物又能同生物大分子结合，这一切给药物分离、分析带来困难，这就要求分析方法合，这一切给药物分离、分析带来困难，这就要求分析方法具有更高的选择性。另外，在生物样品中，药物浓度都很低，具有更高的选择性。另外，在生物样品中，药物浓度都很低，一般血药浓度在一般血药浓度在1010-6-6-10-10-9-9 g/ml g/ml之间，且生物样品若为血液，采之间，且生物样品若为血液，采集量又受到一定限制，因此要求分析方法要有较高的灵敏度。集量又受到一定限制，因此要求分析方法要有较高的灵敏度。1.1.干扰杂质多干扰杂质多 2.2.样品量少样品量少 3.3.要求较快提供结果。要求较快提供结果。现在学习的是第35页，共66页一、常用样品的制备与贮藏一、常用样品的制备与贮藏 1.血样血样2.血液中药物浓度可以较好地体现药物浓度和治疗作用之间的关血液中药物浓度可以较好地体现药物浓度和治疗作用之间的关系系最常用的生物样本最常用的生物样本血浆：加抗凝剂，凝固后离心血浆：加抗凝剂，凝固后离心血清：放置凝固血清：放置凝固全血：加抗凝剂混合全血：加抗凝剂混合贮藏条件：冰箱冷藏或冷冻贮藏条件：冰箱冷藏或冷冻-70度度 一、样品的种类、采集和贮藏一、样品的种类、采集和贮藏 现在学习的是第36页，共66页血样的采集血样的采集 一般用注射器直接采集静脉血，每次一般用注射器直接采集静脉血，每次1 1 5ml5ml；动物实验时，；动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一采血量不宜超过动物总血量的十分之一 测测定定血血中中药药物物的的浓浓度度，通通常常是是指指测测定定血血浆浆或或血血清清中中的的药药物物浓浓度度，尤其是血浆，并非指全血尤其是血浆，并非指全血血样的制备血样的制备现在学习的是第37页，共66页血浆的制备血浆的制备血浆的制备血浆的制备 采集的静脉血液置含有抗凝剂的试管中，混合后，以采集的静脉血液置含有抗凝剂的试管中，混合后，以25002500 3000r/min3000r/min离心离心5 5 10min10min使与血球分离，所得淡黄色上清液即为血浆使与血球分离，所得淡黄色上清液即为血浆抗凝剂抗凝剂最常用的是最常用的是肝素肝素其它抗凝剂其它抗凝剂EDTAEDTA、枸橼酸盐、草酸盐等、枸橼酸盐、草酸盐等血清的制备血清的制备1.采集的静脉血液置试管中，于采集的静脉血液置试管中，于37或室温放置或室温放置30min1h。血。血液凝固后，用细竹棒或玻璃棒轻轻剥去试管壁上的血饼，再在液凝固后，用细竹棒或玻璃棒轻轻剥去试管壁上的血饼，再在25003000 r/min离心离心510min，上层淡黄色液体即为血清，上层淡黄色液体即为血清现在学习的是第38页，共66页全血的制备全血的制备某些情况血浆内药物浓度波动大，或血浆浓度低，可用全血（全血净某些情况血浆内药物浓度波动大，或血浆浓度低，可用全血（全血净化较血浆和血清麻烦）化较血浆和血清麻烦）血浆和血浆和红细胞中分配比不是常数，红细胞中分配比不是常数，红细胞中分配比不是常数，红细胞中分配比不是常数，则应使用全血样品则应使用全血样品全血制备全血制备1.将采集的血液置含有抗凝剂的试管中，但不经离心操作，将采集的血液置含有抗凝剂的试管中，但不经离心操作，保持血浆和血细胞均相状态，即为保持血浆和血细胞均相状态，即为“全血全血”现在学习的是第39页，共66页（二）尿液（二）尿液(urine)(urine)尿尿液液用用于于药药物物剂剂量量回回收收、药药物物尿尿清清除除率率、生生物物利利用用度度的的研研究究，预测药物代谢过程、类型预测药物代谢过程、类型 体体内内药药物物清清除除主主要要是是通通过过尿尿液液排排出出，药药物物以以原原型型、代代谢谢物物等等多种形式排出多种形式排出用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度、内源性活性用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度、内源性活性物质、药物代谢分型及代谢物等的研究测定物质、药物代谢分型及代谢物等的研究测定注意饮食对尿样的影响；注意饮食对尿样的影响；立即测定，否则加入防腐剂贮藏立即测定，否则加入防腐剂贮藏现在学习的是第40页，共66页（三）唾液（三）唾液 （salivasaliva）唾液唾液无损伤取样，易收集；无损伤取样，易收集；一些药物的唾液药浓一些药物的唾液药浓(S)(S)与血浆游离药浓与血浆游离药浓(P)(P)密切相关密切相关TDMTDM中利用对中利用对S S的测定代替对的测定代替对P P的监测的监测药代动力学的研究药代动力学的研究现在学习的是第41页，共66页唾液采集唾液采集 在在潄潄口口后后15min15min，安安静静状状态态下下采采集集口口腔腔内内自自然然流流出出的的唾唾液液；也可在刺激下快速采样也可在刺激下快速采样(需注意干扰需注意干扰)物理法物理法：口嚼石腊片、聚四氟乙烯块或纱布球等：口嚼石腊片、聚四氟乙烯块或纱布球等化学法化学法：将柠檬酸或维生素：将柠檬酸或维生素C C等置于舌尖，弃去初始部分后采集等置于舌尖，弃去初始部分后采集 唾唾液液样样品品采采集集后后，应应立立即即测测量量其其除除去去泡泡沫沫部部分分的的体体积积，以以3000rpm3000rpm离离心心10min10min，取上清液直接测定或冷冻保存，取上清液直接测定或冷冻保存唾液样品的制备唾液样品的制备现在学习的是第42页，共66页现在学习的是第43页，共66页生物样品预处理的目的生物样品预处理的目的u使待测药物游离使待测药物游离 测定药物的总浓度测定药物的总浓度 满足测定方法的要求满足测定方法的要求 特异性强、灵敏度高的分析方法特异性强、灵敏度高的分析方法 预处理简单预处理简单 不具备分离功能的方法不具备分离功能的方法(光谱法光谱法)预处理十分重要预处理十分重要u改改善善分分析析环环境境防防止止分分析析仪仪器器的的污污染染和和劣劣化化，提提高高分分析析仪仪器器的的耐耐受受程程度度、改改善分析结果善分析结果二、二、生物样品分析前处理技术生物样品分析前处理技术现在学习的是第44页，共66页一、常用体内样品预处理方法一、常用体内样品预处理方法血浆、血清血浆、血清常需去除蛋白质常需去除蛋白质唾液唾液主要采用离心沉淀除去粘蛋白主要采用离心沉淀除去粘蛋白尿液尿液常采用酸或酶法使缀合物水解常采用酸或酶法使缀合物水解现在学习的是第45页，共66页三、生物样品的预处理方法三、生物样品的预处理方法 1 1去除蛋白法去除蛋白法 2 2缀合物的水解缀合物的水解 3 3分离、纯化与浓集分离、纯化与浓集 4.4.化学衍生法化学衍生法 现在学习的是第46页，共66页 （一）（一）去除蛋白质的方法去除蛋白质的方法 1.1.加入沉淀剂和变性试剂加入沉淀剂和变性试剂蛋白质脱水沉淀蛋白质脱水沉淀 2.2.加入与水相混溶的有机溶剂加入与水相混溶的有机溶剂 3.3.酶水解酶水解现在学习的是第47页，共66页（二）缀合物的水解（二）缀合物的水解缀合物缀合物 药药物物或或其其代代谢谢物物与与体体内内的的内内源源性性物物质质（葡葡萄萄糖糖醛醛酸酸、硫硫酸酸、甘氨酸、谷胱甘肽等）结合生成的产物甘氨酸、谷胱甘肽等）结合生成的产物 测测定定尿尿液液中中药药物物总总量量时时需需先先行行水水解解从从缀缀合合物物中中释释放放药药物物现在学习的是第48页，共66页 缀合物的水解方法缀合物的水解方法 酸酸水水解解使使用用盐盐酸酸，该该法法比比较较简简便便、快快速速；与与酶酶水水解解相比专一性较差、有些药物在水解中易分解相比专一性较差、有些药物在水解中易分解 酶酶水水解解专专一一性性较较强强、药药物物无无分分解解；时时间间长长、费费用用大大，异性蛋白对于迂酸及受热不稳定的药物，可以采用酶水解法异性蛋白对于迂酸及受热不稳定的药物，可以采用酶水解法 现在学习的是第49页，共66页（三）分离、纯化与浓集（三）分离、纯化与浓集在生物样品的制备过程中，进行选择性在生物样品的制备过程中，进行选择性分离与浓集分离与浓集分离分离消除内源性物质、代谢物或其它共存药物的干扰消除内源性物质、代谢物或其它共存药物的干扰浓集浓集提高被测药物的提高被测药物的灵敏度灵敏度 样样品品经经分分离离、纯纯化化与与浓浓集集与与测测定定方方法法相相结结合合，达达到到专专属属性性强强、灵灵敏敏度度高高、准确性好准确性好 现在学习的是第50页，共66页生物样品的分离、纯化与浓集方法生物样品的分离、纯化与浓集方法液液液萃取法液萃取法(传统的方法传统的方法)固相萃取法固相萃取法(液液固萃取法固萃取法)超滤法超滤法 现在学习的是第51页，共66页化学衍生化法1.（1）使药物具有能被分离的性质）使药物具有能被分离的性质1.（2）提高分析检测的灵敏度）提高分析检测的灵敏度2.（3）增强药物的稳定性）增强药物的稳定性3.（4）提高对光学异构体分离的能力）提高对光学异构体分离的能力现在学习的是第52页，共66页现在学习的是第53页，共66页 一一、精密度、精密度 是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果之间的是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果之间的接近程度接近程度。（一）精密度表示方法（一）精密度表示方法 1.偏差偏差(deviation,d)2.标准偏差标准偏差（standard deviation,SD或或S）3.相对标准差相对标准差(relative standard deviation,RSD)也称变异系数也称变异系数(coefficient of variation,CV)分析方法的效能指标批内精密度批内精密度 批间精密度批间精密度现在学习的是第54页，共66页 二、准确度二、准确度 是指用该方法是指用该方法测定结果与真实值接近的程度测定结果与真实值接近的程度，用，用回收率回收率表表示示（一）含量测定方法的准确度（一）含量测定方法的准确度 1.原料药原料药 可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建准确度的另一方法测定的结果进行比较。准确度的另一方法测定的结果进行比较。2.制剂制剂 要考察要考察辅料对回收率的影响辅料对回收率的影响。采用在空白辅料中加入原。采用在空白辅料中加入原料对照品的方法作回收率试验，然后计算料对照品的方法作回收率试验，然后计算RSD。现在学习的是第55页，共66页空空白白回回收收率率 空空白白+已已知知量量A的的对对照照品品（或或标标准准品品）测测定定，测测定定值值为为M 加加样样回回收收率率 已已准准确确测测定定药药物物含含量量P的的真真实实样样品品+已已知知量量A的的对对照照品品（或或标准品）测定，测定值为标准品）测定，测定值为M现在学习的是第56页，共66页（二）数据要求（二）数据要求 回收率回收率%=（测定值（测定值-空白值）空白值）/加入量加入量100%具体做法：测定高、中、低三个浓度，具体做法：测定高、中、低三个浓度，n=3,共共9个数据来评价回收个数据来评价回收率的率的RSD3%；用用UV和和HPLC法时，一般回收率要求法时，一般回收率要求95%105%现在学习的是第57页，共66页 三三、检测限（、检测限（limit of detection,LOD)是指试样中被测物能被检测出的是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量最低浓度或量，是限度检验指标。，是限度检验指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。目视法目视法 信噪比法信噪比法现在学习的是第58页，共66页四、定量限（四、定量限（limit of quantitation,LOQ)是指样品中是指样品中被测物能被被测物能被定量测定定量测定的最低量的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定时，要求解产物进行定量测定时，要求LOQ.常用信噪比常用信噪比法确定定量限，一般以法确定定量限，一般以S/N=10时相应的浓度进时相应的浓度进行测定。行测定。现在学习的是第59页，共66页 是指在其他成分是指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。采用的方法能准确测定出被测物的特性。（一）鉴别反应（一）鉴别反应 应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分 的样品均应呈现负反应。的样品均应呈现负反应。（二）含量测定和杂质测定二）含量测定和杂质测定 色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。五、专属性五、专属性现在学习的是第60页，共66页 六、线性六、线性 范围范围 是指在设定的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈是指在设定的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比正比关关系的系的程度程度。UV法：首先制备标准系列，浓度点法：首先制备标准系列，浓度点n=5;A=0.30.7 建立回归方程建立回归方程C=aA+b;r 0.9999。HPLC法：制备一个标准系列，浓度点法：制备一个标准系列，浓度点n=5 7;以以C对对h或或A或与内标或与内标物的峰面积之比，建立回归方程物的峰面积之比，建立回归方程r 0.999。现在学习的是第61页，共66页范围范围 是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限度或量的区间适用的高低限度或量的区间。原料药和制剂