干细胞的体外培养精选PPT.ppt

关于干细胞的体外培养第1页，讲稿共74张，创作于星期六一、干细胞的概念一、干细胞的概念n干干细细胞胞(stem cells,SC)是是一一类类具具有有自自我我复复制制能能力力(self-renewing)的的多多潜潜能能细细胞胞，在在一一定定条条件件下下，它它可可以以分分化化成成多多种种功功能细胞。能细胞。n干干细细胞胞是是一一种种未未充充分分分分化化，尚尚不不成成熟熟的的细细胞胞，具具有有再再生生各各种种组组织织器器官官和和人人体体的的潜在功能，医学界称之为潜在功能，医学界称之为“万用细胞万用细胞”。第2页，讲稿共74张，创作于星期六干细胞几个主要特征干细胞几个主要特征l具有自我更新能力与自我维持能力，可以无限增殖具有自我更新能力与自我维持能力，可以无限增殖分裂。干细胞一旦形成，在机体内终生都具有自分裂。干细胞一旦形成，在机体内终生都具有自我更新能力，以维持我更新能力，以维持自身数目的恒定自身数目的恒定。l既具有生理性的更新能力，也具有对损伤或疾病导致既具有生理性的更新能力，也具有对损伤或疾病导致的反应有修复能力，如骨髓间充质干细胞等。的反应有修复能力，如骨髓间充质干细胞等。干细胞维持自稳性的机制：对称分裂和不对称分裂干细胞维持自稳性的机制：对称分裂和不对称分裂第3页，讲稿共74张，创作于星期六 4 干细胞的对称分裂和不对称分裂干细胞的对称分裂和不对称分裂对对对对称分裂称分裂称分裂称分裂 （symmetry divisionsymmetry division）不不不不对对对对称分裂称分裂称分裂称分裂 （asymmetry divisionasymmetry division）干细胞干细胞 分分 化化 细细 胞胞 干细胞干细胞 分化细胞分化细胞第4页，讲稿共74张，创作于星期六干细胞几个主要特征干细胞几个主要特征l干细胞本身不是终末分化细胞；具有多向分化的能力干细胞本身不是终末分化细胞；具有多向分化的能力（多能性或全能性），即可以分化发育成各种胚层组织（多能性或全能性），即可以分化发育成各种胚层组织的细胞（的细胞（ES细胞），或可以分化成为本系统各谱系的细胞（特细胞），或可以分化成为本系统各谱系的细胞（特定组织干细胞，如造血干细胞）。定组织干细胞，如造血干细胞）。第5页，讲稿共74张，创作于星期六干细胞几个主要特征干细胞几个主要特征l干细胞的自我更新与分化需要特定的微环境，也就是说干干细胞的自我更新与分化需要特定的微环境，也就是说干细胞往哪一种方向分化，必须在该细胞生存的特定微环境细胞往哪一种方向分化，必须在该细胞生存的特定微环境前提下进行分化。已有诸多的实验表明，如将前提下进行分化。已有诸多的实验表明，如将ES细胞种植入细胞种植入小鼠大脑内，这些干细胞将向神经系统分化。小鼠大脑内，这些干细胞将向神经系统分化。在不同生在不同生长长因子刺激因子刺激下干下干细细胞可表胞可表现现出不出不同分化潜能同分化潜能第6页，讲稿共74张，创作于星期六干细胞几个主要特征干细胞几个主要特征l干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运保持为干细胞或保持为干细胞或分化为特定细胞。分化为特定细胞。第7页，讲稿共74张，创作于星期六二、干细胞的分类二、干细胞的分类1、按分化潜能大小来分类、按分化潜能大小来分类:全能干细胞（全能干细胞（Totipotent stem cell）：能分化成所有组织和器官的干细胞，它具有形成完整个体的分化潜能。如受精卵，胚胎干细胞。多多能干细胞（能干细胞（pluripotent stem cell），具有分化出多种组 织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育 潜能受到一定的限制。如骨髓多能造血干细胞是典型的例 子，它可分化出至少十二种血细胞。专能干细胞（专能干细胞（unipotent stem cell），这类干细胞只能向 一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织 基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等。第8页，讲稿共74张，创作于星期六2、根据来源来分、根据来源来分:来源于胚胎来源于胚胎-胚胎干细胞胚胎干细胞 ESC （Embryonic Stem Cell）胚胎性生殖细胞胚胎性生殖细胞 EGC （Embryonic Germ Cell）来源于成体组织来源于成体组织-成体干细胞成体干细胞 ASC （Adult-derived Stem Cell）第9页，讲稿共74张，创作于星期六胚胎干细胞胚胎干细胞指从着床前的胚胎内细胞团指从着床前的胚胎内细胞团（桑椹胚）（桑椹胚）或原始生或原始生殖细胞获得的一种具有多潜能性、可发育成为各殖细胞获得的一种具有多潜能性、可发育成为各种细胞、同时可保持不分化状态而持续生长的克种细胞、同时可保持不分化状态而持续生长的克隆细胞系。隆细胞系。它可以无限增殖并分化成为全身它可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，进一步多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织、器官。为全能干细胞。形成机体的所有组织、器官。为全能干细胞。第10页，讲稿共74张，创作于星期六成体干细胞成体干细胞是成体组织内具有自我更新及分化是成体组织内具有自我更新及分化是成体组织内具有自我更新及分化是成体组织内具有自我更新及分化一种或一种以一种或一种以一种或一种以一种或一种以上子细胞的未成熟细胞。上子细胞的未成熟细胞。上子细胞的未成熟细胞。上子细胞的未成熟细胞。来源于成年组织或器官，一般具有组织特异性，只能来源于成年组织或器官，一般具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。为多能干细胞或单能干细分化成特定的细胞或组织。为多能干细胞或单能干细胞，如造血干细胞和上皮干细胞等。胞，如造血干细胞和上皮干细胞等。第11页，讲稿共74张，创作于星期六3、根据干细胞组织发生的名称进行分类、根据干细胞组织发生的名称进行分类:胎胎干细胞胎胎干细胞造血干细胞造血干细胞骨髓间质干细胞骨髓间质干细胞肌肉干细胞肌肉干细胞成骨干细胞成骨干细胞内胚层干细胞内胚层干细胞视网膜干细胞视网膜干细胞胰腺干细胞胰腺干细胞第12页，讲稿共74张，创作于星期六三、干细胞研究的历史情况三、干细胞研究的历史情况 n1959年，美国首次报道了通过体外受精（年，美国首次报道了通过体外受精（IVF）动物。）动物。n60年代，几个近亲种系的小鼠睾丸畸胎瘤的研究表明其来源于年代，几个近亲种系的小鼠睾丸畸胎瘤的研究表明其来源于胚胎生殖细胞（胚胎生殖细胞（embryonic germ cells,EG细胞）细胞）,此工作确此工作确立了胚胎癌细胞（立了胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cells,EC细胞）细胞）是一种干细胞。是一种干细胞。n1968年，年，Edwards 和和Bavister 在体外获得了第一个人卵子。在体外获得了第一个人卵子。n70年代，年代，EC细胞注入小鼠胚泡产生杂合小鼠。培养的细胞注入小鼠胚泡产生杂合小鼠。培养的EC细胞细胞作为胚胎发育的模型，虽然其染色体的数目属于异常。作为胚胎发育的模型，虽然其染色体的数目属于异常。n1978年，第一个试管婴儿在英国诞生。年，第一个试管婴儿在英国诞生。第13页，讲稿共74张，创作于星期六n1981年，从小鼠胚泡内细胞团分离出小鼠年，从小鼠胚泡内细胞团分离出小鼠ES细胞，细胞，并建并建立了小鼠立了小鼠ES细胞体外培养条件。将细胞体外培养条件。将ES细胞注入小鼠，能诱细胞注入小鼠，能诱导形成畸胎瘤。导形成畸胎瘤。n1984-1988年，年，Anderews 等人从人睾丸畸胎瘤细胞系等人从人睾丸畸胎瘤细胞系Tera-2中产生出多能的、可鉴定的（克隆化的）细胞，称之为胚胎癌中产生出多能的、可鉴定的（克隆化的）细胞，称之为胚胎癌细胞（细胞（embryonic carcinoma cells,EC细胞）。克隆的人细胞）。克隆的人EC细胞在视黄酸的作用下分化形成神经元样细胞和其他类型细胞在视黄酸的作用下分化形成神经元样细胞和其他类型的细胞。的细胞。n1989年，年，Pera 等分离了一个人等分离了一个人EC细胞系，此细胞系能产生细胞系，此细胞系能产生出三个胚层的组织。这些细胞是非整倍体的（比正常细胞染色体出三个胚层的组织。这些细胞是非整倍体的（比正常细胞染色体多或少），他们在体外的分化潜能是有限的。多或少），他们在体外的分化潜能是有限的。第14页，讲稿共74张，创作于星期六n1998年美国有两个小组分别培养出了人的多能干细胞：年美国有两个小组分别培养出了人的多能干细胞：James A.Thomson在在 Wisconsin大学领导的研究小组的方法是：人大学领导的研究小组的方法是：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取 inner cell mass细细胞，建立细胞株。胞，建立细胞株。John D.Gearhart在在 Johns Hopkins大学领大学领导的另一个研究小组的方法是：从受精后导的另一个研究小组的方法是：从受精后59周人工流产的胚胎周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞中提取生殖母细胞(primordial germ cell)，建立细胞株。，建立细胞株。n1999年年12月，美国科学家在月，美国科学家在美国科学院院刊美国科学院院刊报告说，报告说，小鼠肌小鼠肌肉组织的成体干细胞可以肉组织的成体干细胞可以“横向分化横向分化”为血液细胞。为血液细胞。随后，世界随后，世界各国的科学家相继证实，成体干细胞，包括人类的成体干细胞具有可塑各国的科学家相继证实，成体干细胞，包括人类的成体干细胞具有可塑性。性。n1999年年12月，干细胞研究进展被月，干细胞研究进展被科学科学杂志评选为该年度世界杂志评选为该年度世界十大科学进展之首。十大科学进展之首。n2007年日本的年日本的Yamanaka研究小组和美国的研究小组和美国的James Thomson 研研究小组究小组分别获得诱导多能性干细胞分别获得诱导多能性干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS细胞）。细胞）。第15页，讲稿共74张，创作于星期六至今已分离得到的胚胎干细胞物种有：至今已分离得到的胚胎干细胞物种有：n小鼠的胚胎干细胞（小鼠的胚胎干细胞（1981）n金黄地鼠（金黄地鼠（1988）、貂（）、貂（1993）、猪（）、猪（1994，1997）、鸡（）、鸡（1996）、恒河猴（）、恒河猴（1995）、绒猴）、绒猴（1996）。）。n分离得到人的胚胎干细胞（分离得到人的胚胎干细胞（1998），胚胎生殖细胞），胚胎生殖细胞（1998），），n目前不断报道成年组织来源的的干细胞。目前不断报道成年组织来源的的干细胞。第16页，讲稿共74张，创作于星期六四、胚胎干细胞的体外培养胚胎干细胞的体外培养（一）技术原理（一）技术原理n基本原则：基本原则：促进促进ES增殖的同时，维持其未分化的二倍体状态。增殖的同时，维持其未分化的二倍体状态。n有有饲养层（饲养层（feeder layer）培养法：）培养法：以小鼠成纤维细胞耐硫代以小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系（鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系（STO）或小鼠胚胎成纤维细胞（）或小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse Embryo Firbroblasts,MEF）制备饲养细胞单层，）制备饲养细胞单层，主要是利用其分泌的生长因子主要是利用其分泌的生长因子FGF和抑制干细胞分化因子白血病和抑制干细胞分化因子白血病抑制因子（抑制因子（LIF）共同作用，保持干细胞在体外克隆而不分化。）共同作用，保持干细胞在体外克隆而不分化。n无饲养层培养法：无饲养层培养法：利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备条件利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备条件培养基或在基础培养基中加入重组的培养基或在基础培养基中加入重组的LIF制备条件培养基。制备条件培养基。第17页，讲稿共74张，创作于星期六（二）基本过程（二）基本过程饲养层细胞制备或条饲养层细胞制备或条件培养基制备件培养基制备胚胎的制备和培养胚胎的制备和培养胚胎干细胞的分离胚胎干细胞的分离胚胎干细胞的培养胚胎干细胞的培养胚胎干细胞的鉴定胚胎干细胞的鉴定冻存与复苏冻存与复苏细胞克隆细胞克隆形态形态碱性磷酸碱性磷酸酶检测酶检测核型的核型的鉴定鉴定分化能力分化能力的观察的观察嵌合能力嵌合能力的测定的测定第18页，讲稿共74张，创作于星期六1、饲养层细胞、饲养层细胞培养培养n小鼠胚胎成纤维细胞（小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）：取孕取孕12.5-14.5 d鼠胚胎躯干，以植块培养法或分散细胞培养法制备，鼠胚胎躯干，以植块培养法或分散细胞培养法制备，取第三代至第五代细胞作为饲养层细胞。取第三代至第五代细胞作为饲养层细胞。nSTO细胞：细胞：按照一般已建细胞系培养方法。按照一般已建细胞系培养方法。nDMEM加加10%小牛血清作为培养液。小牛血清作为培养液。n采用胎数多小鼠一次大量培养采用胎数多小鼠一次大量培养MEF冻存，用时复冻存，用时复苏。苏。第19页，讲稿共74张，创作于星期六 MEF和和STO的优缺点：的优缺点：nMEF分泌促进胚胎干细胞增殖和抑制分化因子的能力比分泌促进胚胎干细胞增殖和抑制分化因子的能力比STO强，强，STO作饲养细胞时常需在培养基中加入作饲养细胞时常需在培养基中加入LIF。nMEF不能长期传代，需经常准备怀孕小鼠制备第三代至第五代细不能长期传代，需经常准备怀孕小鼠制备第三代至第五代细胞，胞，STO则可长期传代培养。则可长期传代培养。nMEF不具耐药性，不能作为转染外源性基因的胚胎干细胞筛选用。不具耐药性，不能作为转染外源性基因的胚胎干细胞筛选用。nSNL细胞为转染了细胞为转染了neor抗性基因和抗性基因和LIF基因的基因的STO细胞，可分泌细胞，可分泌足够的抑制分化因子，并因带有足够的抑制分化因子，并因带有neor抗性基因可用于转基因胚胎抗性基因可用于转基因胚胎干细胞筛选。干细胞筛选。n胚胎干细胞培养过程中，死亡胚胎干细胞培养过程中，死亡MEF或或STO的染色体可能导致的染色体可能导致胚胎干细胞的突变及影响正常核型的保持。胚胎干细胞的突变及影响正常核型的保持。n不易获得纯的胚胎干细胞作为生化和分子生物学方面的分析。不易获得纯的胚胎干细胞作为生化和分子生物学方面的分析。n使用前如用丝裂霉素使用前如用丝裂霉素C处理，如清洗不彻底，残余的丝裂霉素处理，如清洗不彻底，残余的丝裂霉素C会会影响胚胎干细胞的增殖。影响胚胎干细胞的增殖。第20页，讲稿共74张，创作于星期六报道的人源性滋养层细胞：报道的人源性滋养层细胞：n人骨髓来源的间充质干细胞人骨髓来源的间充质干细胞n胎儿肌肉或胎儿皮肤细胞胎儿肌肉或胎儿皮肤细胞n新生儿包皮成纤维细胞新生儿包皮成纤维细胞n成人子宫内膜细胞成人子宫内膜细胞n人胎盘成纤维细胞人胎盘成纤维细胞n人胚胎干细胞经体内分化获取的间充质人胚胎干细胞经体内分化获取的间充质干细胞干细胞第21页，讲稿共74张，创作于星期六2、饲养单层制备、饲养单层制备MEF或或STO连连成成一一片片，以以含含10g/ml丝丝裂裂霉霉素素培培养养液液370C作作用用2-3 h（如如细细胞胞层层较较薄薄，也也可可缩缩短短至至30min-1.5h），或或射射线线照照射射（剂剂量量为为30-100Gy30-100Gy）。）。弃含弃含丝丝裂霉素培养液，裂霉素培养液，PBS洗洗5次，次，射射线处线处理者不用清洗。理者不用清洗。消消化化细细胞胞，制制备备悬悬液液种种植植至至用用0.1%0.1%明明胶胶处处理理过过（0.1%0.1%明明胶胶水水溶溶液液覆覆盖盖培培养养瓶瓶表表面面，室室温温2h2h以以上上）的的培培养养瓶瓶，种种植植细细胞胞数数：MEF7.5104-105个个/cm2，STO为为5104个个/cm2。培培养养至至细细胞胞连连成成一一片片没没有有间间隙隙（中中间间可可补补加加处处理理过过的的细细胞胞），制制备好的饲养单层置培养箱，备好的饲养单层置培养箱，5天内使用，使用前换成干细胞培养液。天内使用，使用前换成干细胞培养液。第22页，讲稿共74张，创作于星期六观察：观察：n好的饲养单层，细胞连成一片，无间隙，死亡细胞好的饲养单层，细胞连成一片，无间隙，死亡细胞和杂细胞极少。和杂细胞极少。nMEF和和STO产生的抑制分化因子一部分分泌到培养产生的抑制分化因子一部分分泌到培养液中，一部分锚定在细胞外基质上。无间隙的饲养液中，一部分锚定在细胞外基质上。无间隙的饲养单层保证了胚胎干细胞都能与饲养层细胞接触而达单层保证了胚胎干细胞都能与饲养层细胞接触而达到最佳效果。到最佳效果。第23页，讲稿共74张，创作于星期六3、用于培养胚胎干细胞的条件培养基、用于培养胚胎干细胞的条件培养基直接在胚胎干细胞培养液中加入重组的直接在胚胎干细胞培养液中加入重组的LIF，使终浓，使终浓度为度为1000U/ml。Baffalo大鼠肝细胞株大鼠肝细胞株BRL条件培养基（条件培养基（BRL-CM):能分泌抑制畸胎癌（瘤）和胚胎干细胞分化的因能分泌抑制畸胎癌（瘤）和胚胎干细胞分化的因子子DIF。收集培养。收集培养72h的培养液，过滤除菌，用前的培养液，过滤除菌，用前6-7份份+3-4份胚胎干细胞培养液，再添加份胚胎干细胞培养液，再添加8-10%胎牛血清。胎牛血清。年龄年龄 2-3周大鼠心肌细胞条件培养基（周大鼠心肌细胞条件培养基（RH-CM）：）：分泌抑制胚胎干细胞分化因子。收集分泌抑制胚胎干细胞分化因子。收集1-6代细胞培养代细胞培养液，过滤除菌，用前液，过滤除菌，用前6份份+3份胚胎干细胞培养液份胚胎干细胞培养液+1份份胎牛血清。胎牛血清。第24页，讲稿共74张，创作于星期六4、胚胎干细胞的分离和培养、胚胎干细胞的分离和培养（1）培养液）培养液n配制培养液要用超纯水或五蒸水，不能有细菌内毒素污染，水配制培养液要用超纯水或五蒸水，不能有细菌内毒素污染，水要现用现制。要现用现制。n高糖高糖DMEM作为基础培养基，葡萄糖浓度为（作为基础培养基，葡萄糖浓度为（4.5g/L）：）：有助于囊胚贴壁、内细胞团增殖及胚胎干细胞集落形成。有助于囊胚贴壁、内细胞团增殖及胚胎干细胞集落形成。n使用前还要添加使用前还要添加-巯巯基乙醇（基乙醇（0.1mmol/L）或）或单单硫甘油（硫甘油（0.15mmol/L）：保）：保护细护细胞内胞内酶酶和蛋白和蛋白质质中的中的巯巯基不被氧基不被氧化，促化，促进进胚胎干胚胎干细细胞的胞的贴贴壁和克隆形成。壁和克隆形成。使用前要添加使用前要添加15%胎牛血清：必不可少，但也有缺点。胎牛血清：必不可少，但也有缺点。第25页，讲稿共74张，创作于星期六血清缺点：血清缺点：成分复杂，不利于整合到胚胎干细胞基因组中外源性基因功能的测定；可能含有一些未知的促进胚胎干细胞分化的因子；含有微量的血红蛋白和内毒素，干扰胚胎干细胞生长。无血清胚胎干细胞培养液无上述缺点，但细胞贴附力不如有血清培养基。第26页，讲稿共74张，创作于星期六（2）胚胎干细胞的分离胚胎干细胞的分离小鼠：小鼠：母小鼠超数排卵交配（注射孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺母小鼠超数排卵交配（注射孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素）激素）胚胎采集：取孕胚胎采集：取孕3.5d（囊胚期或桑椹期）的母小鼠取胚胎（囊胚期或桑椹期）的母小鼠取胚胎胚胎培养：培养皿内制备直径胚胎培养：培养皿内制备直径0.5cm左右露滴状培养液液滴，并覆左右露滴状培养液液滴，并覆盖透明石蜡油，胚胎置于液滴中培养盖透明石蜡油，胚胎置于液滴中培养胚胎干细胞分离：普通分离法、免疫外科法，弃除滋胚层细胞，获得胚胎干细胞分离：普通分离法、免疫外科法，弃除滋胚层细胞，获得内细胞团（内细胞团（inner cell mass，ICM），并分散为），并分散为3-4个细胞在个细胞在一起的细胞团一起的细胞团第27页，讲稿共74张，创作于星期六人胚胎干细胞来源人胚胎干细胞来源 a.自终止妊娠（自终止妊娠（5-9周人工流产）的胎儿周人工流产）的胎儿中提取生殖母中提取生殖母细胞细胞(primordial germ cell)。28 29 b.b.b.b.取自体外受精胚胎囊胚期内层细胞。取自体外受精胚胎囊胚期内层细胞。取自体外受精胚胎囊胚期内层细胞。取自体外受精胚胎囊胚期内层细胞。用这种方法，用这种方法，每个胚胎可取得每个胚胎可取得1520个细胞用于培养。个细胞用于培养。c.c.通过体细胞核转移技术通过体细胞核转移技术（SCNTSCNT技术）技术）获取获取30 第30页，讲稿共74张，创作于星期六其它干细胞的分离与纯化其它干细胞的分离与纯化 n干细胞表面有许多干细胞表面有许多特殊的标记特殊的标记，以造血系统为例，以造血系统为例，干细胞的表面标志有干细胞的表面标志有Sca-1Sca-1和和c-kitc-kit等。另外各种等。另外各种成体干细胞还有各自独特的标记物，如人造血成体干细胞还有各自独特的标记物，如人造血干细胞表现为干细胞表现为CD34CD34+和和ThyThy10+10+而而CD10CD10，CD14CD14，CD15CD15，CD16CD16，CD19CD19，CD20CD20皆为阴性皆为阴性n另外干细胞还有不同于一般分化细胞的物理特另外干细胞还有不同于一般分化细胞的物理特性，比如干细胞不被染料性，比如干细胞不被染料Hoechst33324Hoechst33324和和Rhodamine123Rhodamine123染色。利用这些特性及表面标志，染色。利用这些特性及表面标志，采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即可分离采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即可分离纯化干细胞。纯化干细胞。第31页，讲稿共74张，创作于星期六（3）胚胎干细胞培养）胚胎干细胞培养有饲养层细胞培养：有饲养层细胞培养：n将内细胞团吸置处理过的饲养层上，一个内细胞团放置一个孔，将内细胞团吸置处理过的饲养层上，一个内细胞团放置一个孔，370C、5%CO2、饱和湿度培养、饱和湿度培养n2d后出现小集落，并逐步增大，后出现小集落，并逐步增大，6-10d可消化传代，消化时，可消化传代，消化时，消化消化30s后弃消化液，残余消化液继续作用，当饲养单层出现裂后弃消化液，残余消化液继续作用，当饲养单层出现裂隙（或显微镜下细胞之间分开），终止消化，一般为隙（或显微镜下细胞之间分开），终止消化，一般为2-3minn加适量培养液，轻轻吹打成单细胞悬液，接种新饲养层扩大培养。加适量培养液，轻轻吹打成单细胞悬液，接种新饲养层扩大培养。无饲养层培养：无饲养层培养：明胶包被培养板，条件培养基。明胶包被培养板，条件培养基。已建系胚胎干细胞：已建系胚胎干细胞：将已培养将已培养2-3d生长旺盛干细胞消化成单细生长旺盛干细胞消化成单细胞悬液，添加新的培养液，按照胞悬液，添加新的培养液，按照1：3或或1：6比例转钟。比例转钟。第32页，讲稿共74张，创作于星期六注意事项：注意事项：n最初分离的内细胞团以最初分离的内细胞团以3-4个细胞团为宜，但集落个细胞团为宜，但集落形成后，传代过程中一定要消化成单细胞，否则形成后，传代过程中一定要消化成单细胞，否则胚胎干细胞会互相诱导，易于分化。胚胎干细胞会互相诱导，易于分化。n培养条件要始终如一。培养条件要始终如一。n为了增强胚胎干细胞粘附力，除明胶包被外，还为了增强胚胎干细胞粘附力，除明胶包被外，还可以用纤维连接蛋白和多聚赖氨酸等促进粘附。可以用纤维连接蛋白和多聚赖氨酸等促进粘附。第33页，讲稿共74张，创作于星期六（4）培养结果）培养结果hES细胞集落（10）胚胎干细胞呈集落状（岛屿状）生长，边缘整齐，表面平滑，胚胎干细胞呈集落状（岛屿状）生长，边缘整齐，表面平滑，结构致密，隆起生长，细胞之间界限不清。消化成单细胞后细结构致密，隆起生长，细胞之间界限不清。消化成单细胞后细胞小而圆，核大，胞浆小。胞小而圆，核大，胞浆小。第34页，讲稿共74张，创作于星期六A phase contrast image of the pluripotent murine embryonic germ cell第35页，讲稿共74张，创作于星期六A culture dish containing hundreds of colonies of murine embryonic germ cells.Each red-stained spot represents an individual colony comprised of hundreds or thousands of stem cells.第36页，讲稿共74张，创作于星期六5、胚胎干细胞的冻存和复苏、胚胎干细胞的冻存和复苏n冻存液：胚胎干细胞培养液冻存液：胚胎干细胞培养液+10%-15%DMSO。n冻存细胞密度：冻存细胞密度：106-107个个/mln冻存与复苏方法同普通细胞。冻存与复苏方法同普通细胞。nLIF条件培养基培养的细胞，仍然用不含条件培养基培养的细胞，仍然用不含LIF的胚的胚胎干细胞培养液冻存。胎干细胞培养液冻存。第37页，讲稿共74张，创作于星期六（三）胚胎干细胞的鉴定（三）胚胎干细胞的鉴定1、ES细胞生物学特性细胞生物学特性（1）ES细胞形态结构及核型细胞形态结构及核型nES细胞具有与早期胚胎细胞相细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，胞体体积小，似的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。核大，有一个或几个核仁。n细胞中多为常染色质，胞质结构细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖体和线粒简单，散布着大量核糖体和线粒体，体，核型正常，保留了二倍体性核型正常，保留了二倍体性质质。正常。正常ES细胞染色体正常，如发细胞染色体正常，如发生异常则其很难发育分化形成动物生异常则其很难发育分化形成动物个体。个体。第38页，讲稿共74张，创作于星期六（2）ES细胞生长特性细胞生长特性nES细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个围有时可见单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。细胞和分化的扁平状上皮细胞。n ES细胞增殖迅速，每细胞增殖迅速，每1824 h分裂增殖分裂增殖 1次。次。n此外，其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存此外，其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征。性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征。第39页，讲稿共74张，创作于星期六40 人胚胎干细胞人胚胎干细胞(hES)(hES)的特点的特点 形形态态：圆圆形或形或椭椭圆圆，体，体积较积较小，小，核核质质比比较较大，体大，体外抑制分化培养外抑制分化培养时时呈呈鸟鸟巢状，集巢状，集落生落生长长并并紧紧密堆密堆积积，细细胞界限不胞界限不明明显显。第40页，讲稿共74张，创作于星期六 （3 3）ESES细胞的高度分化潜能细胞的高度分化潜能 ESES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分 化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，悬浮培养中：悬浮培养中：“简单类胚体简单类胚体”“囊状胚体囊状胚体”细胞分化物。细胞分化物。ESES细胞可进行诱导分化细胞可进行诱导分化 *用用RARA（维生素（维生素A A酸或视黄酸）作诱导酸或视黄酸）作诱导9090以上的以上的ESES细胞细胞 分化为神经胶质细胞，分化为神经胶质细胞，*聚集培养的聚集培养的ESES细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩 的心肌细胞。的心肌细胞。*将将ESES细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，其细胞细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，其细胞 组成可代表组成可代表3 3个胚层细胞。个胚层细胞。*用用ESES细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重 构胚和动物个体。构胚和动物个体。第41页，讲稿共74张，创作于星期六 （4 4）碱性磷酸酶的表达碱性磷酸酶的表达 许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶（细胞均有碱性磷酸酶（AKPAKP）表达，小鼠的）表达，小鼠的ECEC细胞和细胞和ESES细胞中均含有丰富的细胞中均含有丰富的AKPAKP。而在已分化的。而在已分化的ECEC细胞和细胞和ESES细细胞中胞中AKPAKP呈弱阳性或阴性。猪、兔的呈弱阳性或阴性。猪、兔的桑椹桑椹胚和早期囊胚胚和早期囊胚AKPAKP呈阳性。因此，呈阳性。因此，AKPAKP常用来作为鉴定常用来作为鉴定ECEC细胞或细胞或ESES细胞分细胞分化与否的标志之一。化与否的标志之一。第42页，讲稿共74张，创作于星期六 （5 5）胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达）胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达 早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原（早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原（SSEA-SSEA-1 1）。在胚胎的原始外胚层细胞、）。在胚胎的原始外胚层细胞、ESES细胞、细胞、ECEC细胞和原始生殖细胞的细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到表面均可检测到SSEA-1SSEA-1的表达。小鼠的表达。小鼠SSEA-1SSEA-1的表达自的表达自8 8细胞期开始，直细胞期开始，直到原始外胚层形成期。早期囊胚到原始外胚层形成期。早期囊胚ICMICM细胞全部呈强阳性，晚期囊胚中部细胞全部呈强阳性，晚期囊胚中部分分ICMICM呈强阳性，部分呈弱阳性，少部分为阴性。因此，呈强阳性，部分呈弱阳性，少部分为阴性。因此，SSEASSEA也常作也常作为为ESES细胞鉴定的一个标志。细胞鉴定的一个标志。第43页，讲稿共74张，创作于星期六 2、ES细胞的全能性主要体现在以下几方面：细胞的全能性主要体现在以下几方面：形成畸胎瘤。将形成畸胎瘤。将ES细胞注人同源动物皮下可形成畸胎瘤，包括三个细胞注人同源动物皮下可形成畸胎瘤，包括三个胚层细胞；胚层细胞；形成类胚体。培养形成类胚体。培养ES细胞在非粘附底物中悬浮生长，或控制增殖细胞在非粘附底物中悬浮生长，或控制增殖细胞数目，能够使之生成类胚体，它是一个与畸胎瘤相似的多种细胞细胞数目，能够使之生成类胚体，它是一个与畸胎瘤相似的多种细胞系混杂的集合体、具有三个胚层组织；系混杂的集合体、具有三个胚层组织；第44页，讲稿共74张，创作于星期六 直系分化。通过控制直系分化。通过控制ES细胞生长环境，或遗传操纵特定基因表细胞生长环境，或遗传操纵特定基因表达，达，ES细胞可直接分化成某特定种系细胞，例如将神经决定基因细胞可直接分化成某特定种系细胞，例如将神经决定基因NeuroD2和和NeuroD3转人转人ES细胞，可使之分化为神经细胞；细胞，可使之分化为神经细胞；形成嵌合体。将形成嵌合体。将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以形成嵌合体细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以形成嵌合体（chimera），），ES细胞可以参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。细胞可以参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。这是检验一个细胞系是否为这是检验一个细胞系是否为ES细胞的标准。细胞的标准。第45页，讲稿共74张，创作于星期六3 3、ESES细胞的鉴定细胞的鉴定-细胞的形态结构细胞的形态结构-核型分析核型分析-碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AKPAKP）染色）染色-SSEA-I-SSEA-I 免疫荧光标记免疫荧光标记-分化能力检测分化能力检测 体外分化试验体外分化试验 体内分化试验体内分化试验 嵌合体形成试验嵌合体形成试验 核移植试验核移植试验第46页，讲稿共74张，创作于星期六 （1 1）ESES细胞形态学鉴定细胞形态学鉴定 依依ESES细胞的形态结构（胞体体积小，核细胞的形态结构（胞体体积小，核大、有一个或几个核仁）和生长特性（呈克大、有一个或几个核仁）和生长特性（呈克隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，界限隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，界限不清）对不清）对ESES细胞进行初步鉴定。细胞进行初步鉴定。第47页，讲稿共74张，创作于星期六 （2 2）核型分析）核型分析 ESES细胞具有正常二倍体核型，细胞具有正常二倍体核型，可用核型分析进行检验可用核型分析进行检验第48页，讲稿共74张，创作于星期六 （3 3）碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AKPAKP）染色）染色原理：原理：AKP在碱性条件（在碱性条件（pH9.0-9.6）下能使孵育液中的）下能使孵育液中的-磷酸奈酚磷酸奈酚钠水解，产生钠水解，产生-奈酚，然后再与偶氮盐偶联，形成不溶性染料而呈现颜奈酚，然后再与偶氮盐偶联，形成不溶性染料而呈现颜色。色。步骤：步骤：生长胚胎干细胞克隆的盖片以无水乙醇或冷丙酮固定生长胚胎干细胞克隆的盖片以无水乙醇或冷丙酮固定10-15min水洗水洗滴加孵育液室温滴加孵育液室温5-10min水洗水洗10min复染（甲基复染（甲基绿等）绿等）10min。结果：结果：未分化胚胎干细胞颜色以所用偶氮盐品种而异，分化者则为未分化胚胎干细胞颜色以所用偶氮盐品种而异，分化者则为复染液颜色。复染液颜色。对照：对照：以已建系以已建系ES细胞（或小鼠的脱带桑椹胚或囊胚）作为阳性细胞（或小鼠的脱带桑椹胚或囊胚）作为阳性对照，作用液中不含对照，作用液中不含-萘酚磷酸钠为阴性对照。萘酚磷酸钠为阴性对照。第49页，讲稿共74张，创作于星期六第50页，讲稿共74张，创作于星期六（4）胚胎干细胞特异表面抗原的表达胚胎干细胞特异表面抗原的表达n免疫荧光检测免疫荧光检测SSEA胚胎阶段特异性抗原胚胎阶段特异性抗原:SSEA-1 SSEA-3 SSEA-4 Thmoson分离的分离的hES 阴性阴性 弱阳性弱阳性 强阳性强阳性Gearhart分离的分离的hES 阳性阳性 弱阳性弱阳性 阳性阳性小鼠小鼠ES 阳性阳性 阴性阴性 阴性阴性鼠和人胚胎干细胞表达的表面抗原有种属差异。鼠和人胚胎干细胞表达的表面抗原有种属差异。nRT-PCR检测转录因子检测转录因子Oct-4的表达的表达 Oct-4只限定在多潜能细胞中表达。人和小鼠的胚胎只限定在多潜能细胞中表达。人和小鼠的胚胎干细胞都表达转录因子干细胞都表达转录因子Oct-4，当胚胎干细胞分化，当胚胎干细胞分化时，其表达能力大大降低。时，其表达能力大大降低。第51页，讲稿共74张，创作于星期六52第52页，讲稿共74张，创作于星期六（5）分化能力检测）分化能力检测n体外分化能力观察体外分化能力观察:无饲养层和无抑制分无饲养层和无抑制分化因子的条件下培养，胚胎干细胞会分化因子的条件下培养，胚胎干细胞会分化成各种细胞或发育成胚胎体：化成各种细胞或发育成胚胎体：3d“简简单类胚体单类胚体”5-10d“囊状胚体囊状胚体”贴贴壁细胞为壁细胞为细胞分化物。细胞分化物。第53页，讲稿共74张，创作于星期六n体内分化能力观察：体内分化能力观察：ES细胞接种同一品系小鼠腹细胞接种同一品系小鼠腹股沟（股沟（107个细胞）或裸鼠、个细胞）或裸鼠、SCID小鼠（小鼠（106个个细胞）细胞）约约2 2周后出现肿块，周后出现肿块，4-54-5周进一步增大，摘周进一步增大，摘除肿块除肿块固定切片染色：见三个胚层组织，为畸胎固定切片染色：见三个胚层组织，为畸胎瘤结构瘤结构n裸鼠和裸鼠和SCID小鼠可接种异种细胞和组织的移植小鼠可接种异种细胞和组织的移植n也可接种腹腔，也可接种腹腔，2-3周后观察肿瘤周后观察肿瘤第54页，讲稿共74张，创作于星期六n嵌合能力测定：嵌合能力测定：野灰色小鼠品系（如野灰色小鼠品系（如129鼠）鼠）ES注注射白化体小鼠（射白化体小鼠（BALB/c小鼠）或纯合非野灰色小鼠小鼠）或纯合非野灰色小鼠（C57BL/6小鼠）着床前胚胎内，或将来源于白化小鼠）着床前胚胎内，或将来源于白化体小鼠的体小鼠的ES注射野灰色小鼠或纯合非野灰色小鼠注射野灰色小鼠或纯合非野灰色小鼠着床前胚胎内，再移植到假孕母鼠子宫内，使之