植物细胞培养11.pptx

2.1 植物组织与细胞培养区别组织培养概念：组织培养概念：指从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培指从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织。养，使之生存或生长成组织。细胞培养概念：细胞培养概念：植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。第1页/共156页2.2 2.2 植物组织的发展简史l探索阶段（本世纪初探索阶段（本世纪初 3030年代中）年代中）19021902年，德国植物生理学家年，德国植物生理学家HaberlancltHaberlanclt首次进行了细首次进行了细胞培养实验胞培养实验 奠基阶段（奠基阶段（3030 5050年代）年代）19341934年，年，WhiteWhite 等用番茄根尖的组织培养，建立了第一等用番茄根尖的组织培养，建立了第一个活跃生长的无性繁殖系。个活跃生长的无性繁殖系。1943194319431943年年年年WhiteWhite正式提出植物细胞具有全能性学说，即单正式提出植物细胞具有全能性学说，即单细胞经过人工培养，通过细胞分裂能恢复完整植株。细胞经过人工培养，通过细胞分裂能恢复完整植株。19341934年，年，White White 和和WentWent 等分别发现等分别发现B B族维生素和吲哚乙族维生素和吲哚乙酸（酸（IAAIAA）对培养的离体根生长具有重要作用。）对培养的离体根生长具有重要作用。1937-19381937-1938年，年，GautheretGautheret、NobecourtNobecourt 培养胡萝卜根培养胡萝卜根和马铃薯的块茎薄壁组织，获得愈伤组织。将愈伤组织和马铃薯的块茎薄壁组织，获得愈伤组织。将愈伤组织置于琼脂培养基上继续培养，可无限发生细胞增殖。置于琼脂培养基上继续培养，可无限发生细胞增殖。第2页/共156页 White White、GautheretGautheret、Nobecourt Nobecourt 等科学家被誉为等科学家被誉为植物组织培养的奠基人植物组织培养的奠基人 19571957年年SkoogSkoog和和MillerMiller提出了植物激素控制器官形提出了植物激素控制器官形成的概念，指出通过改变培养基中生长素和细胞分成的概念，指出通过改变培养基中生长素和细胞分裂素的比率，可以控制器官的分化，即生长素和细裂素的比率，可以控制器官的分化，即生长素和细胞分裂素高促进根的分化，低促进茎和芽的分化。胞分裂素高促进根的分化，低促进茎和芽的分化。19581958年，施图尔德从胡萝卜愈伤组织获得单细胞，年，施图尔德从胡萝卜愈伤组织获得单细胞，并经诱导形成了胚状体再生了植株，是世界上首次并经诱导形成了胚状体再生了植株，是世界上首次证明植物细胞的全能性。证明植物细胞的全能性。迅速发展阶段（迅速发展阶段（6060年代后）年代后）1 1、原生质体培养和细胞融合。、原生质体培养和细胞融合。2 2、微繁技术、微繁技术第3页/共156页2.3 2.3 植物组织培养重要概念和理论基础l植物组织培养：植物组织培养：在无在无菌条件下，将离体的菌条件下，将离体的植物器官、组织、细植物器官、组织、细胞、胚胎、原生质体，胞、胚胎、原生质体，培养在人工配制的培培养在人工配制的培养基上，给予适宜的养基上，给予适宜的培养条件，诱发产生培养条件，诱发产生愈伤组织，或潜伏芽愈伤组织，或潜伏芽等，或长成完整的植等，或长成完整的植株，统称为植物组织株，统称为植物组织培养培养 。第4页/共156页植物组织培养理论基础一、细胞全能性一、细胞全能性二二.细胞分化细胞分化 三三.离体培养中细胞的脱分化、再分化离体培养中细胞的脱分化、再分化第5页/共156页l全能性：全能性：任何有完整的细胞核的植物细胞任何有完整的细胞核的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的遗传信息，拥有形成一个完整植株所必需的遗传信息，理论上都能发育成为一棵植株。理论上都能发育成为一棵植株。l 植物组织培养是建立在细胞具有全能性的植物组织培养是建立在细胞具有全能性的理论基础上的，除受精卵能发育成胚外，理论基础上的，除受精卵能发育成胚外，植物的体细胞，雌配子、雄配子体都能发植物的体细胞，雌配子、雄配子体都能发育成胚。育成胚。第6页/共156页植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱:营养生长中心营养生长中心 形成层形成层 薄壁细胞薄壁细胞 厚壁细胞厚壁细胞(木质化细胞木质化细胞)特化细胞特化细胞(筛筛管、导管细胞管、导管细胞)；根据细胞所处的组织不同从强到弱为：根据细胞所处的组织不同从强到弱为：顶端分生组织顶端分生组织 居间分生组织居间分生组织 侧生分生组织侧生分生组织 薄壁组织薄壁组织(基本组织基本组织)厚角组织厚角组织 输导组织输导组织 厚壁组织。厚壁组织。第7页/共156页第8页/共156页 脱分化 再分化 外植体愈伤组织 体细胞胚 根、茎、叶 等器官再分化时，可经过两条途径 完整植株第9页/共156页外植体：外植体：植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞或原生质体。细胞或原生质体。愈伤组织：愈伤组织：由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。第10页/共156页第11页/共156页二、细胞分化分化：细胞的这种在形态结构和功能上发生永久性（不可逆转性）适度变化的过程。分化：细胞的这种在形态结构和功能上发生永久性（不可逆转性）适度变化的过程。分化的结果导致细胞分裂能力的丧失，伴随的是细胞的分化成熟与组织的形成，是植物根、茎、叶、花、分化的结果导致细胞分裂能力的丧失，伴随的是细胞的分化成熟与组织的形成，是植物根、茎、叶、花、果实和种子的形成，是一个成熟植物体的出现。果实和种子的形成，是一个成熟植物体的出现。第12页/共156页三三.离体培养中细胞的脱分化、再分化离体培养中细胞的脱分化、再分化脱分化：由失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成无分化的细脱分化：由失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成无分化的细胞团即愈伤组织的现象。胞团即愈伤组织的现象。再分化：由无分化的愈伤组织的细胞再转变成为具有一定结构，执行一定生理功再分化：由无分化的愈伤组织的细胞再转变成为具有一定结构，执行一定生理功能的组织，构成一个完整的植物体或植物器官的现象能的组织，构成一个完整的植物体或植物器官的现象第13页/共156页一个已分化细胞要表达出其全能性，就要经过脱分化和再分化的过程，这就是植物组织和细胞培养所要达到的目的。第14页/共156页影响细胞脱分化、再分化的因素影响细胞脱分化、再分化的因素A A、激素、激素 生长素能促进维管组织形成生长素能促进维管组织形成 细胞分裂素与木质部的发生有关细胞分裂素与木质部的发生有关b b、蔗糖浓度、蔗糖浓度 C C、光照与温度、光照与温度光照对于维管组织的分化具有促进作用，适宜的温度对于维管组织的分化是必需的。光照对于维管组织的分化具有促进作用，适宜的温度对于维管组织的分化是必需的。第15页/共156页再分化时，可经过两条途径 1、器官发生途径2、体细胞胚胎发生途径第16页/共156页1、器官发生途径植物的离体器官的发生：植物的离体器官的发生：培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。形成不定根、不定芽等器官的过程。离体培养中通过器官发生形成再生植株大体上离体培养中通过器官发生形成再生植株大体上有四种方式：有四种方式：A:A:先芽后根先芽后根；如小麦，芦荟、苹果；如小麦，芦荟、苹果 B:B:先根后芽先根后芽；如枸杞、苜蓿；如枸杞、苜蓿C:C:在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株维管组织的联系形成完整植株。如胡萝卜、石。如胡萝卜、石刁柏刁柏 D:D:仅有根或芽再生，形成无芽的根或无根的芽。仅有根或芽再生，形成无芽的根或无根的芽。第17页/共156页器官分化的过程器官分化的过程:愈伤组织再分化器官一般要经过三个生长阶段愈伤组织再分化器官一般要经过三个生长阶段1.1.外植体经过诱导形成愈伤组织。外植体经过诱导形成愈伤组织。2.2.生长中心的形成。生长中心的形成。当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后，首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群，称件下以后，首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群，称之为生长中心或拟分生组织，它们是愈伤组织形成器官的部位。之为生长中心或拟分生组织，它们是愈伤组织形成器官的部位。3.3.器官原基及器官形成。器官原基及器官形成。生长中心形成后，按照其已确立的极生长中心形成后，按照其已确立的极性，某些细胞开始分化形成不同的器官原基，进而分化出相应性，某些细胞开始分化形成不同的器官原基，进而分化出相应的组织和器官。的组织和器官。第18页/共156页愈伤组织分化不定芽第19页/共156页愈伤组织分化期第20页/共156页第21页/共156页第22页/共156页2、体细胞胚胎发生途径胚状体发生途径形成植株的特征胚状体发生途径形成植株的特征1 1、具有两极性、具有两极性 细胞发育早期阶段，从其相反的两端分化出芽端与根端，而不定芽和不细胞发育早期阶段，从其相反的两端分化出芽端与根端，而不定芽和不定根都是单向极性。定根都是单向极性。2 2、胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定、胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽和不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系芽和不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系3 3、胚状体的维管组织的分布是独立的、胚状体的维管组织的分布是独立的“”形，而不定芽和不定根的维形，而不定芽和不定根的维管组织无此现象。管组织无此现象。4 4、发育过程与合子胚相似。并具有与合子胚类似的形态结构，可独立萌、发育过程与合子胚相似。并具有与合子胚类似的形态结构，可独立萌发形成小苗。发形成小苗。第23页/共156页第24页/共156页2.4 2.4 植物组培的实验条件l准备室：准备室：进行一切与实验有关的准备工作：器进行一切与实验有关的准备工作：器皿洗涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿洗涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养材料的预处理等皿的灭菌、培养材料的预处理等要求：要求：2020平方米左右。要求宽敞明亮平方米左右。要求宽敞明亮设备：清洗区，干燥箱，工作台，水箱，天平，设备：清洗区，干燥箱，工作台，水箱，天平，灭菌锅等。灭菌锅等。无菌操作室：无菌操作室：也叫接种室，进行材料的立体无也叫接种室，进行材料的立体无菌操作，是植物离体培养研究或生产中最关键菌操作，是植物离体培养研究或生产中最关键的一步。的一步。要求：要求：10-2010-20平方米即可，封闭性好，干燥清洁，平方米即可，封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌能较长时间保持无菌.设备：超净工作台，紫外灯和空调设备：超净工作台，紫外灯和空调 第25页/共156页培养室：对接种到培养瓶等器皿中的植物离体对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养材料进行控制条件下的培养要求：约需要求：约需10-2010-20平方米左右。基本要求是能够平方米左右。基本要求是能够控制光照和温度，并保持相对的无菌环境，控制光照和温度，并保持相对的无菌环境，设备：培养架、光照培养箱或人工气候箱、温湿设备：培养架、光照培养箱或人工气候箱、温湿度计、空调等。度计、空调等。缓冲间：缓冲间：是进入无菌室前的一个缓冲场地，减少是进入无菌室前的一个缓冲场地，减少人体从外界带入的尘埃等污染物。工作人员在人体从外界带入的尘埃等污染物。工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩，才能进入无此换上工作服、拖鞋，戴上口罩，才能进入无菌室和培养室。菌室和培养室。要求：缓冲间需要求：缓冲间需3-53-5平方米，可建在准备室外或平方米，可建在准备室外或无菌操作室外，应保持清洁无菌；备有鞋架和无菌操作室外，应保持清洁无菌；备有鞋架和衣帽挂钩，并有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过衣帽挂钩，并有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服；墙顶用的工作服；墙顶用1-21-2盏紫外灯定时照射，对衣盏紫外灯定时照射，对衣物进行灭菌。物进行灭菌。设备：设备：1-21-2盏紫外灯、灭菌后的工作服、拖鞋、盏紫外灯、灭菌后的工作服、拖鞋、口罩。口罩。第26页/共156页基本实验室准备室第27页/共156页第28页/共156页第29页/共156页第30页/共156页第31页/共156页第32页/共156页第33页/共156页培养室第34页/共156页第35页/共156页第36页/共156页2.5 植物组织培养步骤植物组织培养两个步骤：植物组织培养两个步骤：1 1、植物细胞或组织脱分化，形成愈伤组织。、植物细胞或组织脱分化，形成愈伤组织。2 2、愈伤组织形成分生细胞团，再分化成不同的、愈伤组织形成分生细胞团，再分化成不同的器官。器官。有的情况下，组织细胞经脱分化后，不形成有的情况下，组织细胞经脱分化后，不形成愈伤组织，而是从脱分化的细胞上直接再分化愈伤组织，而是从脱分化的细胞上直接再分化器官器官 到底通过哪个途径再生，取决于培养材料和培到底通过哪个途径再生，取决于培养材料和培养基，尤其培养基中添加激素的种类、浓度及养基，尤其培养基中添加激素的种类、浓度及配比配比第37页/共156页1 1、培养材料的采集、培养材料的采集选择具全能性细胞：受精卵、分生组织细胞、雌雄配子及单倍体细胞常用植物茎尖、下胚轴、幼叶作为外植体。考虑因素：材料的来源、外植体年龄、产地、外植体的大小、形状、生理部位。第38页/共156页（1 1）最常用的组培材料：）最常用的组培材料：茎尖、茎段、皮层、表皮、维管组织、块茎、茎尖、茎段、皮层、表皮、维管组织、块茎、花瓣、根、叶、子叶、胚珠、花药等。花瓣、根、叶、子叶、胚珠、花药等。茎尖：形态已建成，繁殖率高，不易产生变茎尖：形态已建成，繁殖率高，不易产生变异。茎尖最先端为无病毒区。通常为异。茎尖最先端为无病毒区。通常为0.5cm0.5cm，无，无病毒区为病毒区为0.1mm0.1mm。缺点：数量少，取材有限。缺点：数量少，取材有限。茎段：一般为茎段：一般为0.50.51cm1cm长，取材方便。长，取材方便。缺点：所获得的愈伤组织来源不一，有异质性，缺点：所获得的愈伤组织来源不一，有异质性，再生植株易产生变异。再生植株易产生变异。第39页/共156页 叶：取材方便，再生能力强叶：取材方便，再生能力强 。花器官：取材包括花托、花瓣、花药、子房等。花器官：取材包括花托、花瓣、花药、子房等。种子（果实）：无菌种子发芽后可作外植体。子叶和下胚轴也可培养。种子（果实）：无菌种子发芽后可作外植体。子叶和下胚轴也可培养。第40页/共156页2、培养材料消毒A:自来水冲洗、蒸馏水冲洗、无菌滤纸吸干。B:无菌操作将材料放入70%酒精浸泡30-60sC:将材料移入Naclo饱和液或0.01%升汞消毒8-10min。D:取出无菌水冲洗。第41页/共156页3 3、制备外植体：、制备外植体：用消毒过的器械无菌操作将外植体置于培养皿上。用消毒过的器械无菌操作将外植体置于培养皿上。切取外植体为适当大小，一般切取外植体为适当大小，一般0.2-0.5cm0.2-0.5cm。4 4、接种和培养、接种和培养诱导培养基成分一般为基本培养基诱导培养基成分一般为基本培养基+细胞分裂素细胞分裂素+生长素生长素+附加成分附加成分,基本培养基一般选择基本培养基一般选择MSMS配方配方（1 1）接种：每瓶约）接种：每瓶约4 41010个个 （2 2）封口）封口 （3 3）培养条件：温度为）培养条件：温度为25+2 25+2 光照为光照为100010004000lx 4000lx pH pH值常为值常为5.65.66.0 6.0 培养室的相对湿度要常保持在培养室的相对湿度要常保持在707080%80%。第42页/共156页5 5、增殖、增殖 把在诱导培养基上分化出的幼芽继代培养。把在诱导培养基上分化出的幼芽继代培养。转到增殖培养基上进行培养转到增殖培养基上进行培养,这是使幼芽快速增殖的关键环节。这是使幼芽快速增殖的关键环节。6 6、根的诱导、根的诱导 继代培养的不定芽或侧芽需要生根培养，在生根培养基中培养继代培养的不定芽或侧芽需要生根培养，在生根培养基中培养一个月左右方可获得根系。一个月左右方可获得根系。7 7、组培苗的练苗移栽、组培苗的练苗移栽第43页/共156页炼炼苗苗与与移移栽栽第44页/共156页切取切取第45页/共156页第46页/共156页第47页/共156页第48页/共156页2.6 2.6 愈伤组织形成的过程 外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程被大致划分为三个时期诱导期分裂期形成期第49页/共156页1、诱导期：细胞分裂的准备期 诱导期是细胞准备进行分裂，需加入诱导剂或细胞分裂素。2、分裂期：细胞从开始分裂到持续分裂的时期。分裂期的愈伤组织的共同特征是：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态。n n3 3、分化期：从愈伤组织、分化期：从愈伤组织到器官发生到器官发生 。其间受很多。其间受很多因素影响。因素影响。第50页/共156页愈愈 伤伤 组组 织织 的的 形形 态态第51页/共156页愈愈 伤伤 组组 织织 的的 颜颜 色色第52页/共156页愈伤组织的种类愈伤组织的种类 1 1、胚性愈伤组织：表面光滑、组织结构紧凑、细胞小、再生力强。、胚性愈伤组织：表面光滑、组织结构紧凑、细胞小、再生力强。胚性愈伤组织容易形成胚状体，所以被称为胚性愈伤组织。胚性愈伤组织容易形成胚状体，所以被称为胚性愈伤组织。2 2、非胚性愈伤组织：表面粗糙、组织结构疏松、细胞大。、非胚性愈伤组织：表面粗糙、组织结构疏松、细胞大。第53页/共156页第54页/共156页复 习愈伤组织再分化经历两个途径：器官发生方式再生植株的三种愈伤组织再分化经历两个途径：器官发生方式再生植株的三种 途径：途径：可能先长芽后长根（常见）。可能先长芽后长根（常见）。形成根，根上再长出芽（少见）。形成根，根上再长出芽（少见）。在愈伤组织不同部位分别形成根和芽。在愈伤组织不同部位分别形成根和芽。第55页/共156页胚状体形成途径胚状体形成途径 胚状体：指在植物组织培养中起源于一个非合子细胞，经胚胎发育所形成的胚状结胚状体：指在植物组织培养中起源于一个非合子细胞，经胚胎发育所形成的胚状结构。构。体细胞胚与合子胚发育过程相似：体细胞胚与合子胚发育过程相似：原胚原胚 球形胚球形胚 心形胚心形胚 鱼雷形胚鱼雷形胚 子叶型胚子叶型胚第56页/共156页胚胚状状体体发发生生途途径径第57页/共156页外 植 体 高高浓度生度生长素（素（2,4-D2,4-D）脱脱 分分 化化 愈愈伤组织 高（高（细胞分裂素胞分裂素/生生长素）素）再再 分分 化化 形形 成成 芽芽 低（低（细胞分裂素胞分裂素/生生长素）素）分分 化化 根根 完整植株完整植株激激 素素 控控 制制 器器 官官 分分 化化 模模 式式 图图第58页/共156页植物组织培养举例一、材料和培养基l0-l5cm高的芦荟幼苗;愈伤组织诱导培养基为MS+(1一6mg/L)BA+(0.1一0.5mg/L)NAA;分化培养基为MS+(2-4mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA;生根培养基为MS+(0.1一0.5mg/L)IBA+(2一5mg/L)PP33。第59页/共156页二、繁殖方法(一)愈伤组织培养 将准备好的芦荟幼苗在清水中冲洗数次，剪去叶片和大部分茎段，取茎尖部分，再冲洗1-2次，淋干。在超净台上，先用75%的乙醇将茎尖浸泡30-60s，再用升汞浸5-l0min，最后用无菌水冲洗数次。用解剖刀取出包括茎尖生长点的组织切块，接种到愈伤组织诱导培养基上。大约15-25d后，试管中接种的外植体就可以膨大，形成愈伤组织。愈伤组织的形成标志着接种的外植体的生长状态已脱离分化状态，开始重新恢复分生能力。愈伤组织形成1周后，就可将愈伤组织转管进行继代培养或分化培养。(二)继代培养 将愈伤组织在无菌条件下，用解剖刀将愈伤块切成数个小块，再接种到装有愈伤组织诱导培养基的三角瓶中，在与诱导愈伤组织相同的培养条件下继续培养。几天后，小愈伤块即可逐渐长大，这一过程称作继代培养。通过愈伤组织的继代培养，原来接种的1个芦荟茎尖组织可繁殖出大量的新接种材料来，用于分化培养。第60页/共156页(三)分化培养 将愈伤组织在无菌条件下，从试管或三角瓶中取出，用无菌水洗净，切成小接种块，接种到装有分化培养基的三角瓶中，分化培养的条件同愈伤组织培养。大约30-50d后，愈伤组织就可分化出芽，并继续长出小叶片。当分化出的幼苗长到一定高度或分化出一定数量后，将这些小幼苗在无菌条件下取出，进行生根培养或重新诱导分化。(四)生根培养 当三角瓶中的幼苗叶片长到3cm左右时，将幼苗在无菌条件下取出，放入装有生根培养基的三角瓶中培养，培养条件同分化培养。大约半个月后，幼苗即可生根。(五)炼苗 当幼苗的根长到一 定长度，幼苗形体已显健壮时。将幼苗取出，在清水中洗除附着在根上的培养基(注意:一定要严格洗净，否则会烂根)。(六)移栽 炼苗后，将幼苗移栽入由蛭石组成的驯化苗圃中驯化，每天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，大约15-20d后，视幼苗长势，即可移栽到苗圃中。第61页/共156页第62页/共156页1、在植物育种上的应用 突变育种：无论是愈伤组织培养还是细胞培养，培养细胞均处在不断分生状态，容易受培养条件和外界压力的影响而产生诱变，从中可以筛选出对人们有用的突变体，从而育成新品种。原生质体融合和细胞杂交：可部分克服有性杂交不亲和性，而获得体细胞杂种，从而创造新种或育成优良品种。单倍体育种：利用花药培养诱导花粉形成单倍体，在试管培养中通过秋水仙素处理，使染色体加倍，而成为纯合二倍体植物，从而缩短新品种育种的时间，还有利于突变中隐性突变的分离。2.7 植物组织培养的应用第63页/共156页第64页/共156页2、在植物脱毒和快速繁殖上的应用植物脱毒植物脱毒和离体快速繁殖离体快速繁殖是目前植物组织培养应用最多、最有效的一个方面。很多农用物都带有病毒，特别是无性繁殖植物，但是，患病植株并非每个部位都带有病毒，利用组织培养方法，取一定大小的茎尖进行培养，再生的植株有可能不带病毒，从而获得脱病毒苗，再用脱毒苗进行繁殖，则种植的作物就不会或极少发生病毒。第65页/共156页第66页/共156页马马铃铃薯薯脱脱病病毒毒试试管管苗苗第67页/共156页由于组织培养法繁殖作物的突出特点是快速，因此，对一些繁殖系数低、不能用种子繁殖的“名、优、特、新、奇”作物品种的繁殖，意义更大。对于脱毒苗、新育成、新引进、稀缺育种、优良单株、濒危植物和基因工程植株等可通过离体快速繁殖，同时可不受地区、气候的影响，比常规方法快数万倍到数百万倍的速度扩大繁殖，及时提供大量优质种薯和种苗。第68页/共156页3、在植物种质资源保存和交换上的应用 由于自然灾害和生物之间的竞争以及人类活动对大自然的影响，已有相当数量的植物物种在地球上消失或正在消失。具有独特遗传性状的生物物种的绝迹是一种不可挽回的损失。利用植物组织和细胞法低温保存种质，给保存和抢救有用基因带来了希望。例如胡萝卜和烟草等植物的细胞悬浮物，在-20至-196的低温下贮藏数月，尚能恢复生长，再生成植株。第69页/共156页2.8 人工种子2.8.1 人工种子理论基础胚状体：是指在植物组织培养中起源于一个非合子细胞，经胚胎发育所形成的胚状结构，又称体细胞胚。A:体细胞胚胎发生特点1、是离体培养的产物2、起源于非合子细胞3、发育过程与合子胚相似，也经历球形期、心形期、鱼雷期和子叶期阶段。第70页/共156页B:体细胞胚胎发生途径 胚状体可从离体培养的各种外植体上直接或间接地发生，大致分为五种：直接从器官外植体上发生愈伤组织发生悬浮培养细胞发生单倍体细胞发生原生质体发生第71页/共156页第72页/共156页2.8.2 人工种子概念利用人工种皮包被体细胞胚可以制造人工种子。人工种子的结构人工种子的结构农业生产中使用的天然种子，一般都是由种被、农业生产中使用的天然种子，一般都是由种被、胚乳和胚三部分构成。胚乳和胚三部分构成。目前研制的人工种子的结构目前研制的人工种子的结构:体细胞胚体细胞胚 人工种皮人工种皮 人工胚乳人工胚乳第73页/共156页第74页/共156页2.8.3 人工种子的基本制作流程人工种子的基本制作流程 外植体的选择和消毒外植体的选择和消毒 愈伤组织的诱愈伤组织的诱导导体细胞胚的诱导体细胞胚的诱导 体细胞胚的体细胞胚的同步化同步化体细胞胚的分选体细胞胚的分选体细胞胚体细胞胚的包裹的包裹(人工胚乳人工胚乳)包裹外膜包裹外膜发芽发芽成苗试验成苗试验体细胞胚变异程度与农艺研体细胞胚变异程度与农艺研究。究。第75页/共156页人工种子制作过程中，包埋是最重要环节包括包埋介质的选择，主要是人工胚乳和人工种皮的选择人工胚乳一般由含有供应胚状体养分的胶囊组成,养分包括矿质元素、维生素、碳源以及激素等 第76页/共156页对于人工胚乳包埋介质的要求：首先必需是对繁殖体及其它生物是无毒的，并具有一定的缓冲强度，以保证繁殖体在生产、运输和种植操作中的安全。同时，它最好能够提供类似于胚乳的营养物质，以供繁殖体发芽的需要。此外由于繁殖体的含水量较高，贮存中极易受到微生物感染危害，因此介质中还应含有适当的杀菌剂。海藻酸钠作包埋剂 第77页/共156页 2.8.4 人工种子优点：第一，它同微繁殖技术一样，培养条件可以人为控制，免遭大自然灾害性气候的不利因素，且具有省地省工可直接在田间播种等优点。第二，在人工种子制作中，可加入营养物质、植物生长调节剂、固氮菌、杀虫剂等，这是微繁殖难以达到的。第三，用于制作人工种子的体细胞胚，可利用生物反应器大规模培养，大大提高了效率。第四，一些难以得到天然种子的珍稀植物或脱毒苗、基因工程植株，均可利用人工种子技术加速用于生产。第78页/共156页2.9 2.9 植物细胞培养2.9.1 概念：离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养。得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖。从而获得大量细胞群体的一种技术。方法：根据对象：单细胞培养、单倍体培养、原生质体培养。按培养系统：悬浮培养、液体培养、固体培养、固定化培养图3-7第79页/共156页2.9.2 植物单细胞培养1、单细胞制备方法由完整的植物器官分离单细胞由培养组织中分离单细胞由完整的植物器官分离单细胞由培养组织中分离单细胞A:机械法：通过机械磨碎、切割植物体获得游离单细胞。B:酶解法：采用水解酶去除细胞壁，释放出细胞，用来制备原生质体。叶片是分离单细胞的最好材料叶片是分离单细胞的最好材料第80页/共156页 机械法机械法露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞撕去下表皮第81页/共156页加果胶酶过滤、离心Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞第82页/共156页C:愈伤组织诱导法：先获得愈伤组织，在通过震荡获得单个细胞步骤：(1)诱导产生愈伤组织；(2)愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性。(3)将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物。第83页/共156页愈伤组织液体培养基摇床振荡悬浮培养质地疏松，细胞分散程度大；质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养转速30-150rpm2-3cm冲程防细胞破裂第84页/共156页2、单细胞培养方法A:平板培养法概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上进行培养，称之为平板培养1、单细胞悬浮液的制备 2、悬浮细胞密度的调制3、琼脂培养基的配制4、平板制作 5、培养 第85页/共156页主要技术要点：单细胞的分离：单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6 6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。单细胞悬浮液的制备单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤：分离的单细胞经培养基洗涤2 2次以后，调整密度为次以后，调整密度为10103 3或或10105 5个细胞个细胞/ml/ml第86页/共156页植板：植板：将将1 1份已调整好密度的单细胞悬浮液与份已调整好密度的单细胞悬浮液与3535的固体培养基充分混合均匀，的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺与培养皿中，其厚度为然后均匀的平铺与培养皿中，其厚度为1-2mm1-2mm。待植板后的培养基完全凝固后，将培养皿封严以防污染待植板后的培养基完全凝固后，将培养皿封严以防污染.在在2525黑暗条件下培养黑暗条件下培养3 3周即可长出肉眼可见的愈伤组织。周即可长出肉眼可见的愈伤组织。第87页/共156页特点：单细胞在培养集中分布均匀，便于显微镜下定点观察；单细胞在培养集中分布均匀，便于显微镜下定点观察；培养细胞气体交换不畅。培养细胞气体交换不畅。第88页/共156页平平板板培培养养法法第89页/共156页B:看护培养法 用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。（1）取处于活跃生长期约1厘米大小愈伤组织块。（2）无菌条件下，愈伤组织块安放在培养瓶中，在愈伤组织上放约1厘米平方的无菌滤纸片。置培养室中放过夜。（3）将分离出的单细胞接种在培养瓶中的滤纸上面。（4）恒温培养。第90页/共156页第91页/共156页特点：v（1）效果好，易于成功。v（2）简便易行。v（3）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。第92页/共156页C:微室培养法 人工制造一个小室（载玻片和盖玻片），将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖成细胞团的方法。小室可通过毛细管与外界通气，便于观察。第93页/共156页微室培养1滴含单细胞培养液周围加石蜡油凹穴载玻片旁边加石蜡油盖盖玻片盖盖玻片平视图置培养皿中2628 恒温培养第94页/共156页第95页/共156页特点：在培养过程中可以连续进行显微观察，将一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。第96页/共156页D:D:其它单细胞培养技术其它单细胞培养技术饲养层培养基技术饲养层培养基技术 是用处理过的、无活性或分裂慢的细胞来饲养所需是用处理过的、无活性或分裂慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。培养的细胞，使其分裂和生长。将饲养细胞先用射线辐射处理，然后将饲养细胞和培将饲养细胞先用射线辐射处理，然后将饲养细胞和培养细胞混合植板，经过照射的细胞对于培养细胞起到养细胞混合植板，经过照射的细胞对于培养细胞起到一个饲养作用。一个饲养作用。双层滤纸植板培养方法双层滤纸植板培养方法培养基培养基饲养层细胞看护滤纸层转移碟滤纸培养细胞第97页/共156页第98页/共156页E:悬浮培养悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。1、起始培养物的建立选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。2、选择适宜的培养基：较高浓度激素浓度；必要的附加物质。愈伤组织的要求：松散性好、增殖快、再生能力强第99页/共156页悬浮培养与固体培养比较有三个优点：一、增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；可以适当改善气体的交换二、在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；三、适合大规模培养。生产有价值次生代谢产物。第100页/共156页3、建立细胞悬浮系第101页/共156页一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在3050个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般23天甚至更短时间便可增加一倍。第102页/共156页1034、悬浮培养中细胞生长量的计算q细胞计数细胞计数q细胞密实体积（细胞密实体积（PCVPCV）5铬酸或0.25果胶酶使悬浮细胞团分散用血球计数板进行。将体积已知、均匀分散的悬浮液放入一个 15ml 的离心管中，2000转下离心，用每ml培养液中细胞总体积的ml数表示q细胞鲜重：细胞鲜重：细胞培养物过滤，洗去培养基，真空抽细胞培养物过滤，洗去培养基，真空抽虑，称重。虑，称重。q细胞干重细胞干重离心收集的细胞转移到预先称重的滤纸片离心收集的细胞转移到预先称重的滤纸片上，然后在上，然后在6060烘烘12h12h，在干燥器中冷却后称重，在干燥器中冷却后称重 第103页/共156页5、悬浮细胞培养的同步化细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。1、物理方法1）分选法通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。2）冷处理法。低温处理可以提高培养体系中细胞同步化的程度第104页/共156页2、化学方法1）饥饿法 悬浮培养细胞中，若断绝供应一种细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当在培养基中重新加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。2）抑制剂法 通过一些DNA 合成抑制剂处理细胞，使细胞停留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期的细胞。常用的抑制剂有5-氟脱氧尿苷，5-氨基尿嘧啶、羟基尿等。3）有丝分裂阻抑 用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，浓度一般控制在0.2%，处理时间以4-6小时为宜第105页/共156页植物细胞培养的意义n2.102.10n植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。n李时珍（1593）在本草纲目中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。产品成分产品成分 用途用途 年销售额（亿美元）年销售额（亿美元）长春花碱（长春花）长春花碱（长春花）治疗白血病治疗白血病 18182020（美国）（美国）阿吗灵阿吗灵 循环系统障碍药循环系统障碍药 5 52525（全世界）（全世界）奎宁（金鸡纳树）奎宁（金鸡纳树）治疗疟疾治疗疟疾 5 51010（美国）（美国）致热素致热素 杀虫剂杀虫剂2020（全世界）（全世界）毛地黄毛地黄 心脏病药心脏病药 20205555（美国）（美国）第106页/共156页许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产品。例如：从胡萝卜、万寿菊提取色素从黄菊提取芳香油栀子提取果酸：果酸含有大量的维生素，如维生素C、柠檬酸等。主要用作食品的调味剂，化妆行业用于制作护肤品和洗发香波等，美容院用作换肤液 第107页/共156页2.11 植物细胞生物反应器大规模培养 目前采用液体培养基的悬浮培养1、植物细胞培养的特性a 植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁细胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差；b 培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素；c 细胞生长的中期及对数期易凝聚为团块，悬浮培养较难；d 培养时需供氧，培养液粘度大：e 具有群体效应；f 因为有细胞壁,培养细胞产物滞留于细胞内，产量较低；g 细胞培养过程具有结构与功能全能性,因而易分化,从而导致目的产物低于原植物体内的浓度；h 悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，否则不生长。第108页/共156页2 2植物细胞培养液的流变特性植物细胞培养液的流变特性 易易结结团团，易易分分泌泌粘粘性性物物质质。传传氧氧速速率率降降低低，影影响细胞生长。响细胞生长。3