血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳实验课件.ppt
关于血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳实验现在学习的是第1页，共17页实验目的实验目的1、掌握电泳法分离蛋白质的原理、掌握电泳法分离蛋白质的原理2、学习醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的、学习醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的 原理和操作方法原理和操作方法3、学习蛋白质染色的方法、学习蛋白质染色的方法现在学习的是第2页，共17页分离蛋白质的方法分离蛋白质的方法分离方法分离方法沉淀法沉淀法盐析法盐析法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法层析法层析法电泳法电泳法薄膜电泳薄膜电泳等电聚焦电泳等电聚焦电泳聚丙烯酰胺电泳聚丙烯酰胺电泳离子交换层析离子交换层析吸附层析吸附层析凝胶过滤（分子筛）凝胶过滤（分子筛）亲和层析亲和层析现在学习的是第3页，共17页实验原理实验原理 电泳：电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。的电极移动的现象。在一定在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不同的条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可对它们进行分离。率不同，因此，可对它们进行分离。现在学习的是第4页，共17页以蛋白质为例：以蛋白质为例：HOHHOHpHpI pH=pI pHpI现在学习的是第5页，共17页影响电泳迁移率的因素：影响电泳迁移率的因素：1、内在因素：蛋白所带净电荷的性质和电荷的量、蛋内在因素：蛋白所带净电荷的性质和电荷的量、蛋白的大小和形状白的大小和形状 2、外界因素：电场强度、溶液的、外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离值、溶液的离 子强子强度和电渗现象度和电渗现象现在学习的是第6页，共17页血清中几种主要蛋白组分：血清中几种主要蛋白组分：血清蛋白质血清蛋白质等电点等电点分子量分子量占总蛋白的占总蛋白的清蛋白清蛋白 4.644.6469,00069,000575772 72 1 1球蛋白球蛋白 5.005.00200,000200,0002 25 52 2球蛋白球蛋白 5.065.06300,000300,0004 49 9球蛋白球蛋白 5.125.1290,00090,000150,000150,0006.56.51212球蛋白球蛋白 6.856.857.3 7.3 156,000156,000950,000950,00012122020 缓冲液缓冲液pH=8.6pH=8.6 pIpIpHpH血清蛋白血清蛋白带负电荷带负电荷,在电场中向正极移动在电场中向正极移动现在学习的是第7页，共17页醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜作为支持介质醋酸纤维薄膜作为支持介质 醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为0.10.15mm现在学习的是第8页，共17页染色剂染色剂一般蛋白质染色常使用一般蛋白质染色常使用氨基黑氨基黑、考马斯亮蓝、丽春红、考马斯亮蓝、丽春红 糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂试剂 脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色 现在学习的是第9页，共17页实验操作实验操作1.1.醋酸纤维素薄膜的润湿与选择醋酸纤维素薄膜的润湿与选择 将醋酸纤维素薄膜浸于缓冲液中约30min后，取醋酸纤维素薄膜放在滤纸中并吸干表面液体。整条薄膜颜色一致而无白色斑点，则表明薄膜质地均匀(实验中应选择质地均匀的膜)。2.2.电泳槽的准备电泳槽的准备 电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成滤纸桥。现在学习的是第10页，共17页3.3.点样：点样：点样前，将薄膜粗糙面朝上，距一边点样前，将薄膜粗糙面朝上，距一边1.5cm处用铅处用铅笔划一条平行线作为点样标志区。笔划一条平行线作为点样标志区。点样时，用点样器毛吸取血清，在薄膜粗糙面上轻点样时，用点样器毛吸取血清，在薄膜粗糙面上轻而温和地印一下（盖章法）。点样区距阴极端而温和地印一下（盖章法）。点样区距阴极端1.5cm（见图）。此步是实验的关键。（见图）。此步是实验的关键。醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（黑线黑线处为点样位置）处为点样位置）点样区点样区6.5cm1.5cm现在学习的是第11页，共17页4.4.电电 泳泳 将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。要求薄膜紧贴滤纸桥并朝下），另一端平贴在阳极端支架上。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。绷直，中间不能下垂。连接好电泳仪。在室温下电泳，恒压连接好电泳仪。在室温下电泳，恒压110V，打开电源开，打开电源开关，电泳时间关，电泳时间60 min。电泳后，调节旋钮使电压为零，关闭电。电泳后，调节旋钮使电压为零，关闭电泳仪切断电源。泳仪切断电源。现在学习的是第12页，共17页5.5.染色：染色：电泳完毕后将薄膜取下电泳完毕后将薄膜取下,放在含氨基放在含氨基黑黑10B10B染色液的培养皿中浸泡染色液的培养皿中浸泡5min5min，染色时，染色时可置于摇床，均匀摇晃。可置于摇床，均匀摇晃。6.6.漂洗：漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗中漂洗3 3次，每次次，每次5 min,5 min,直至背景蓝色脱尽，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，取出薄膜放在滤纸上，用条带清晰为止，取出薄膜放在滤纸上，用吹风机冷风吹干或者自然晾干。吹风机冷风吹干或者自然晾干。现在学习的是第13页，共17页8.8.记录和分析实验结果记录和分析实验结果 透明后可将薄膜上的透明后可将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录，并判断分析结果。透明后的薄膜位置进行描述、记录，并判断分析结果。透明后的薄膜可作扫描或照相。可作扫描或照相。正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1为清蛋白，为清蛋白，2，3，4，5，分别为，分别为1，2，及，及球蛋白，球蛋白，6为点样原点为点样原点 现在学习的是第14页，共17页注意事项注意事项1 1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。2 2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，薄膜吸水量、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，薄膜吸水量以不干不湿为宜。以不干不湿为宜。3 3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏薄膜或印出凹、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏薄膜或印出凹陷影响电泳区带分离效果。陷影响电泳区带分离效果。4 4、点样应点在薄膜的粗糙面上，点样量要适量，不宜过多或过少。、点样应点在薄膜的粗糙面上，点样量要适量，不宜过多或过少。5 5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。6 6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。现在学习的是第15页，共17页思考题思考题1.1.电泳时为什么要将点样的一端靠近负极端电泳时为什么要将点样的一端靠近负极端？2.2.电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？作？现在学习的是第16页，共17页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第17页，共17页
