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LOGO食品食品检验工培工培训课件蛋白件蛋白质现在学习的是第1页，共53页现在学习的是第2页，共53页1 概述2 凯氏定氮法3 蛋白质的快速测定法4 氨基酸总量的测定5 氨基酸的分离与测定主主 要要 内内 容容现在学习的是第3页，共53页1 概述概述（1）蛋白质的生理功用及在食品中的作用）蛋白质的生理功用及在食品中的作用（2）食品中的蛋白质含量）食品中的蛋白质含量（3）蛋白质系数）蛋白质系数（4）蛋白质水解）蛋白质水解（5）蛋白质测定方法）蛋白质测定方法现在学习的是第4页，共53页 蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，是生物体发育及修补组织的原料，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。人体的酸碱平衡、水平衡的维持；遗传信息的传递；物质的代谢及运转都与蛋白质有关。人及动物只能从食品得到蛋白质及其分解产物，来构成自身的蛋白质，是人体重要的营养物质 食品的重要营养指标。（1）蛋白质的生理功用及在食品中的作用现在学习的是第5页，共53页(2)食品中的蛋白质含量食品中的蛋白质含量在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说来动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，例如牛肉中蛋白质含量为20.0%左右，猪肉中为9.5%，兔肉为21%，鸡肉为20%，牛乳为3.5%黄鱼为17.0%，带鱼为18.0%，大豆为40%，稻米为8.5%，面粉为9.9%，菠菜为2.4%，黄瓜为1.0%，桃为0.8%，柑橘为0.9%，苹果为0.4%和油菜为1.5%左右。测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。现在学习的是第6页，共53页（3）蛋白质系数）蛋白质系数蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大，大部分高达数万数百万，分子的长轴则长数nm100nm,它们由20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有一定的空间结构，所含的主要化学元素为C、H、O、N,在某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等元素，但含氮则是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。现在学习的是第7页，共53页 不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。现在学习的是第8页，共53页（4）蛋白质水解）蛋白质水解在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体内不能合成，必须依靠食品提供，故被称为必需氨基酸，他们对人体有极其重要的生理作用。蛋白质蛋白质胨胨肽肽氨基酸氨基酸现在学习的是第9页，共53页（5）蛋白质测定方法）蛋白质测定方法 测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。现在学习的是第10页，共53页 蛋白质的测定，目前多采用将蛋白质消化，测定其含氮量，再换算为蛋白质含量的凯氏定氮法。不同食品的蛋白质系数有所不同。凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法，至今仍 被作为标准检验方法。2 凯氏定氮法凯氏定氮法现在学习的是第11页，共53页凯氏定氮法：常量法、微量法及经改进后的改良凯氏定氮法。微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一套微量凯氏定氮器。目前通用以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量凯氏定氮法。在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题，即分解试样所用的催化剂。常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛。现在学习的是第12页，共53页(1)原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。2.1 常量凯氏定氮法现在学习的是第13页，共53页 样品消化样品消化2 2NHNH2 2(CH)(CH)2 2COOHCOOH13H13H2 2SOSO44(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4 6CO6CO2212SO12SO2 2 16H16H2 2O O浓硫酸具有脱水性，有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。浓硫酸又具有氧化性，将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫2H2SO4C2SO22H2OCO2二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。H H2 2SOSO4 42NH2NH33(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4现在学习的是第14页，共53页 蒸馏蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下：吸收与滴定吸收与滴定吸收与滴定吸收与滴定：加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性（k5.810-10），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反应方程式如下：2 2N NaOHOH(NH(NH4 4)2 2SOSO4 42NH2NH3 3 NaNa2 2SOSO442H2H2 2O O2NH2NH3+4H3 3BOBO3=(NH=(NH4 4)2 2B B4 4O7 7+5H+5H2 2O(NH(NH4 4)2B B4O O7 7+2HCl+5H+2HCl+5H2 2O=2NH4 4Cl+4H3 3BOBO3现在学习的是第15页，共53页(2)(2)适用范围适用范围此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定(3)(3)仪器仪器500ml凯氏烧瓶；定氮蒸馏装置(4)(4)试剂试剂硫酸铜；硫酸钾；硫酸；40gL硼酸溶液；混合指示剂；400gL氢氧化钠；0.1molL盐酸标准溶液现在学习的是第16页，共53页(5)操作步骤操作步骤 样品消化：样品消化：准确称取均匀的固体样品0.53g,或半固体样品25g,或吸取溶液样品1525ml。小心移入干燥的凯氏烧瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入0.51g硫酸铜、10g硫酸钾及25ml浓硫酸，小心摇匀后，于瓶口置一小漏斗，瓶颈45角倾斜置电炉上，在通风橱内加热消化（若无通风橱可于瓶口倒插入一口径适宜的干燥管，用胶管与水力真空管相连接，利用水力抽除消化过程所产生的烟气）。先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力消化至溶液呈蓝绿色。取下漏斗，继续加热0.5h，冷却至室温。现在学习的是第17页，共53页现在学习的是第18页，共53页现在学习的是第19页，共53页 蒸馏蒸馏、吸收吸收现在学习的是第20页，共53页 按图装好蒸馏装置按图装好蒸馏装置，冷凝管下端浸入接受瓶液面之下（瓶内预先装有50ml40gL硼酸溶液及混合指示剂56滴）。凯氏烧瓶内凯氏烧瓶内，加入100ml蒸馏水蒸馏水、玻璃珠数粒，从安全玻璃珠数粒，从安全漏斗中漏斗中慢慢加入加入7070ml400g/Lml400g/L氢氧化钠，溶液应呈蓝褐色。氢氧化钠，溶液应呈蓝褐色。不要摇动，将定氮球连接好。用直火加热蒸馏不要摇动，将定氮球连接好。用直火加热蒸馏3030min，将将蒸馏装置出口蒸馏装置出口离开液面继续蒸馏离开液面继续蒸馏1 1minmin，用蒸馏水淋洗尖端用蒸馏水淋洗尖端后停止蒸馏。后停止蒸馏。现在学习的是第21页，共53页滴定：将接受瓶内的硼酸液用0.1mol/L盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。现在学习的是第22页，共53页式中W蛋白质的质量分数，%；c盐酸标准液的浓度，mol/L；V1空白滴定消耗标准液量，mL；V2试剂滴定消耗标准液量，mL；m样品质量，g；0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol；F蛋白质系数。(6)结果计算现在学习的是第23页，共53页2.2 微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法(1)原理 微微量量凯凯氏氏定定氮氮法法的的原原理理与与操操作作方方法法，与与常常量量法法基基本本相相同同，所所不不同同的的是是样样品品质质量量及及试试剂剂用用量量较较少少，且且有有一一套套适适于于微微量量测测定定的的定定型型仪仪器器微量凯氏定氮器。微量凯氏定氮器。现在学习的是第24页，共53页现在学习的是第25页，共53页100ml凯氏烧瓶。凯氏烧瓶。微量凯氏定氮器。微量凯氏定氮器。(2)仪器现在学习的是第26页，共53页20g/L硼酸溶液。400g/L氢氧化钠。1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L溴甲酚绿乙醇溶液，临用时按1：5混合。0.01000mol/L盐酸标准溶液其他试剂同常量法。(3)试剂现在学习的是第27页，共53页 样样品品消消化化：样品消化步骤同常量法。将消化完全的消化液冷却后，完全转入100容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。(4)测定方法现在学习的是第28页，共53页 蒸馏 按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加甲甲基基橙橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸酸性性，加入数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。在接接受受瓶瓶内内加入10ml40g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。现在学习的是第29页，共53页 吸取吸取10.0010.00mlml样品消化稀释液样品消化稀释液，由进样漏斗进入反应室，以少量水冲洗进样漏斗，并流入反应室。再从进样口加入400400g/Lg/L氢氧化钠氢氧化钠10ml使溶液溶液呈强碱性，用少量蒸馏水洗漏斗数次，盖塞，进行水蒸气蒸馏。冷凝管下端预先插入盛有10mL4%（或2%）硼酸吸收液,蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始记时，继续蒸馏10min后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。现在学习的是第30页，共53页滴定取下接受瓶，以0.01000mol/L盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。现在学习的是第31页，共53页(5)结果计算结果计算式中W蛋白质的质量分数，%；V0滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL；V1滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL；V2蒸馏时吸取样品稀释液体积，mL；C盐酸标准液的浓度，mol/L；0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol；F蛋白质系数；m样品质量，g。现在学习的是第32页，共53页2.3 样品的分解条件样品的分解条件（1）K2SO4或Na2SO4：提高溶液的沸点（2）催化剂CuSO4氧化汞和汞良好的催化剂，但剧毒；硒粉（3）氧化剂过氧化氢现在学习的是第33页，共53页硫酸钾加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解，它与硫酸钾作用生成硫酸氢钾可提高反应温度一般纯硫酸的沸点在340摄氏度左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高到4000C以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点升高，其反应式如下：K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+H2O+SO3但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失：（NH4）2SO4=NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。现在学习的是第34页，共53页硫酸铜 CuSO4 催化剂2CuSO4=CuSO4+SO2+O2C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2+O2Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。可以指示消化终点的到达下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。作用现在学习的是第35页，共53页（1）所用试剂应用无无氨氨蒸馏水蒸馏水配制。（2）消化过程应注意转转动动凯氏烧瓶，利用冷凝酸液将附在瓶壁上的炭粒冲下，以促进消化完全。（3）若样品含脂肪或糖较多时，应注意发生的大量泡泡沫沫少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂，防止其溢出瓶外，并注意适当控制热源强度。（4）若样品消化液不易澄清透明，可将凯氏烧瓶冷却，加入300g/L23ml过氧化氢过氧化氢后再加热。2.4 注意事项注意事项现在学习的是第36页，共53页（5）若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5ml的比例增加硫酸用量。（6）消化时间一般约4小时左右即可，消化时间过长会引起氨的损失。一般消化至透明后，继续消化30min即可，但当含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸或组氨酸时，消化时间需适当延长，因为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完全，往往导致总氮量偏低。有机物如分解完全，分解液呈蓝色或浅绿色。但含铁量多时，呈较深绿色。现在学习的是第37页，共53页（7）蒸馏过程应注意接头处无松松漏漏现象，蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。（8）硼硼酸酸吸吸收收液液的的温温度度不应超过40C，否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。（9）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色红色。现在学习的是第38页，共53页 半微量凯氏定氮半微量凯氏定氮现在学习的是第39页，共53页4 4 氨基酸态氮的测定氨基酸态氮的测定现在学习的是第40页，共53页 蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的最终产物为氨基酸。氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，虽然从各种天然源中分离得到的氨基酸已达175种以上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种，而在构成的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨算、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠食品供给，故被称为必需氨基酸，它们对人体有着极其重要的生理功能，常会因其在体内缺乏而导致患病或通过补充而增强了新陈代谢作用。现在学习的是第41页，共53页随着食品科学的发展和营养知识的普及，食物蛋白质中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的构成，愈来愈得到人们的重视。为提高蛋白质的生理效价而进行食品氨基酸互补和强化的理论，对食品加工工艺的改革，对保健食品的开发及合理配膳等工作都具有积极的指导作用。因此，食品及其原料中氨基酸的分离、鉴定和定量也就具有极其重要的意义。现在学习的是第42页，共53页氨基酸态氮的测氨基酸态氮的测定定双指示剂甲醛滴定法：原理、试剂、双指示剂甲醛滴定法：原理、试剂、测定方法、结果计算、说明测定方法、结果计算、说明电位滴定法：原理、试剂、仪器、测定方法、结果计算现在学习的是第43页，共53页4.1双指示剂甲醛滴定法(1)原理氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互租用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸的总量。反应式（有三种不同的推论）如下：RCHH3NCCOR CCOHOHNH2+HCHORCCOOHHNCH2+NaOHRCHCOOHNHCH2OH或RCHCOOHN(CH2OH)2或RCHCOONaNCH2或RCHNHCOOHCHO现在学习的是第44页，共53页(2)方法特点及应用 此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基酸含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。普氨酸与甲 作用时产生不稳定的化合物，使结果偏高;溶液中若有 存在也可与甲醛反应，往往使结果高。现在学习的是第45页，共53页(3)试剂40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。0.1%百里酚酞乙醇溶液0.1%中性红50%乙醇溶液0.1%mol/L氢氧化钠标准溶液现在学习的是第46页，共53页(4)操作方法移取含氨基酸约2030mg的样品溶液2份，分别置于250ml锥形瓶中，各加50ml蒸馏水，其中1份加入3滴中性红置试剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点；另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20ml，摇匀，静置1分钟，用0.1ml/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别纪录两次所消耗的碱液ml数。现在学习的是第47页，共53页式中c氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L;V1用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL;V2用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL;m测定用样品溶液相当于样品的质量，g0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol (5)(5)结果计算结果计算氨基酸态氮（%）现在学习的是第48页，共53页4.2 电位滴定法电位滴定法(1)原理根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。(2)仪器酸度计（附磁力搅拦器）现在学习的是第49页，共53页磁力搅拌器磁力搅拌器现在学习的是第50页，共53页酚酞乙醇指示液：1%硼砂（标准物质）缓冲液：PH9.22称取3.8克Na2B4O7溶解后，定容至1000mL甲醛：36%-38%0.0500mol/l氢氧化钠标准溶液(3)(3)试剂试剂现在学习的是第51页，共53页(4)试验步骤试验步骤吸取含氨基酸约20mg的样品溶液，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0mL烧杯中，加60mL水，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2（记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数，可计算总酸含量）。加入0.1mL甲醛溶液，混匀。再用0.05mol/L氢氧化钠标准的溶液继续滴定至pH9.2，记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数。现在学习的是第52页，共53页同时取80mL水，先用0.05mol/L氢氧化钠溶液调节至pH为8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，做试剂空白试验。现在学习的是第53页，共53页