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关于基本常用技术第1页，讲稿共47张，创作于星期日第一节第一节 无菌技术无菌技术防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由于体外培养细防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的无菌。无菌。细胞培养工具做到细胞培养细胞培养工具做到细胞培养专用专用进出细胞培养室做到进出细胞培养室做到更衣换鞋更衣换鞋超净工作台紫外照射时超净工作台紫外照射时不要不要放置过多物品放置过多物品遮挡紫外线遮挡紫外线第2页，讲稿共47张，创作于星期日一、操作区消毒一、操作区消毒1.1.使用紫外线灯灭菌，照射细胞培养室和超净工作台使用紫外线灯灭菌，照射细胞培养室和超净工作台20-30min20-30min。2.2.在用紫外线灯照射期间，超净工作台上放置物品不要过多，留有死角在用紫外线灯照射期间，超净工作台上放置物品不要过多，留有死角阻碍照射，勿置培养细胞和培养用液等物，以免受射线影响阻碍照射，勿置培养细胞和培养用液等物，以免受射线影响(必要时可用纸必要时可用纸张覆盖张覆盖)。3.3.所有操作用具（包括培养瓶）要经所有操作用具（包括培养瓶）要经75%75%的乙醇的乙醇擦拭后才可放置进超净工作台擦拭后才可放置进超净工作台内。内。4.4.实验开始前使用实验开始前使用75%75%的乙醇擦拭超净工作台台面。的乙醇擦拭超净工作台台面。第3页，讲稿共47张，创作于星期日二、洗手和着装二、洗手和着装1.1.进入细胞培养室进入细胞培养室更换专用室内鞋和无菌服、帽子和手套更换专用室内鞋和无菌服、帽子和手套。2.2.使用使用75%75%酒精或酒精或0.2%0.2%的新洁尔灭洗手。的新洁尔灭洗手。3.3.实验过程中可能触及污染物品或者出入培养室均要洗手。实验过程中可能触及污染物品或者出入培养室均要洗手。第4页，讲稿共47张，创作于星期日三、火焰消毒三、火焰消毒1.1.在无菌环境进行培养或做其它无菌操作时，首先要点燃在无菌环境进行培养或做其它无菌操作时，首先要点燃酒精酒精灯灯。以后一切操作。以后一切操作,需要在酒精灯附近进行。需要在酒精灯附近进行。2.2.实验中使用器械均要经过火焰烧灼进行。实验中使用器械均要经过火焰烧灼进行。3.3.金属器械不宜灼烧长，防止退火和过热。金属器械不宜灼烧长，防止退火和过热。4.4.含营养液的吸管不要灼烧防止营养液碳化。含营养液的吸管不要灼烧防止营养液碳化。5.5.培养瓶口过火时间不要太长防止烧死细胞。培养瓶口过火时间不要太长防止烧死细胞。第5页，讲稿共47张，创作于星期日四、培养操作四、培养操作1.1.操作操作台面布局合理台面布局合理2.2.不用手触及已消毒物品不用手触及已消毒物品3.3.操作保持一定顺序操作保持一定顺序，动作准确敏捷，动作准确敏捷4.4.组织或细胞在未做处理前或培养液在未用前，勿过早暴露在空气中；组织或细胞在未做处理前或培养液在未用前，勿过早暴露在空气中；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。5.5.防止各种用液的交叉污染。防止各种用液的交叉污染。6.6.不向操作方向讲话或咳嗽不向操作方向讲话或咳嗽第6页，讲稿共47张，创作于星期日原代培养原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。胞在传代之前称为原代培养。意义意义:1.1.原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传性，而且有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出原来组织的特性大多数细胞表现出原来组织的特性。2.2.利用原代培养做各种实验利用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。果很好。3.3.原代培养也是原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过的阶段建立各种细胞系（株）必须经过的阶段。第二节第二节 原代培养原代培养第7页，讲稿共47张，创作于星期日取材原则：取材原则：1.1.幼体组织尤其是幼体组织尤其是胚胎组织胚胎组织比年老个体的组织容易培养；比年老个体的组织容易培养；2.2.分化程度低分化程度低的组织比分化程度高的容易生长；的组织比分化程度高的容易生长；3.3.肿瘤组织比正常组织容易培养。肿瘤组织比正常组织容易培养。4.4.取材之后，最好取材之后，最好立即培养立即培养，如因故不能培养时，应把组织切成，如因故不能培养时，应把组织切成1 1 立立方厘米左右的小块，置于培养液中，方厘米左右的小块，置于培养液中，44贮存，存放时间不宜超过贮存，存放时间不宜超过24 24 小时。小时。5.5.从体内取材时，应严格保持无菌从体内取材时，应严格保持无菌，避免受到紫外线照射或接触任何化学，避免受到紫外线照射或接触任何化学试剂及有害药物如碘、汞等。取肿瘤和其它病理组织时容易带菌，为减少污试剂及有害药物如碘、汞等。取肿瘤和其它病理组织时容易带菌，为减少污染，可用含染，可用含500-1000 500-1000 单位毫升的青单位毫升的青、链霉素、链霉素BSS BSS 液，漂洗液，漂洗5-10 5-10 分钟后再做分钟后再做培养处理培养处理。第8页，讲稿共47张，创作于星期日取鼠胚组织取鼠胚组织引颈法处死小鼠引颈法处死小鼠整个小鼠浸入整个小鼠浸入75酒酒精中精中2 3 秒钟秒钟打开胸腔打开胸腔取出组织取出组织第9页，讲稿共47张，创作于星期日组织的分离：组织的分离：从体内取出的各种组织均由众多细胞和纤维成分组成，而且结合十分紧从体内取出的各种组织均由众多细胞和纤维成分组成，而且结合十分紧密。为获取多量生长良好的细胞，必须把组织细胞分散开，使细胞密。为获取多量生长良好的细胞，必须把组织细胞分散开，使细胞解离出来。解离出来。机械法机械法化学法化学法第10页，讲稿共47张，创作于星期日机械法：机械法：把组织块先剪成小块后，把组织放入注把组织块先剪成小块后，把组织放入注射器针管中使用压挤法，或是把组织置射器针管中使用压挤法，或是把组织置于于不锈钢纱网不锈钢纱网中用钝物压取法。其中以压中用钝物压取法。其中以压取法较多用。取法较多用。简便易行简便易行，节省时间，但对组织，节省时间，但对组织有有一定损伤一定损伤，仅适用于处理软组织。，仅适用于处理软组织。第11页，讲稿共47张，创作于星期日化学法：化学法：在把组织剪切成较小体积的基础上，应用生化和化学手段进在把组织剪切成较小体积的基础上，应用生化和化学手段进一步分散组织，最后制成细胞团或一步分散组织，最后制成细胞团或单个细胞悬液接种单个细胞悬液接种的的方法。最常用的消化酶是方法。最常用的消化酶是胰蛋白酶胰蛋白酶和和胶原酶胶原酶两种。两种。第12页，讲稿共47张，创作于星期日93第13页，讲稿共47张，创作于星期日原代细胞培养结果原代细胞培养结果原代细胞培养结果原代细胞培养结果细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长如接种的细胞密度适宜，如接种的细胞密度适宜，如接种的细胞密度适宜，如接种的细胞密度适宜，5 5 5 5天到一周即可形成单层天到一周即可形成单层天到一周即可形成单层天到一周即可形成单层第14页，讲稿共47张，创作于星期日离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。代培养，细胞将逐渐衰老死亡。传代培养传代培养是指细胞从一个培养瓶以是指细胞从一个培养瓶以1 1：2 2或其他比率或其他比率转移，接种到另一培养瓶的培养。转移，接种到另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶胰蛋白酶消化。消化。第三节第三节 传代培养传代培养第15页，讲稿共47张，创作于星期日第16页，讲稿共47张，创作于星期日贴壁细胞的传代培养贴壁细胞的传代培养1.1.选取生长良好的细胞，倒去瓶中的旧培养液，加入选取生长良好的细胞，倒去瓶中的旧培养液，加入2 23ml3ml的的PBSPBS，轻轻振，轻轻振荡荡漂洗细胞漂洗细胞，以除去，以除去悬浮在细胞表面的碎片悬浮在细胞表面的碎片。2.2.加入适量加入适量0.0.0.250.25胰蛋白酶胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下观消化液，室温消化，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。3.3.用用HanksHanks液洗涤液洗涤1 1次，加入适量次，加入适量培养液培养液，反复吹打细胞反复吹打细胞，使其成细胞悬液。，使其成细胞悬液。4.4.使用使用台盼蓝台盼蓝进行细胞计数进行细胞计数，按照计数结果进行分装，并在培养瓶上做好标，按照计数结果进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 37，5%CO5%CO2 2培养。培养。5.24h5.24h后观察的生长情况。后观察的生长情况。第17页，讲稿共47张，创作于星期日悬液细胞的传代培养悬液细胞的传代培养1.1.取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管把培养瓶中的细胞吹打取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管把培养瓶中的细胞吹打均匀。均匀。2.2.转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离心（离心（1 000r/min1 000r/min）5min5min。3.3.在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养液，用吸管吹打细胞，制成悬液。在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养液，用吸管吹打细胞，制成悬液。4.4.使用使用台盼蓝台盼蓝计数，按照结果进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、计数，按照结果进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，日期，轻轻摇匀，37 37，5%CO5%CO2 2培养。培养。5.24h5.24h后观察的生长情况。后观察的生长情况。第18页，讲稿共47张，创作于星期日细胞计数法是细胞学实验的一项基本技术，是用于细胞计数法是细胞学实验的一项基本技术，是用于了解培养细胞生长状态，测定培养基、血清、药物等物了解培养细胞生长状态，测定培养基、血清、药物等物质对细胞发挥作用的重要手段。质对细胞发挥作用的重要手段。血球计数板计数法血球计数板计数法 电子细胞计数仪计数法电子细胞计数仪计数法 第四节第四节 细胞计数细胞计数第19页，讲稿共47张，创作于星期日方法和步骤方法和步骤1.1.取酒精棉球清洁计数板和专用盖玻片，并用丝绸布取酒精棉球清洁计数板和专用盖玻片，并用丝绸布或擦镜或擦镜纸轻轻拭干。纸轻轻拭干。2.2.用胰酶消化分散用胰酶消化分散贴壁细胞或直接收集悬浮细胞制成均贴壁细胞或直接收集悬浮细胞制成均匀分散的单细胞悬液，必要时应进行适当的稀释或匀分散的单细胞悬液，必要时应进行适当的稀释或浓缩。浓缩。3.3.3.3.混匀后直接取少许细胞悬液，沿计数板上盖玻片的一侧加微混匀后直接取少许细胞悬液，沿计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液。加样量以充满不外溢为宜，也不要过少或出现量细胞悬液。加样量以充满不外溢为宜，也不要过少或出现气泡。气泡。第20页，讲稿共47张，创作于星期日4.4.统计四个大格的细胞数统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的将血球计数板放于显微镜的低低倍镜下观察，倍镜下观察，并移动计数板，分别并移动计数板，分别数出四角的四个大格数出四角的四个大格（每个大格含有（每个大格含有1616个中格）中的细个中格）中的细胞数。胞数。对压边线细胞：对压边线细胞：计上不计下，计左不计右计上不计下，计左不计右 第21页，讲稿共47张，创作于星期日计算：一般以计算：一般以每毫升含细胞数每毫升含细胞数来表示来表示 大方格的面积为大方格的面积为1mm1mm2 2，室深为，室深为0.1mm0.1mm，则体积为，则体积为0.1mm0.1mm3 3。推算得。推算得0.1mm0.1mm3 310104 4，才为，才为1ml1ml体积。所以计算公式为：体积。所以计算公式为：细胞悬液的细胞数）细胞悬液的细胞数）/ml/ml（四个大格子细胞数四个大格子细胞数/4)/4)10104 4稀释倍数稀释倍数计数中，如果细胞悬液的细胞浓度过高，必须稀释后再计；如果细胞数太少计数中，如果细胞悬液的细胞浓度过高，必须稀释后再计；如果细胞数太少,可可离心浓缩后再计。每个细胞悬液离心浓缩后再计。每个细胞悬液至少滴样两次求平均值。至少滴样两次求平均值。不要漏计，不要重复，细胞悬液应混合均匀，浓度不可过高也不可过低。不要漏计，不要重复，细胞悬液应混合均匀，浓度不可过高也不可过低。第22页，讲稿共47张，创作于星期日第23页，讲稿共47张，创作于星期日细胞生长曲线的绘制细胞生长曲线的绘制细胞生长曲线细胞生长曲线(cell growth curve)(cell growth curve)是观测细胞在一代是观测细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标，可根据细胞生长曲线分析生存期内的增生过程的重要指标，可根据细胞生长曲线分析细胞增殖速度，确定细胞传代、细胞冻存或具体实验的最佳细胞增殖速度，确定细胞传代、细胞冻存或具体实验的最佳时间。时间。它以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标作坐标图。它以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标作坐标图。第24页，讲稿共47张，创作于星期日制作方法：制作方法：1.1.培养细胞培养细胞 首先在首先在2 2孔孔培养板内分别接种培养板内分别接种相同数量相同数量的细胞。计数并的细胞。计数并记录接种记录接种的细的细胞悬液之胞悬液之密度密度。接种时间记为。接种时间记为0 h0 h。2.2.计数细胞密度计数细胞密度 从接种时间算起，每隔从接种时间算起，每隔24h24h计数计数孔孔内的细胞密度，算出平均值。内的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔细胞可计数为提高准确率，对每孔细胞可计数2 23 3次。如此操作至次。如此操作至第七天第七天结束。结束。3.3.绘制曲线绘制曲线 以以培养时间培养时间为为横横坐标、坐标、细胞密度细胞密度为为纵纵坐标，将全部结果在坐标纸上绘坐标，将全部结果在坐标纸上绘图，即得所培养细胞的生长曲线。图，即得所培养细胞的生长曲线。培养细胞的生长曲线培养细胞的生长曲线第25页，讲稿共47张，创作于星期日第五节第五节 活细胞的染料排除检测法活细胞的染料排除检测法原理：原理：由于由于死细胞死细胞的的细胞膜通透性细胞膜通透性发生改变，某些染料发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞可大量进入却不被排出，因而细胞呈色呈色。而。而活细胞活细胞反之，反之，能排出进入细胞内的染料，因而能排出进入细胞内的染料，因而不易着色不易着色。此法的原。此法的原理即是理即是利用死、活细胞对染料的不同反应利用死、活细胞对染料的不同反应而区分开两种而区分开两种细胞。细胞。最常用的为最常用的为“台盼蓝台盼蓝排除检测法排除检测法”第26页，讲稿共47张，创作于星期日 实验方法：实验方法：1 1、将细胞悬液以、将细胞悬液以0.5ml0.5ml加入试管中。加入试管中。2 2、加入、加入0.5ml 0.4%0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色台盼兰染液，染色2 2一一3 3分钟。分钟。3 3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。4 4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。台盼蓝染细胞时，时间镜下呈无色透明状。台盼蓝染细胞时，时间不宜过长不宜过长。否则，部分活细。否则，部分活细胞也会着色，会干扰实验结果。胞也会着色，会干扰实验结果。第27页，讲稿共47张，创作于星期日17761776年，年，“冷冷”处理对处理对“细胞细胞”生命活动影响的报道。生命活动影响的报道。19001900年前后，基本上肯定了生物成分年前后，基本上肯定了生物成分(如精子如精子)能够在零下温度贮存。能够在零下温度贮存。19491949年，发现了年，发现了甘油甘油对低温下贮存细胞的保护作用。对低温下贮存细胞的保护作用。19591959年，发现了一种新的化学保护剂，这就是现在常用的二甲基亚砜年，发现了一种新的化学保护剂，这就是现在常用的二甲基亚砜(DMSODMSO)。当前低温液氮冻存贮存细胞已是细胞培养室常规性通用技术当前低温液氮冻存贮存细胞已是细胞培养室常规性通用技术 ，贮存时间，贮存时间几乎是无限的。几乎是无限的。第七节、细胞的冻存与复苏第七节、细胞的冻存与复苏第28页，讲稿共47张，创作于星期日一、培养物的冷冻保存与复苏原理一、培养物的冷冻保存与复苏原理冷冻保存冷冻保存(cryopreservation)(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在加有：将体外培养物悬浮在加有冷冻保冷冻保护剂护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度(一般是低于一般是低于-70-70的超低温条件的超低温条件)，并在此温度下对其长期保存的过程。，并在此温度下对其长期保存的过程。复苏复苏(thawing)(thawing)：是以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温：是以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。的过程。第29页，讲稿共47张，创作于星期日细胞冻存时，存在两种损伤：细胞冻存时，存在两种损伤：冰晶损伤冰晶损伤 溶质损伤溶质损伤冰晶损伤：由于温度下降，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶损伤：由于温度下降，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内、冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内、外结冰而致的细胞损伤被称为细胞的冰晶损伤。外结冰而致的细胞损伤被称为细胞的冰晶损伤。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。伤越大。第30页，讲稿共47张，创作于星期日溶质损伤：溶质损伤：因保存溶液因保存溶液溶质浓度增高溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为而致的细胞损伤被称为溶质损伤。溶质损伤。细胞悬浮在溶液中，随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得细胞悬浮在溶液中，随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质的浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时未结冰的溶液中电解质的浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质会受到损坏，细胞便发生渗漏。间过长，细胞膜上脂质会受到损坏，细胞便发生渗漏。溶质损伤是由溶质损伤是由冷却速度过慢冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重。过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重。第31页，讲稿共47张，创作于星期日如果在溶液中加入冷冻保护剂时，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶如果在溶液中加入冷冻保护剂时，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。损伤。保护机理保护机理：冷冻保护剂冷冻保护剂易同溶液中水分子结合，从而降低冰点易同溶液中水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶，减少冰晶的形成的形成 ；通过其通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受，使细胞免受溶质的损伤，细胞得以在超低温条件下保存。溶质的损伤，细胞得以在超低温条件下保存。第32页，讲稿共47张，创作于星期日影响冷冻效果的因素有以下几点：影响冷冻效果的因素有以下几点：1.1.冷冻速率冷冻速率当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结即失去活性。冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较大冰晶当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较大冰晶,造成细胞膜及造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。2.2.冷冻保存温度：冷冻保存温度：液氮温度液氮温度(-196)(-196)是目前最佳冷冻保存温度。是目前最佳冷冻保存温度。应用应用-70-70-80-80条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显下降。随着冻存时间延长，细胞存活率明显下降。第33页，讲稿共47张，创作于星期日4.4.冷冻保护剂冷冻保护剂（渗透性渗透性 非渗透性）非渗透性）：渗透性常用甘油、渗透性常用甘油、DMSODMSO 渗透到细胞内，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度渗透到细胞内，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤；同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。电解质的损伤；同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。甘油和甘油和DMSODMSO并不能防止细胞内结冰。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定并不能防止细胞内结冰。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷。目前，的时间进行预冷。目前，DMSODMSO的应用比甘油更为广泛的应用比甘油更为广泛。第34页，讲稿共47张，创作于星期日非渗透性冷冻保护剂非渗透性冷冻保护剂不能渗透不能渗透到细胞内，一般是些大分子物到细胞内，一般是些大分子物质。该类保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮质。该类保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(PVP)、蔗糖、聚乙二、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉等。醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉等。大分子物质可以优先同溶液中水分子相结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降大分子物质可以优先同溶液中水分子相结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。低，减少冰晶的形成；使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。第35页，讲稿共47张，创作于星期日二、使用逐级降温法进行冻存二、使用逐级降温法进行冻存1.1.主要材料主要材料(1)(1)仪器设备：普通冰箱、仪器设备：普通冰箱、-30-30低温冰箱和低温冰箱和-70-70-80-80超低温冰箱、液氮冻存超低温冰箱、液氮冻存罐、离心机等。罐、离心机等。(2)(2)冻存管：容量为冻存管：容量为2ml2ml。(3)(3)冷冻保护液：冷冻保护液：一般是以含一般是以含20%20%小牛血清的细胞培养液与二甲基亚砜小牛血清的细胞培养液与二甲基亚砜1 1份份以以9 9：1 1混合而成。混合而成。现配现用，或配制后放入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前，现配现用，或配制后放入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前，于室温下水浴融解。于室温下水浴融解。(4)(4)待冻存细胞。待冻存细胞。第36页，讲稿共47张，创作于星期日2.2.细胞处理过程细胞处理过程(1)(1)按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物,制备成单细胞悬液制备成单细胞悬液,计算细计算细胞总数。胞总数。(2)(2)将细胞悬液以将细胞悬液以8008001000r1000rminmin离心离心5min5min，弃上清液。，弃上清液。(3)(3)向沉淀物中加入冷冻液。轻轻吹吸均匀，使细胞密度达向沉淀物中加入冷冻液。轻轻吹吸均匀，使细胞密度达1101106 61101107 7个个/ml/ml。(4)(4)按每管按每管1 11.5ml1.5ml的量，分装于冻存小管内。拧紧管盖。的量，分装于冻存小管内。拧紧管盖。(5)(5)在冻存小管上做标记，包括细胞代号及冻存日期。在冻存小管上做标记，包括细胞代号及冻存日期。第37页，讲稿共47张，创作于星期日3.3.分级冷冻：分级冷冻：（1 1）标准程序为）标准程序为-25-25以上时，下降以上时，下降-2-2-1/min-1/min；-25-25以下时，下降以下时，下降-10-10-5/min-5/min；温度达到；温度达到-100-100 时，可迅速放入液氮时，可迅速放入液氮（2 2）实际可采用普通冰箱）实际可采用普通冰箱冷藏层冷藏层(4(48)8)，约，约40mi40min n；普通冰箱；普通冰箱冷冻层冷冻层(-10(-10-20)-20)，303060min60min；在；在-70-70-80-80下过夜；最后将冻存小管投入液下过夜；最后将冻存小管投入液氮保存氮保存。冻存的细胞存活率可达冻存的细胞存活率可达90%90%以上。以上。可使用细胞冻存盒进行一次性冷冻。可使用细胞冻存盒进行一次性冷冻。第38页，讲稿共47张，创作于星期日注意事项：注意事项：在使用在使用DMSODMSO前，不需要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌前，不需要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。作用。在常温下，在常温下，DMSODMSO对人体有毒，故在配制冷冻保护剂时最好带手套。对人体有毒，故在配制冷冻保护剂时最好带手套。冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以避免液氮从液冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以避免液氮从液氮罐内溅出。氮罐内溅出。勿将冻存的细胞放置在勿将冻存的细胞放置在0 0-60-60这一温度范围内过长时间，低温这一温度范围内过长时间，低温损伤主要发生在这一温度范围内。损伤主要发生在这一温度范围内。第39页，讲稿共47张，创作于星期日三、细胞复苏三、细胞复苏1.1.主要材料主要材料(1)(1)仪器设备：恒温水浴箱、普通离心机。仪器设备：恒温水浴箱、普通离心机。(2)(2)培养用液：完全培养液（培养用液：完全培养液（20%20%血清血清+基础培养液）基础培养液）第40页，讲稿共47张，创作于星期日2.2.复苏过程复苏过程(1)(1)将恒温水浴箱的温度调至将恒温水浴箱的温度调至37374040。(2)(2)从液氮中取出冻存小管，立即投入从液氮中取出冻存小管，立即投入37374040温水中快速晃动，直至冻存温水中快速晃动，直至冻存液完全融解。要在液完全融解。要在1 12min2min内完成复温。内完成复温。(3)(3)将细胞冻存悬液移入离心管。将细胞冻存悬液移入离心管。(4)(4)将细胞悬液经将细胞悬液经8008001000 r/min1000 r/min离心离心5min5min。弃上清液。弃上清液。(5)(5)给细胞沉淀物加入完全培养液，轻轻吹吸均匀。将细胞悬液移入培养给细胞沉淀物加入完全培养液，轻轻吹吸均匀。将细胞悬液移入培养瓶内，加足培养液进行培养。瓶内，加足培养液进行培养。第41页，讲稿共47张，创作于星期日注意事项：注意事项：细胞冻存悬液一旦融解后，要尽快离心除去冷冻保护液，防止冷冻保护剂对细细胞冻存悬液一旦融解后，要尽快离心除去冷冻保护液，防止冷冻保护剂对细胞产生毒性。胞产生毒性。许多冷冻保护剂（如许多冷冻保护剂（如DMSO）在低温下能保护细胞，但在常温下却对细胞）在低温下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温后应及时洗涤冷冻保护剂。有害，故在细胞复温后应及时洗涤冷冻保护剂。实验人员在复苏细胞过程中，同样应具有自我保护意识，避免被液氮冻伤。实验人员在复苏细胞过程中，同样应具有自我保护意识，避免被液氮冻伤。在冷冻复苏中遵循：慢冻速溶原则！在冷冻复苏中遵循：慢冻速溶原则！第42页，讲稿共47张，创作于星期日四、细胞运送四、细胞运送液氮或干冰液氮或干冰保存运输保存运输或或充液法充液法运输。运输。1.1.选生长状态良好的细胞，待达选生长状态良好的细胞，待达80%80%或或90%90%汇合时，去掉旧培养液换入新培养液，量要达到汇合时，去掉旧培养液换入新培养液，量要达到培养瓶的颈部培养瓶的颈部(过满易污染过满易污染)，保留少许空间，塞紧瓶塞，空气过多运输中气泡运动易使，保留少许空间，塞紧瓶塞，空气过多运输中气泡运动易使细胞脱落细胞脱落;2.2.妥善包装和运送；一般在不超过四五天到达目的地的情况下，对细胞活力无严重妥善包装和运送；一般在不超过四五天到达目的地的情况下，对细胞活力无严重影响影响;3.3.到达后，倒出大部分培养液，保留正常量，置到达后，倒出大部分培养液，保留正常量，置3737培养，次日传代。培养，次日传代。第43页，讲稿共47张，创作于星期日第八节、细胞活力测定的第八节、细胞活力测定的MTTMTT比色法比色法原理：原理：活细胞线粒体中的活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶能将染料能将染料MTT(MTT(二甲基二甲基噻唑二苯基四唑溴盐噻唑二苯基四唑溴盐)转变为不可溶性的转变为不可溶性的紫色结晶紫色结晶，后者，后者被被DMSODMSO（或酸性异丙醇）溶解后所呈现的色度（或酸性异丙醇）溶解后所呈现的色度(用用ODOD值值表示表示)反映出反映出活细胞的代谢水平活细胞的代谢水平。死亡细胞则无此酶活。死亡细胞则无此酶活性。性。第44页，讲稿共47张，创作于星期日实验过程实验过程1.1.将细胞培养于将细胞培养于9696孔培养板。孔培养板。2.2.按不同实验要求处理细胞。按不同实验要求处理细胞。3.3.每孔加入每孔加入15-2015-20lMTTlMTT液，继续培养液，继续培养3 34h4h。4.4.吸去培养液，每孔加入吸去培养液，每孔加入200200lDMSOlDMSO,在微型振荡器振荡在微型振荡器振荡5min,5min,充分溶解混匀。充分溶解混匀。5.5.在在酶标仪酶标仪上测定光吸收。测定波长为上测定光吸收。测定波长为490nm490nm，以只加培养液的培养皿为，以只加培养液的培养皿为空白对照空白对照。第45页，讲稿共47张，创作于星期日结果分析结果分析 细胞存活率细胞存活率=注意事项注意事项1.1.高浓度血清可影响光吸收值高浓度血清可影响光吸收值,常使用含常使用含10%10%血清的培养液血清的培养液,在加入异丙醇溶在加入异丙醇溶液或液或DMSODMSO前尽量吸净培养液。前尽量吸净培养液。2.2.吸去培养液时动作要慢吸去培养液时动作要慢,以免吸去形成的结晶。以免吸去形成的结晶。实验组光吸收值实验组光吸收值对照组光吸收值对照组光吸收值100%100%第46页，讲稿共47张，创作于星期日感感谢谢大大家家观观看看第47页，讲稿共47张，创作于星期日