转录续加工学习.pptx

2023/3/271S 原核生物的rRNA和tRNA比较稳定，半衰期为几个小时。rRNA的后加工S 原核生物中有三种原核生物中有三种rRNArRNA（5S5S，16S16S，23S23S），其），其基因基因rDNArDNA与与tRNAtRNA的基因的基因tDNAtDNA混合排列混合排列在一个操纵在一个操纵子（子（rrnrrn）中。大肠杆菌细胞中有）中。大肠杆菌细胞中有7 7个个rrnrrn操纵子。操纵子。S RNA RNA酶酶负责负责rrnrrn操纵子转录产物的后加工。操纵子转录产物的后加工。S RNA RNA酶酶作用后，产物需要进一步转变才能成为作用后，产物需要进一步转变才能成为成熟的分子，其作用机制尚不十分清楚。成熟的分子，其作用机制尚不十分清楚。原核生物的rRNA有哪几种？第1页/共53页2023/3/272第2页/共53页2023/3/273第3页/共53页2023/3/274S tDNA初始转录产物有时包含几个同种tRNA，有时包含几个不同种tRNA，而有些tRNA与rRNA转录在一起。tRNA的后加工第4页/共53页2023/3/275型tRNA基因含有CCA序列，在CCA序列下游仍有一段序列，需要在酶的作用下切除。S tRNA tRNA的基因有两种类型：的基因有两种类型：原核生物原核生物的的tRNAtRNA基因基因多为多为型型，少数噬菌体为，少数噬菌体为型。型。型型tRNAtRNA基基因因没没有有CCACCA序序列列，需需要要在在酶酶的的作作用用下下添添加该序列。加该序列。第5页/共53页2023/3/276 RNA酶：负责切开间隔序列。S 一系列酶参与一系列酶参与tRNAtRNA的后加工过程：的后加工过程：tRNA tRNA核苷酸核苷酸转移酶转移酶（tRNA nucleotidyl transferase)tRNA nucleotidyl transferase)：以：以ATPATP和和CTPCTP为前体，催化为前体，催化tRNAtRNA的的33末端生成末端生成CCACCA。在大肠杆菌中，该酶常用于对在大肠杆菌中，该酶常用于对CCACCA末端降解的修复作用。末端降解的修复作用。RNA RNA酶酶D D：是一种核酸：是一种核酸外切酶外切酶，能逐个切除，能逐个切除tRNA 3tRNA 3端多余的核苷酸，使端多余的核苷酸，使CCACCA暴露。暴露。RNA RNA酶酶P P：是一种：是一种内切酶内切酶，能使，能使tRNAtRNA产生成熟的产生成熟的55末末端。端。第6页/共53页2023/3/277(RNA(RNA酶酶)RNARNA酶酶P PRNARNA酶酶D DtRNAtRNA核苷酸转移酶核苷酸转移酶第7页/共53页2023/3/278(RNase(RNase)第8页/共53页2023/3/279n 真核生物的转录后加工 S 真核生物的rRNA有4种，即5.8S、18S、28S和5S rRNA。rRNA的转录后加工 5.8S 5.8S、18S18S、28S28S的基因组成一个的基因组成一个转录单位转录单位，转录，转录单位呈单位呈串联重复排列串联重复排列，由，由RNARNA聚合酶聚合酶负责转录。负责转录。每个转录单位转录产生每个转录单位转录产生47S47S前体，包含三种前体，包含三种rRNArRNA。进一步经过进一步经过剪切和碱基修饰剪切和碱基修饰后产生后产生3 3种成熟的种成熟的rRNArRNA。5S rRNA5S rRNA的基因的基因成簇排列成簇排列，由，由RNARNA聚合酶聚合酶单独转单独转录。录。真核生物rRNA有哪几类？真核生物rRNA由哪种RNA聚合酶负责转录？剪切和碱基修饰过程需要一组剪切和碱基修饰过程需要一组snoRNAsnoRNA参与。参与。5S rRNA由哪种酶负责转录？第9页/共53页2023/3/2710第10页/共53页2023/3/2711第11页/共53页2023/3/2712S 加工过程中，首先切除3端额外的核苷酸，在tRNA核苷酸转移酶作用下，在3端添加CCA序列，产生成熟的3末端。tRNA加工S 真核生物真核生物tRNAtRNA基因不含基因不含33端端CCACCA序列，前序列，前tRNAtRNA带有一个带有一个16nt 516nt 5端前导区，一个端前导区，一个1414 60nt60nt的内含子，的内含子，二个额外的二个额外的33端核苷酸。端核苷酸。S 酿酒酵母酿酒酵母tRNAtRNA有有272272条，其中条，其中5959为断裂基因，为断裂基因，每条只含有一个内含子。其他真核生物类似。每条只含有一个内含子。其他真核生物类似。什么是断裂基因？S 随后切除内含子，并将两个半个的tRNA分子连接在一起。第12页/共53页2023/3/2713第13页/共53页2023/3/2714核酸内切酶使用测量机制确定切割点，在内含子两端切割，产生一个线性内含子和两个tRNA半分子。两个半分子tRNA具有独特的末端：5端为-OH，3端为环状磷酸基团。S tRNA tRNA内含子切除、外显子连接机制：内含子切除、外显子连接机制：tRNAtRNA剪接经历剪接经历连续的切割和连接反应连续的切割和连接反应。第14页/共53页2023/3/2715第15页/共53页2023/3/271633端环状磷酸基团在环化磷酸二酯酶作用下打端环状磷酸基团在环化磷酸二酯酶作用下打开，产生开，产生2-2-磷酸基团和磷酸基团和3-OH3-OH。55端在多核苷酸激酶作用下磷酸化，产生端在多核苷酸激酶作用下磷酸化，产生5 5-磷磷酸基团酸基团。两个两个tRNAtRNA半分子在腺苷酸合成酶作用下半分子在腺苷酸合成酶作用下连接连接成成完整的完整的tRNAtRNA分子。分子。磷酸二酯酶、多核苷酸激酶、腺苷酸合成酶分磷酸二酯酶、多核苷酸激酶、腺苷酸合成酶分布于布于同一个蛋白质同一个蛋白质的不同功能区。的不同功能区。连接点处的连接点处的2-2-磷酸磷酸基团在磷酸酶作用下基团在磷酸酶作用下去除去除。第16页/共53页2023/3/2717第17页/共53页2023/3/2718S 一般情况下，外显子较短（100-200bp），内含子较长（1kb）。什么是断裂基因？S 从从mRNAmRNA前提中去除内含子，外显子连接成成熟前提中去除内含子，外显子连接成成熟mRNAmRNA的过程称为的过程称为RNARNA的剪接（的剪接（RNA splicingRNA splicing）。）。mRNA加工 S RNA RNA剪接过程发生在细胞核内，与剪接过程发生在细胞核内，与55端加帽、端加帽、33端端加加polyApolyA尾等其他一些修饰同时进行。成熟的尾等其他一些修饰同时进行。成熟的mRNAmRNA进入细胞质进行翻译。进入细胞质进行翻译。S 几乎在所有生物中都发现有断裂基因。在低等真几乎在所有生物中都发现有断裂基因。在低等真核生物中较少，在高等真核生物中大量存在。核生物中较少，在高等真核生物中大量存在。第18页/共53页2023/3/2719第19页/共53页2023/3/2720S hnRNP hnRNP真核生物真核生物RNARNA聚合酶聚合酶转录产物大小差异很大，表转录产物大小差异很大，表现出不均一性，该转录群体统称为核内不均一现出不均一性，该转录群体统称为核内不均一RNARNA。其中主要是前。其中主要是前mRNAmRNA（pre-mRNApre-mRNA）。）。hnRNAhnRNA合成后很快被蛋白质包裹形成合成后很快被蛋白质包裹形成hnRNPhnRNP。hnRNPhnRNP有助于保持有助于保持hnRNAhnRNA的单链状态，并辅助各的单链状态，并辅助各种种RNARNA加工反应。加工反应。什么是hnRNA？第20页/共53页2023/3/2721第21页/共53页2023/3/2722S 5端加帽RNARNA链长度超过链长度超过20-30nt20-30nt之前，其之前，其55端经过化学修端经过化学修饰被加上一个饰被加上一个7-7-甲基鸟苷甲基鸟苷残基，这种修饰称为帽子残基，这种修饰称为帽子结构。催化这一反应的酶是结构。催化这一反应的酶是mRNAmRNA鸟苷转移酶。鸟苷转移酶。帽子结构中，帽子结构中，GMPGMP通过通过5-55-5三磷酸桥与三磷酸桥与RNARNA链链相连。相连。帽子的功能还不十分清楚，但一定具有重要功能，帽子的功能还不十分清楚，但一定具有重要功能，可能为：可能为：增加增加mRNAmRNA的稳定性；的稳定性；作为核糖体识别作为核糖体识别mRNAmRNA的信号。的信号。第22页/共53页2023/3/2723根据甲基化程度，帽子结构分为三种类型：根据甲基化程度，帽子结构分为三种类型：cap0cap0：只有：只有55端端7-7-甲基鸟苷甲基鸟苷。所有所有真核生物中都存真核生物中都存在。在。cap1cap1：除：除55端端7-7-甲基鸟苷甲基鸟苷外，还有外，还有第二位第二位碱基的核碱基的核糖糖2-O2-O位甲基化位甲基化。除单细胞真核生物外，。除单细胞真核生物外，cap1cap1是一是一种种多数形式多数形式。高等真核生物中偶有第二位碱基高等真核生物中偶有第二位碱基2-O2-O甲基化甲基化后，再次发生后，再次发生N N6 6位甲基化位甲基化，而且要求，而且要求第二位第二位碱基是碱基是腺嘌呤腺嘌呤。cap2cap2：在：在cap1cap1基础上，基础上，第三位第三位碱基发生核糖碱基发生核糖2-O2-O甲基化甲基化。cap2cap2只占所有加帽只占所有加帽mRNAmRNA的的10-15%10-15%。第23页/共53页2023/3/2724第24页/共53页2023/3/2725是否还曾记得？CTD在RNA加工过程中可能是一个关键点：5端加帽酶（鸟苷酸转移酶）结合在CTD上与剪接相关的蛋白质也结合在CTD上3端聚腺苷酸化装置也结合在CTD上第25页/共53页2023/3/2726polyA是由polyA聚合酶（polyA polymerase，PAP）催化合成，而非由DNA编码。S 3端剪切及加尾多数真核生物多数真核生物mRNAmRNA的的33末端具有约为末端具有约为200nt200nt长的长的polyApolyA尾。组蛋白尾。组蛋白mRNAmRNA不具有该特征。不具有该特征。RNARNA聚合酶聚合酶没有专一性的终止子序列，转录进没有专一性的终止子序列，转录进行到行到33端端相应位点（聚腺苷酸化位点）相应位点（聚腺苷酸化位点）后，后，RNARNA中的序列成为核酸内切酶切割和随后的多聚腺苷中的序列成为核酸内切酶切割和随后的多聚腺苷酸化的靶标。酸化的靶标。第26页/共53页2023/3/2727第27页/共53页2023/3/2728聚腺苷酸化位点聚腺苷酸化位点（polyadenylation site)polyadenylation site)由三部由三部分组成：分组成：聚腺苷酸化信号聚腺苷酸化信号(polyadenylation signal)(polyadenylation signal)，即：，即：polyApolyA添加位点上游添加位点上游10-6010-60个碱基处的保守序列个碱基处的保守序列55AAUAAAAAUAAA33；切点处的切点处的5-5-YAYA-3-3；切点下游富含切点下游富含GUGU的序列的序列5-5-GUGUGUGGUGUGUG-3-3。第28页/共53页2023/3/2729第29页/共53页2023/3/2730单一加工复合体单一加工复合体同时负责切割和多聚腺苷酸化。同时负责切割和多聚腺苷酸化。切割因子切割因子CFCF和和CFCF构成内切酶活性区域构成内切酶活性区域 专一性因子专一性因子CPSFCPSF识别识别AAUAAAAAUAAA序列，并指导其他活序列，并指导其他活性的发生性的发生 一种一种刺激因子刺激因子CstFCstF结合到富含结合到富含GUGU区区 PAPPAP进行进行A A残基的逐个添加。约添加残基的逐个添加。约添加200200个个A A后，复合后，复合物解体。物解体。PABPPABP结合在结合在polyApolyA上，增加上，增加mRNAmRNA稳定性。稳定性。第30页/共53页2023/3/2731第31页/共53页2023/3/2732在胚胎发育过程中，非poly（A）化的mRNA作为一种贮存形式，在poly（A）化后开始翻译。poly（A）的功能：有助于稳定有助于稳定mRNAmRNA分子，因此，与分子，因此，与mRNAmRNA的寿命的寿命相关。但相关。但polypoly（A A）的长度与）的长度与mRNAmRNA寿命没有相关性。寿命没有相关性。mRNA mRNA的的polypoly（A A）化）化有利于翻译有利于翻译，为核糖体提供，为核糖体提供识别识别mRNAmRNA的信号，其具体机制尚不清楚。的信号，其具体机制尚不清楚。第32页/共53页2023/3/2733 mRNA的polyA在分子生物学操作技术中有很大应用价值：mRNA mRNA分离：利用分离：利用oligooligo（dTdT）与载体相连，可）与载体相连，可以从总以从总RNARNA中纯化中纯化mRNAmRNA。cDNA cDNA合成：利用合成：利用oligooligo（dTdT）作为引物，可以反）作为引物，可以反转录合成转录合成cDNAcDNA。第33页/共53页2023/3/2734第34页/共53页2023/3/2735S RNA的剪接 回顾几个基本概念：断裂基因断裂基因（interrupted geneinterrupted gene）：真核生物的基因含有内含子，）：真核生物的基因含有内含子，称为断裂基因。称为断裂基因。内含子内含子（intronintron）：真核生物的基因序列中某些序列不出现：真核生物的基因序列中某些序列不出现在成熟的在成熟的mRNAmRNA中，这些序列称为内含子。中，这些序列称为内含子。外显子外显子（exonexon）：被内含子隔开的出现在成熟：被内含子隔开的出现在成熟mRNAmRNA中的序中的序列称为外显子。列称为外显子。RNARNA剪接剪接（RNA splicingRNA splicing）：一个基因的外显子和内含子共：一个基因的外显子和内含子共同转录在一条转录产物中，然后内含子被切除，外显子被连接同转录在一条转录产物中，然后内含子被切除，外显子被连接起来形成成熟的起来形成成熟的RNARNA，这一过程称为，这一过程称为RNARNA的剪接。的剪接。第35页/共53页2023/3/2736第36页/共53页2023/3/2737剪接位点 剪接位点（splicing site）：指内含子与外显子交界处的序列。内含子上游的剪接点称为5剪接点或左剪接点或供体位点（donor site），下游方向的剪接点称为3剪接点或右剪接点或受体位点（acceptor site）。GU-AG GU-AG规则：内含子两端剪接位点的识别是根据起规则：内含子两端剪接位点的识别是根据起始点为双核苷酸始点为双核苷酸GUGU，结束位点为，结束位点为AGAG来确定的，剪来确定的，剪接位点的这种特征常常称为接位点的这种特征常常称为GU-AGGU-AG规则。规则。GU-AG GU-AG规则在真核生物核基因规则在真核生物核基因mRNAmRNA剪接中具有普剪接中具有普遍适用性。遍适用性。核基因mRNA剪接所需要的序列特征第37页/共53页2023/3/2738第38页/共53页2023/3/2739 高等真核生物分支位点没有高度保守性，但在每一位点都有嘧啶或嘌呤的偏好。分支位点（branch site）分支位点在分支位点在33端剪接点的识别中起重要作用。端剪接点的识别中起重要作用。酵母分支位点是高度保守的，共有序列酵母分支位点是高度保守的，共有序列UACUAACUACUAAC。3端附近有一个富含嘧啶的区域第39页/共53页2023/3/2740第40页/共53页2023/3/2741剪接过程第一次转酯（transesterification）反应：分支点序列中A残基上的2羟基攻击内含子5端剪接点处G之前的磷酸二酯键，发生第一次转酯反应，形成一个称为索套的带尾的环状结构，释放出外显子1。第第二二次次转转酯酯反反应应：外外显显子子1 1的的33羟羟基基攻攻击击内内含含子子剪剪接接点点3AG3AG之之后后的的磷磷酸酸二二酯酯键键，发发生生第第二二次次转转酯酯反反应，两个外显子连接在一起。应，两个外显子连接在一起。内含子内含子以索套形式以索套形式释放释放，最终被降解。，最终被降解。第41页/共53页2023/3/2742第42页/共53页2023/3/2743 反式剪接S一般情况下，只有同一条RNA分子上的不同外显子通过剪接连接在一起，称为顺式剪接（cis splicing）。S S在少数特殊情况下，在少数特殊情况下，两个两个RNARNA分子分子的内含子中的内含子中存在互补序列时可能发生存在互补序列时可能发生反式剪接反式剪接（trans trans splicingsplicing），即不同），即不同RNARNA分子的分子的外显子连接外显子连接在一在一起。锥虫、秀丽线虫中存在反式剪接。起。锥虫、秀丽线虫中存在反式剪接。第43页/共53页2023/3/2744第44页/共53页2023/3/2745 可变剪接：特定内含子保留成为外显子（内含子保留）；或特定的外显子被剪切，在成熟的mRNA中不保留该外显子（外显子跳读）。mRNA的可变加工 在许多情况下，真核生物的一个特定前在许多情况下，真核生物的一个特定前mRNAmRNA会产生会产生出一种以上的出一种以上的mRNAmRNA，这种加工过程称为，这种加工过程称为mRNAmRNA可变加工。可变加工。S mRNA mRNA可变加工的方式：可变加工的方式：多启动子选择：由于启动子的选择造成外显子的差异。多启动子选择：由于启动子的选择造成外显子的差异。可变可变polypoly（A A）加工：由于存在可被选择利用的）加工：由于存在可被选择利用的polypoly（A A）位点，而产生具有不同）位点，而产生具有不同33末端的成熟末端的成熟mRNAmRNA。第45页/共53页2023/3/2746第46页/共53页2023/3/2747S S mRNA mRNA可变加工实例：可变加工实例：第47页/共53页2023/3/2748 RNA编辑（RNA editing）S S 原原始始转转录录产产物物的的一一些些序序列列被被更更改改，产产生生的的mRNAmRNA序序列列与与相相应应基基因因序序列列产产生生较较大大差差异异的的加加工工方式。方式。S S RNARNA编编辑辑可可发发生生在在个个别别碱碱基基。例例如如哺哺乳乳动动物物小小肠和肝中载脂蛋白肠和肝中载脂蛋白B B基因的基因的mRNAmRNA编辑。编辑。第48页/共53页2023/3/2749第49页/共53页2023/3/2750S RNA编辑可由向导RNA指导。例如：锥虫细胞色素氧化酶基因的例如：锥虫细胞色素氧化酶基因的RNARNA编辑。在编辑。在gRNAgRNA指导指导下，由下，由核酸内切酶核酸内切酶、末端尿苷酰转移酶末端尿苷酰转移酶、RNARNA连接酶连接酶组成的复合物催化产生成熟组成的复合物催化产生成熟mRNAmRNA。第50页/共53页2023/3/2751第51页/共53页2023/3/2752第52页/共53页2023/3/2753感谢您的观看！第53页/共53页