酶工程 抗体酶、核酶和极端酶课件.ppt

关于酶工程 抗体酶、核酶和极端酶第1页，此课件共61页哦第一节第一节 抗体酶（抗体酶（Abzyme)Abzyme)一、抗体酶的理论基础一、抗体酶的理论基础1.1.抗体蛋白的特性：抗体蛋白的特性：2.2.抗体（抗体（antibodyantibody）：）：3.3.抗原（抗原（antigenantigen）：）：4.4.半抗原（半抗原（haptenhapten）：）：第2页，此课件共61页哦第3页，此课件共61页哦IgG的三级结构的三级结构第4页，此课件共61页哦IgGIgG与抗原形成与抗原形成 的交联晶格的交联晶格第5页，此课件共61页哦抗体与酶的异同：抗体与酶的异同：相同点：相同点：都是蛋白质，都有特异性。都是蛋白质，都有特异性。不同点：不同点：1）抗体无催化活力，酶有催化活力。）抗体无催化活力，酶有催化活力。2）本质差别：酶是能与反应过渡态选择结合的）本质差别：酶是能与反应过渡态选择结合的催化物质，抗体是和基态紧密结合的物质。催化物质，抗体是和基态紧密结合的物质。第6页，此课件共61页哦3）酶的活性和合成受到代谢调节，种）酶的活性和合成受到代谢调节，种类有限。类有限。抗体只有在抗原存在时才产生，种类无抗体只有在抗原存在时才产生，种类无限。限。第7页，此课件共61页哦2.2.酶与底物形成过渡态理论酶与底物形成过渡态理论 酶的催化在于能结合底物产生过渡态，酶的催化在于能结合底物产生过渡态，降低能障（反应的活化能）。降低能障（反应的活化能）。以过渡态类似物作为半抗原，诱导与以过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互补构象的抗体，使其具有催化活性，其互补构象的抗体，使其具有催化活性，可观察到抗体催化相应底物发生化学反应。可观察到抗体催化相应底物发生化学反应。第8页，此课件共61页哦二、抗体酶的定义二、抗体酶的定义 抗体酶又称催化抗体（抗体酶又称催化抗体（catalytic antibody），是抗体的高度选择性和酶的高），是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性。区赋予了酶的属性。第9页，此课件共61页哦 三、抗体酶的制备三、抗体酶的制备 1.诱导法诱导法 用设计好的半抗原，通过与载体蛋白（如牛用设计好的半抗原，通过与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对动物进行免血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对动物进行免疫，取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交，杂疫，取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞则分泌单克隆抗体，经筛选和纯化，得抗交细胞则分泌单克隆抗体，经筛选和纯化，得抗体酶。体酶。第10页，此课件共61页哦第11页，此课件共61页哦2.拷贝法拷贝法 用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。活性的抗体酶。缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生新缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生新酶酶.第12页，此课件共61页哦第13页，此课件共61页哦3 引入法引入法将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位，可采用选择性化学修饰方法，亦可利用蛋白质工程和基因工程技术第14页，此课件共61页哦引入法举例引入法举例第15页，此课件共61页哦四、抗体酶的应用四、抗体酶的应用 1.1.戒毒戒毒:用可卡因水解的过渡态类似物用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原，磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，水解后的可卡因产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。片断失去可卡因刺激功能。第16页，此课件共61页哦 2.肿瘤治疗肿瘤治疗 抗体介导前药治疗技术抗体介导前药治疗技术:将能水解前药释放出肿瘤细胞将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，则酶通过和肿瘤结合毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，则酶通过和肿瘤结合的抗体存在于细胞的表面。静脉给药后，当药物扩散至肿的抗体存在于细胞的表面。静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶将前药迅速水解释放出抗肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物。瘤药物。第17页，此课件共61页哦抗体酶的催化反应抗体酶的催化反应1酰基转移反应酰基转移反应第18页，此课件共61页哦2重排反应重排反应第19页，此课件共61页哦3氧化还原反应氧化还原反应第20页，此课件共61页哦5磷酸酯水解反应磷酸酯水解反应第21页，此课件共61页哦6磷酸酯闭环反应磷酸酯闭环反应第22页，此课件共61页哦7.光诱导反应光诱导反应a.光聚合反应（二聚作用）第23页，此课件共61页哦b.光裂解反应光裂解反应第24页，此课件共61页哦研究展望1 研究酶作用机理，获得蛋白质结构与功能间关系的一般规律。2 获得一类新型的蛋白酶。3 催化天然酶不能催化的反应。第25页，此课件共61页哦第二节 核 酶（Ribozyme)一、核酶的概念二、核酶的种类三、核酶的应用四、核酶面临的问题五、影响核酶活性的因素第26页，此课件共61页哦ribozymeribozyme的发现的发现80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的Thomas Cech和美国耶鲁大学的和美国耶鲁大学的Sidnery Altman各自独立地发现各自独立地发现RNA具有生物催化功能具有生物催化功能.从而改变了从而改变了生物催比剂的传统概念。生物催比剂的传统概念。为此，为此，T.Cech和和S.Altman共同获得了共同获得了1989年度年度诺贝尔化学奖。诺贝尔化学奖。第27页，此课件共61页哦 具有生物催化功能的RNA。一、核酶的概念生物催化剂生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：天然酶蛋白质类：天然酶 enzyme 极端酶极端酶 extremozyme 抗体酶抗体酶 abzyme 生物工程酶生物工程酶其它：模拟酶其它：模拟酶核酸类核酸类:克隆酶克隆酶遗传修饰酶遗传修饰酶蛋白质工程新酶蛋白质工程新酶、RibozymeDeoxyribozyme第28页，此课件共61页哦 I型内含子剪接型核酶 II型内含子 锤头核酶剪切型核酶 发夹核酶 自体催化 丁型肝炎病毒（HDV)核酶 RNaseP 异体催化 二、核酶的分类第29页，此课件共61页哦 自然界存在催化分子内反应（in cis）的ribozyme(自我剪接型和自我剪切型)和催化分子间反应(in trans)的ribozyme。第30页，此课件共61页哦自我剪接ribozyme分类自我剪接ribozyme可分为两类：型IVS：均与四膜虫大核rRNA前体的IVS结构相似、催化自我剪接需鸟苷（或5鸟苷酸）和Mg2+参与。型IVS：结构与四膜虫的不同，而与细胞核mRNA前体中的IVS相似。它催化自我剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参与，但仍需Mg2+第31页，此课件共61页哦2自我剪切ribozyme的分类自我剪切ribozyme,自我剪切的RNA结构有锤头结构和发夹结构，其中尖头指出自我剪切的部位。自我剪接ribozyme：包含剪切与连接两个步骤。第32页，此课件共61页哦几种能进行自我剪切的几种能进行自我剪切的RNARNA结构结构第33页，此课件共61页哦催化分子间反应的ribozyme的分类如：L-19IVS具有5种酶活性，可催化多种分子间反应。第34页，此课件共61页哦第35页，此课件共61页哦1.1.剪接型核酶剪接型核酶 剪接型核酶的作用机制是通过既剪又剪接型核酶的作用机制是通过既剪又接的方式除去内含子（接的方式除去内含子（Intron)Intron)。第36页，此课件共61页哦1 1）I I类内含子的自我剪接类内含子的自我剪接(Self-splicing)(Self-splicing)I I型型IVSIVS是与四膜虫是与四膜虫26srRNA26srRNA前体的前体的IVSIVS结构结构相似的间隔序列，具有环状结构。通过转相似的间隔序列，具有环状结构。通过转磷酸酯反应，生成成熟的磷酸酯反应，生成成熟的26srRNA26srRNA及及G-IVSG-IVS，G-IVSG-IVS经两次环化生成经两次环化生成L-19IVSL-19IVS。催化过。催化过程需要鸟苷酸或鸟苷以及镁离子参与。程需要鸟苷酸或鸟苷以及镁离子参与。剪接机制剪接机制L-19IVSL-19IVS在体外的多种酶活性在体外的多种酶活性第37页，此课件共61页哦p 3 HO-Gp3 pP-GOHp P-G3HO 类内含子的剪接机制Mg 2+或Mn 2+GMP,GDP,GTP外显子外显子 内含子或居间序列内含子或居间序列（Intervening sequence,IVS)5第38页，此课件共61页哦 第39页，此课件共61页哦UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU A AAGUAAUCUoH35GAAAGUAAUCUUAA5GAAAGOH 3 G-IVSL-19IVS19nt53rRNA535pGOH353四膜虫rRNA前体自我剪接反应第40页，此课件共61页哦第41页，此课件共61页哦1、转核苷酸作用转核苷酸作用 2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC +CpCpCpC2、水解作用水解作用 CpCpCpCpC CpCpCpC+pC3、转磷酸作用转磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpU CpCpCpCpCpC+UpCpUp4、去磷酸作用去磷酸作用 CpCpCpCpCp CpCpCpCpC+Pi5、限制性内切酶作用限制性内切酶作用 CpUpCpUpN +G CpUpCpU +GpN 第42页，此课件共61页哦2 2）类内含子的自我剪接类内含子的自我剪接型型IVSIVS是与细胞核是与细胞核mRNAmRNA前体的前体的IVSIVS结构结构相似的间隔序列。通过转磷酸酯反应，相似的间隔序列。通过转磷酸酯反应，生成成熟的生成成熟的RNARNA及套环状的及套环状的IVSIVS。催化的。催化的剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但仍需要镁离子仍需要镁离子(Mg(Mg2+2+)。剪接机制剪接机制第43页，此课件共61页哦p 2 HO-Ap p-A p3OHpP-AHO 3类内含子的剪接机制Mg 2+套环的形成套环的形成53外显子连接外显子连接第44页，此课件共61页哦2.2.剪切型核酶剪切型核酶 这类这类RNARNA进行自身催化的反应是只切不接。进行自身催化的反应是只切不接。1 1）自体催化剪切型）自体催化剪切型 剪切机制剪切机制 第45页，此课件共61页哦转酯化过程：转酯化过程：由靠近切割位由靠近切割位点点33端的端的2OH2OH或或氧原子对切割位点氧原子对切割位点的磷原子实施亲核的磷原子实施亲核攻击，产生攻击，产生5-OH 5-OH 和和22，3-3-环磷酸环磷酸二酯二酯。剪剪 切切 机机 制制核酶自身剪切反应核酶自身剪切反应第46页，此课件共61页哦锤头型核酶的二级结构 和空间立体结构示意图三个双螺旋区。三个双螺旋区。1313个核苷酸残基个核苷酸残基保守序列。保守序列。剪切反应在右上方剪切反应在右上方GUXGUX序列的序列的33端自端自动发生。动发生。第47页，此课件共61页哦发夹（发夹（hairpin hairpin）结构）结构19891989年汉普（年汉普（HampleHample）研究烟草环斑病毒）研究烟草环斑病毒（sTRSVsTRSV）的负链）的负链RNARNA的自我剪切反应，提的自我剪切反应，提出发夹结构（出发夹结构（hairpin structurehairpin structure）模型。）模型。发夹核酶结构模型发夹核酶结构模型第48页，此课件共61页哦四个螺旋区、三个连四个螺旋区、三个连接区和两个环。接区和两个环。剪切反应发生在底剪切反应发生在底物识别序列物识别序列GUCGUC的的55端。端。53 发夹二级结构模型剪切位点第49页，此课件共61页哦2)2)异体催化剪切型异体催化剪切型 核糖核酸酶核糖核酸酶P(RNaseP)P(RNaseP)是内切核酸酶，是是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有核糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNAtRNA前体的前体的55端，除去多余的序列，形成端，除去多余的序列，形成3-OH 3-OH 和和 5-5-磷磷酸末端。酸末端。l RNasePRNaseP由由M1RNAM1RNA和蛋白质亚基组成。和蛋白质亚基组成。第50页，此课件共61页哦三、核酶的应用三、核酶的应用1.1.基础理论：生命起源的探索基础理论：生命起源的探索2.2.医药：医药：1 1）通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效）通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。如抗肝炎病毒、抗人类免疫缺陷病毒率高，专一性强。如抗肝炎病毒、抗人类免疫缺陷病毒型（型（HIV-)HIV-)、抗肿瘤。、抗肿瘤。2 2）免疫原性低，很少引起免疫反应。）免疫原性低，很少引起免疫反应。3.3.植物抗病毒植物抗病毒第51页，此课件共61页哦 四、核酶面临的问题四、核酶面临的问题1 1、核酶催化效率低。、核酶催化效率低。2 2、核酶本身是、核酶本身是RNARNA，很容易被核酸水解酶，很容易被核酸水解酶 RNaseRNase破坏。破坏。第52页，此课件共61页哦五、影响核酶活性的因素五、影响核酶活性的因素1 1、pHpH值对活性的影响：值对活性的影响：pH7.0-7.5pH7.0-7.5时核酶活性最高。时核酶活性最高。2 2、二价金属阳离子对活性的影响、二价金属阳离子对活性的影响:Mg:Mg2+2+Mn Mn2+2+3 3、抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应、抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应4 4、变性剂对活性的影响、变性剂对活性的影响:5 5、温度对活性的影响、温度对活性的影响:第53页，此课件共61页哦Ribozyme研究进展与展望对各种已知ribozyme结构与功能关系的研究。可找出其结构功能域和必需基团，据此可进行分子改造，以获得分子更小的、高效的ribozyme 第54页，此课件共61页哦研究热点：从催化分子内反应的自我剪切ribozyme设计出催化分子间反应的ribozyme.第55页，此课件共61页哦Ribozyme的固定化Ribozyme的固定化已成功，将在医学、工业上获得应用。意义：对各种RNA-蛋白质复合物酶的分离鉴定，对许多具有特别重要生物功能的RNA和蛋白质构成的颗粒体。在自然界将会发现更多的具有自我剪接或自我剪切的RNA分子和以非RNA为底物的ribozyme第56页，此课件共61页哦第三节 极端酶（extremozyme）一、极端微生物和极端酶一、极端微生物和极端酶 1.1.极端微生物：极端微生物：又称嗜极菌（又称嗜极菌（extremophilesextremophiles），是在超常），是在超常生态环境条件下生存的微生物。生态环境条件下生存的微生物。第57页，此课件共61页哦 根据所耐受的环境条件不同，分为：根据所耐受的环境条件不同，分为：嗜热菌（嗜热菌（thermophiles）超嗜热菌（超嗜热菌（hyperthermophiles）嗜冷菌（嗜冷菌（psychrophiles）嗜盐菌（嗜盐菌（halophiles）嗜酸菌（嗜酸菌（acidophiles）嗜碱菌嗜碱菌（alkaliphiles）嗜压菌（嗜压菌（barophiles）抗辐射的微生物抗辐射的微生物第58页，此课件共61页哦2.2.极端酶的制备极端酶的制备 1 1）天然极端酶的筛选和生产）天然极端酶的筛选和生产 2 2）蛋白质工程生产极端酶）蛋白质工程生产极端酶第59页，此课件共61页哦思考题：思考题：第60页，此课件共61页哦感感谢谢大大家家观观看看第61页，此课件共61页哦