核酸分子杂交七年制精选PPT.ppt

关于核酸分子杂交七年制第1页，讲稿共49张，创作于星期二核酸分子杂交核酸分子杂交（nucleic acid molecular hybridization）是指用是指用标标记的记的已知已知DNA或或RNA片段片段检测样品中检测样品中未知核酸序未知核酸序列列，通过，通过碱基互补配对碱基互补配对原则发生同源性结合，再经原则发生同源性结合，再经显影或显色显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。大小显示出来。探针探针(probe)：带有可检测标记的已知序列的：带有可检测标记的已知序列的DNA或或RNA片段。片段。第2页，讲稿共49张，创作于星期二应用：应用：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。目前核酸分子因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。目前核酸分子杂交不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用杂交不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床基因而且在临床基因诊断上的应用也日趋增多。诊断上的应用也日趋增多。检测对象检测对象:克隆化的基因组克隆化的基因组DNA,、细胞总、细胞总DNA、总、总RNA。杂。杂交方法不同，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交交方法不同，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交,即细胞原位杂交。即细胞原位杂交。核酸分子杂交特点：核酸分子杂交特点：高度的灵敏性高度的灵敏性(pg)、高度的特异性、高度的特异性第3页，讲稿共49张，创作于星期二第一节第一节 核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理一、变性（一、变性（denaturation）二、复性（二、复性（renaturation）三、杂交（三、杂交（hybridization）四、预杂交（四、预杂交（prehybridization）第4页，讲稿共49张，创作于星期二 基本原理基本原理：DNA变性、复性与分子杂交变性、复性与分子杂交第5页，讲稿共49张，创作于星期二Hybridization第6页，讲稿共49张，创作于星期二Tm：50%DNA解链的温度，又称融解温度。解链的温度，又称融解温度。（G、C含量）含量）Tm=69.3+0.41*(G+C)%融解温度：融解温度：50杂化杂化核酸分子解链温度称核酸分子解链温度称为寡核苷酸探针的为寡核苷酸探针的Tm值。值。寡核苷酸探针的长度、寡核苷酸探针的长度、碱基的含量和核酸的序碱基的含量和核酸的序列决定了探针的列决定了探针的Tm值。值。实际操作中，常选择实际操作中，常选择低于低于Tm值值5-10进行进行杂交。杂交。Tm=4 X（G+C）+2 X（A+T）第7页，讲稿共49张，创作于星期二杂交温度：杂交温度：Tm=81.5+161.6logM+0.41（G+C）%-500/n-0.61（甲酰胺（甲酰胺%）M为为Na+摩尔浓度，摩尔浓度，n为探针的复杂性为探针的复杂性 例例如如，一一个个长长度度为为500bp的的探探针针，（G+C）含含量量为为50%，杂杂交交体体系系中中含含5 X SSC（0.75mol/L Na+）和和50%甲甲酰酰胺胺，则则其其Tm值为：值为：Tm=81.5+(-2.07)+20.5 1 30.5=68.4 50%甲酰胺溶液甲酰胺溶液,温度一般选择低于温度一般选择低于 Tm值值20-25杂交温度应杂交温度应:68.4 -25=43.2 甲酰胺是一种变性剂，能干扰碱基堆积力和氢键的形成，降低核甲酰胺是一种变性剂，能干扰碱基堆积力和氢键的形成，降低核酸杂交的酸杂交的Tm值，值，50%的甲酰胺可以使的甲酰胺可以使Tm降低降低30第8页，讲稿共49张，创作于星期二53535353影响核酸分子杂交的因素影响核酸分子杂交的因素探针的浓度、长度、复杂性探针的浓度、长度、复杂性离子强度离子强度温度与变性剂（甲酰胺）温度与变性剂（甲酰胺）杂交条件的严谨性杂交条件的严谨性 第9页，讲稿共49张，创作于星期二预杂交预杂交prehybridization概念：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的概念：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合非特异性结合，在，在杂交前用封闭物将这些杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭非特异性位点封闭。这一杂交前的。这一杂交前的处理过程称为预杂交。处理过程称为预杂交。常用的封闭物：常用的封闭物：（1）变性的非特异性变性的非特异性DNA:如鲑鱼精如鲑鱼精DNA、小牛胸腺、小牛胸腺DNA，又称为，又称为覆盖覆盖DNA。（2）高分子化合物：高分子化合物：Denhardt溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖清白蛋白、聚蔗糖400、脱脂奶粉脱脂奶粉第10页，讲稿共49张，创作于星期二基本实验步骤：基本实验步骤：electrophoresisTransferBlockblocksubstrateprobeMigrationhybridization第11页，讲稿共49张，创作于星期二第二节第二节 核酸探针核酸探针probe：带有：带有可检测标记的已知可检测标记的已知DNA或或RNA片段，用于检片段，用于检测待测样品中的靶核酸序列。测待测样品中的靶核酸序列。核酸探针的类型核酸探针的类型 核酸探针的标记方法核酸探针的标记方法 核酸探针的检测核酸探针的检测 第12页，讲稿共49张，创作于星期二按化学本质分：按化学本质分：DNA探针探针 RNA探针探针 按标记物分：按标记物分：放射性标记探针放射性标记探针核酸探针的类型核酸探针的类型 3H、32P、35S、125I等等优点：高特异性，高灵敏度优点：高特异性，高灵敏度缺点：存在放射性污染，半衰期短缺点：存在放射性污染，半衰期短非放射性标记探针非放射性标记探针生物素，地高辛、荧光素等生物素，地高辛、荧光素等第13页，讲稿共49张，创作于星期二常用的探针标记法：常用的探针标记法：（1）化学标记法化学标记法：光敏生物素标记法：光敏生物素标记法（2）酶促标记法酶促标记法：将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶学的方法将标记物掺入到探针分子上。学的方法将标记物掺入到探针分子上。切刻平移法、随机引物法、末端标记法等切刻平移法、随机引物法、末端标记法等第14页，讲稿共49张，创作于星期二光敏生物素标记法光敏生物素标记法:强光强光10-20分钟，光敏基团与核酸探针的磷酸分钟，光敏基团与核酸探针的磷酸基团以共价键结合。基团以共价键结合。第15页，讲稿共49张，创作于星期二（2）酶促标记法：）酶促标记法：将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶学的将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶学的 方法将标记物掺入到探针分子上。方法将标记物掺入到探针分子上。缺口平移法、随机引物法、末端标记法等缺口平移法、随机引物法、末端标记法等32P或或35S同位素标记同位素标记的单核苷酸的单核苷酸dig-dUTP的结构的结构第16页，讲稿共49张，创作于星期二（1）缺口平移法）缺口平移法由由DNA酶酶和大肠和大肠杆菌杆菌DNA聚合酶聚合酶共同完成。共同完成。DNA酶酶：在双链在双链DNA上随机打开若上随机打开若干个单链缺口，产干个单链缺口，产生生3-OH端端大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合聚合酶酶：53DNA聚聚合酶活性；合酶活性；53外切核酸酶活性外切核酸酶活性（nicktranslation）“边切除、边聚合边切除、边聚合”第17页，讲稿共49张，创作于星期二最合适的缺口平移片段一般为最合适的缺口平移片段一般为50-500个核苷酸。个核苷酸。DNA酶酶的的用量用量和和E.coli DNA聚合酶聚合酶的的质量质量会影响产物片会影响产物片段的大小。段的大小。DNA模板中的模板中的抑制物抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性如琼脂糖会抑制酶的活性,故应使用仔故应使用仔细纯化后的细纯化后的DNA。第18页，讲稿共49张，创作于星期二随机引物（随机引物（4-6nt）：含有各：含有各种可能排列顺序的寡核苷种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。酸片段的混合物。46=4096DNA聚合酶聚合酶Klenow片段：片段：53DNA聚合酶活性聚合酶活性 弱弱35外切核酸酶活性外切核酸酶活性 无无53外切核酸酶活性外切核酸酶活性（2）随机引物法）随机引物法（random priming）第19页，讲稿共49张，创作于星期二产物平均长度为产物平均长度为400-600个核苷酸。个核苷酸。Klenow片段没有片段没有5 3外切酶活性外切酶活性,反应稳定反应稳定,可以获得大可以获得大量的有效探针。量的有效探针。反应时对模板的要求不严格反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒用微量制备的质粒DNA模板也可模板也可进行反应。进行反应。第20页，讲稿共49张，创作于星期二（3）探针的末端标记：在）探针的末端标记：在5或或3端通过酶促反应加上标记物端通过酶促反应加上标记物酶切酶切第21页，讲稿共49张，创作于星期二核酸探针检测方法核酸探针检测方法同位素标记探针：放射自显影检测杂交信号同位素标记探针：放射自显影检测杂交信号 放射自显影是指利用放射线在放射自显影是指利用放射线在x线片的成影作用来检测杂线片的成影作用来检测杂交信号。交信号。取出杂交膜，在取出杂交膜，在Whatman滤纸上晾干，用保鲜膜包好，滤纸上晾干，用保鲜膜包好，在暗室中置于在暗室中置于X线片上，加增感屏，固定于暗盒内，线片上，加增感屏，固定于暗盒内，-70曝曝光适当时间（光适当时间（1-7天），在暗室中取出天），在暗室中取出X线片，显影、定影，即线片，显影、定影，即可在可在X线片上读出杂交带。线片上读出杂交带。第22页，讲稿共49张，创作于星期二非放射性标记探针：非放射性标记探针：偶联反应偶联反应+显色反应显色反应Dig：半抗原，可通过半抗原，可通过抗原抗体反应抗原抗体反应系统与系统与显色体系显色体系偶联偶联Dig-DNA探针探针 +抗抗Dig抗体抗体-碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（或辣根过氧化物酶（HRP）+底物底物 ：BCIP+NBT 蓝紫色蓝紫色或或 DAB 红棕色红棕色；TMB 蓝色蓝色第23页，讲稿共49张，创作于星期二核酸分子杂交的分类核酸分子杂交的分类第三节第三节 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术第24页，讲稿共49张，创作于星期二一、膜上印迹杂交一、膜上印迹杂交 印迹技术印迹技术：将凝胶中待测的核酸分子转移到一定：将凝胶中待测的核酸分子转移到一定 的固相支持物上的方法。的固相支持物上的方法。指将待测核酸序列结合到一定的指将待测核酸序列结合到一定的支持物支持物上，然后与存在于上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。液相中的核酸探针进行杂交的过程。第25页，讲稿共49张，创作于星期二1固相支持物的选择固相支持物的选择特点：特点：较强的结合核酸的能力较强的结合核酸的能力（10g/cm2）;与核酸分子结合后，不影响核酸与探针的杂交反应与核酸分子结合后，不影响核酸与探针的杂交反应;与核酸分子的结合稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等；与核酸分子的结合稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等；非特异性吸附少，经洗膜能将非特异性吸附的探针洗脱掉非特异性吸附少，经洗膜能将非特异性吸附的探针洗脱掉;具有良好的机械性能，柔软性好、韧性强，便于操作。具有良好的机械性能，柔软性好、韧性强，便于操作。常用的固相支持物：常用的固相支持物：硝酸纤维膜（硝酸纤维膜（NC）、尼龙膜、）、尼龙膜、PVDF膜（聚二氟乙烯膜）等膜（聚二氟乙烯膜）等第26页，讲稿共49张，创作于星期二固相支持物的选择固相支持物的选择良好的固相支持物应具备的条件：良好的固相支持物应具备的条件：具有较强的结合核酸分子的能力（具有较强的结合核酸分子的能力（10g/cm10g/cm2 2）与核酸分子结合后不影响其与探针分子的杂交反应与核酸分子结合后不影响其与探针分子的杂交反应与核酸分子结合牢固与核酸分子结合牢固非特异性吸附少非特异性吸附少具有良好的机械性，柔软性好、韧性强，便于操作具有良好的机械性，柔软性好、韧性强，便于操作常用的固相支持物常用的固相支持物 硝酸纤维膜、尼龙膜、硝酸纤维膜、尼龙膜、PVDFPVDF膜等膜等第27页，讲稿共49张，创作于星期二第28页，讲稿共49张，创作于星期二第29页，讲稿共49张，创作于星期二第30页，讲稿共49张，创作于星期二2印迹方法印迹方法 Mechanics of transfer虹吸印迹法（虹吸印迹法（Capillary）真空转移法（真空转移法（Vacuum）电转移法（电转移法（Electrophoretic）Blot DNA to membrane第31页，讲稿共49张，创作于星期二 Capillary Blotting(upward)no special equipment required!1975年年 E.Southern Southern DNA 印迹转移技术印迹转移技术DNA片段片段15kb，18小时小时第32页，讲稿共49张，创作于星期二Electrophoretic blotting不宜用硝酸纤不宜用硝酸纤维素膜维素膜一般一般23小时，小时，最多最多6 8小时小时especially good for small fragments resolved by PAGE第33页，讲稿共49张，创作于星期二Vacuum blotting3060分钟分钟more efficient and quantitative than capillarymust apply vacuum evenly and not too strongly第34页，讲稿共49张，创作于星期二3印迹类型印迹类型 Southern印迹杂交印迹杂交 Northern印迹杂交印迹杂交 斑点及狭缝印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交 反向斑点杂交反向斑点杂交 菌落或噬菌斑杂交菌落或噬菌斑杂交第35页，讲稿共49张，创作于星期二提取提取DNA限制性内切酶消化限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳碱变性碱变性转移到转移到NC膜，高温烘烤膜，高温烘烤与与DNA或或RNA探针探针杂交杂交放射自显影放射自显影Southern blotting hybridization 检测靶分子为检测靶分子为DNA,检测靶分子是否检测靶分子是否含有目的基因。含有目的基因。可用于可用于基因组基因的定性及定量分析、基因组基因的定性及定量分析、克隆基因的酶切图谱分析、克隆基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。基因突变分析等。预杂交预杂交第36页，讲稿共49张，创作于星期二Paper TowelsSouthern Blotting hybridizationtissueSDSProt KPhenolChloroSpin提取提取DNA限制性内切酶消化限制性内切酶消化琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳碱变性、转移到碱变性、转移到NC膜膜与与DNA或或RNA探针探针杂交杂交放射自显影放射自显影第37页，讲稿共49张，创作于星期二Prehyb/Hybridization/Rinses第38页，讲稿共49张，创作于星期二 检测靶分子为检测靶分子为DNA,检测靶分子是否检测靶分子是否 含有目的基因。含有目的基因。DNA指纹图谱指纹图谱Southern印迹杂交的应用：印迹杂交的应用：第39页，讲稿共49张，创作于星期二Northern blotting hybridization检测靶分子为检测靶分子为RNARNA极易被极易被RNase 降解降解RNA酶抑制剂酶抑制剂0.1%DEPC处理水处理水(焦焦碳酸二乙酯碳酸二乙酯)第40页，讲稿共49张，创作于星期二与与Southern blotting hybridization不同之处：不同之处：不需要限制性核酸内切酶酶切。不需要限制性核酸内切酶酶切。变变性性方方法法不不是是碱碱变变性性，而而是是采采用用聚聚乙乙二二醛醛和和二二甲甲基基亚亚砜砜、甲甲醛醛、甲基氢氧化汞等方法。甲基氢氧化汞等方法。应用：应用：检测某一组织或细胞中已知的检测某一组织或细胞中已知的特异特异mRNA的表达水平的表达水平。比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。Northern blotting hybridization第41页，讲稿共49张，创作于星期二 pancreas kidney skeletal liver lung placenta brain heartmuscleGEF mRNASouthern blotting hybridization第42页，讲稿共49张，创作于星期二优点：优点：简单、迅速简单、迅速（直接点样）；（直接点样）；可在同一张膜上进行多个样品的检测；可在同一张膜上进行多个样品的检测；应用：应用：同一种样品经不同倍数的稀释同一种样品经不同倍数的稀释,可以得到可以得到半定量半定量的结果；的结果；核酸粗提样品的检测效果也较好。核酸粗提样品的检测效果也较好。Dot and slot blotting hybridization将变性后的将变性后的DNA或或RNA直接点样与膜上直接点样与膜上第43页，讲稿共49张，创作于星期二Reverse dot hybridization 直接将不同的探针点印并固定在膜上，再将待测的直接将不同的探针点印并固定在膜上，再将待测的DNA样品与探针杂交，这样一次杂交反应就可以判断样品与探针杂交，这样一次杂交反应就可以判断DNA是否是否含有这些探针的同源序列。含有这些探针的同源序列。DNA chip第44页，讲稿共49张，创作于星期二Colony or phage hybridization从重组从重组DNA文库中筛选阳性克隆文库中筛选阳性克隆第45页，讲稿共49张，创作于星期二二、核酸原位杂交二、核酸原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）用标记的已知核酸序列为探针，与细胞涂片或组织切片用标记的已知核酸序列为探针，与细胞涂片或组织切片 中核酸进行杂交检测的方法。中核酸进行杂交检测的方法。每张标本所用杂交液较少，每张标本所用杂交液较少，20100l，为了避免杂，为了避免杂 交交 液蒸发后造成杂交液浓缩，需使用密闭的湿盒。液蒸发后造成杂交液浓缩，需使用密闭的湿盒。在组织或细胞内进行在组织或细胞内进行DNA或或RNA精确定位和定量。精确定位和定量。第46页，讲稿共49张，创作于星期二 探针与分裂中期染色体探针与分裂中期染色体DNA杂交，研究特定核酸序列杂交，研究特定核酸序列 在染色体中的精确定位；在染色体中的精确定位；探针与细胞内探针与细胞内RNA进行杂交，观察该组织细胞中特定进行杂交，观察该组织细胞中特定 基因的表达水平；基因的表达水平；用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织细胞进用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织细胞进 行杂交，确定有无该行杂交，确定有无该病原体的感染病原体的感染。应用：应用：第47页，讲稿共49张，创作于星期二 The result of FISHThe digoxigenin-labeled probe was visualized with anti-DIG-rhodamine（red）The biotin-labeled probe,with avidin-FITC（green）第48页，讲稿共49张，创作于星期二感感谢谢大大家家观观看看第49页，讲稿共49张，创作于星期二