真核转染稳定筛选标记及原理.pptx

外源基因表达的三个概念外源基因表达的三个概念 转染转染转染转染 通过生化或者物理方法将目的基因导入真核细胞中。分类分类 转导转导 通过病毒介导，用基因组中携带有克隆目的片断的病毒来感染靶细胞。转化 通过生化或者物理方法将目的基因导入原核细胞中。第1页/共17页常用的真核表达系统常用的真核表达系统酵母表达系统丝状真菌表达系统昆虫表达系统哺乳动物表达系统第2页/共17页转转 染染 方方 法法第3页/共17页 理想的细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等特点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高、细胞毒性很低，但准备程序复杂，对细胞类型有很强的选择性很难普及。非病毒介导的转染技术中，以阳离子非脂性物质为主的混合物配方转染效率最高。该类转染具有广谱、细胞毒性小、性能稳定等特点，且不受培养液中的血清和抗生素的干扰，比脂质体介导的转染方法更方便。第4页/共17页转染后的表达1.瞬时表达 质粒转染到细胞中，一部分转运进入细胞核，进行转录输出mRNA进行蛋白质合成。几天内大部分的质粒都会被降解或传代而稀释。一周以后几乎检测不到。转染的质粒不整合到染色体上，出现短暂的（24-96h）高水平表达，依赖于质粒纯度、浓 度和转染效率。第5页/共17页2.稳定表达 转染的质粒DNA整合到染色体上可以持续存在，转染的细胞可以长期表达。整合的概率比较小，要获得稳定转染的细胞株需要筛选标记共同转染，通过选择压力维持表达稳定。需要长时间的抗性选择培养。第6页/共17页酵母表达系统常用的选择性标记酵母表达系统常用的选择性标记营养缺陷性酵母 trp1-，ura3-，his3-，leu2-，lys2-。显性选择标记，用于野生型酵母菌的转染。G418筛选。第7页/共17页哺乳动物细胞遗传性标记胸苷激酶基因（tk）选择系统二氢叶酸还原酶基因（dhfr）选择系统黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶基因（HGPRT）选择系统新霉素抗性基因（neo）选择系统氯霉素乙酰转移酶基因（cat）选择系统潮霉素抗性选择系统第8页/共17页细胞内细胞内DNA的合成途径的合成途径细胞的细胞的DNA合成有主要途径和旁路途径两种方式合成有主要途径和旁路途径两种方式1.主要途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸脲甘酸在二主要途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸脲甘酸在二氢叶酸还原酶的催化下合成氢叶酸还原酶的催化下合成DNA2.旁路途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤旁路途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶或胸腺嘧啶激酶（TK）的催化下补救合成）的催化下补救合成DNA。第9页/共17页胸苷激酶基因选择系统系统遗传标记：遗传标记：TK编码产物：编码产物：胸苷激酶筛选药物：筛选药物：HAT选择法H：次黄嘌呤；补救合成核苷酸的原料A：氨基喋呤；抑制四氢叶酸合成T：胸苷；补救合成dTTP的原料作用机理：作用机理：TK是核苷酸补救合成途径的一个关键酶第10页/共17页二氢叶酸还原酶（DHFR）基因选择系统遗传标记：遗传标记：DHFR：真核细胞生物合成核苷酸的关键酶，功能是催化二氢叶酸还原成四氢叶酸编码产物：编码产物：二氢叶酸还原酶（DHFR）筛选药物：筛选药物：叶酸类似物氨基喋呤或氨甲喋呤作用机理：作用机理：dhfr缺陷型细胞因不能合成核酸因不能合成核酸而死亡，而导入了外源基因的细胞成功存活，而死亡，而导入了外源基因的细胞成功存活，并且在氨甲喋呤的选择压力下大量表达蛋白。并且在氨甲喋呤的选择压力下大量表达蛋白。第11页/共17页黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖磷酸核糖转移酶（XGPRT）基因选择选择系统系统遗传标记：遗传标记：XGPRT编码产物：编码产物：黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖磷酸核糖转移酶筛选药物：筛选药物：霉酚酸霉酚酸作用机理：作用机理：XGPRT合成合成GMP。哺乳动物细胞无XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄嘌呤磷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT），可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸（IMP）。哺乳动物细胞可通过IMP生成GMP。当用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了GMP的合成，使细胞失去合成DNA能力而死亡。将含XGPRT基因的重组体导入真核细胞后，能表达XGPRT酶，可在含有黄嘌呤的培养基中通过XMP中间体补救合成GMP，使DNA合成正常进行。加入霉酚酸后，阳性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而阴性细胞则受霉酚酸的抑制而死亡，以此来筛选阳性细胞。第12页/共17页新霉素抗性基因选择系统遗传标记遗传标记：APH编码产物编码产物：氨基糖苷磷酸转移酶：氨基糖苷磷酸转移酶筛选药物筛选药物：新霉素，：新霉素，即G418一种氨基糖苷类抗生素，影响80S核糖体功能核蛋白质的合成作用机理作用机理：新霉素抗性基因编码3磷酸转移酶降解G418。适用于所有的真核细胞第13页/共17页氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因选择系统遗传标记遗传标记：CAT，大肠杆菌Tn9转座子编码的催化氯霉素 乙酰化反应的蛋白质编码产物编码产物：氯霉素乙酰转移酶筛选药物筛选药物：氯霉素：氯霉素作用机理作用机理：真核细胞缺乏CAT，将，将CAT作为报告基因与与目的基因一起导入到真核细胞，可在加入氯霉素的培养目的基因一起导入到真核细胞，可在加入氯霉素的培养基中选择阳性细胞。基中选择阳性细胞。常用于瞬时表达研究。第14页/共17页潮霉素抗性选择系统潮霉素抗性选择系统遗传标记遗传标记：HPH编码产物编码产物：潮霉素：潮霉素B磷酸转移酶磷酸转移酶筛选药物筛选药物：潮霉素：潮霉素B作用机理作用机理：HPH灭活潮霉素灭活潮霉素B第15页/共17页第16页/共17页感谢您的观看！第17页/共17页