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第一节 免疫分析理论知识免疫分析法：应用不同的标记物，以抗原抗体相互结合为基础的免疫学测定方法。第1页/共54页酶免疫分析 发光免疫分析放射免疫分析免疫分析种类第2页/共54页区别1、用放射性元素作标记物，称为放射免疫分析法。2、用酶作标记物，称为酶免疫分析法。3、以化学发光物质作标记，称为化学发光免疫分析法。第3页/共54页化学发光免疫的历史20世纪80年代中期在酶免疫分析基础上出现。定义：将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。第4页/共54页化学发光免疫分析包括两部分：1、免疫反应系统2、化学发光系统第5页/共54页免疫反应系统，其基本原理同酶联免疫技术（ELISA），常采用双抗体夹心法、竞争法、间接法等反应模式。第6页/共54页化学发光系统的原理发光底物在酶的作用下，底物发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子数量，该光量子数量与样品中的待测物质的量成正比。由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。第7页/共54页 光照发光光照发光：是指发光剂（荧光素）经短波长是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。（荧光）。生物发光生物发光：是指发生在生物体内的发光现象，是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用荧光素酶的催化下，利用ATPATP能，生成激发态氧能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。的形式释放出来。第8页/共54页 化学发光化学发光：是指伴随化学反应过程所产生的光的发是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。射现象。某些物质某些物质(发光剂发光剂)在化学反应时，在化学反应时，吸收吸收了反了反应过程中所产生的应过程中所产生的化学能化学能，使反应的产物分子或反，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。量，这一现象称为化学发光。第9页/共54页（1）与放免（RIA）比较化学发光避免了放射性核素的污染以及对操作人员的伤害，大大缩短了反应时间，同时兼具高灵敏度的优势。（2）与酶免（ELISA）比较灵敏度与可测范围远远高于酶免产品，兼具ELISA法简便的操作方法与较短的反应时间。第10页/共54页第二节 仪器检测原理一、ROCHE公司电化学发光系列免疫分析仪二、ABBOTT公司免疫分析仪第11页/共54页 电化学发光免疫分析（ECLIA）是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。电化学发光免疫分析仪是采用电化学发光技术，生物素放大技术，以顺磁性微粒为固相载体，用三联吡啶钌标记抗原或抗体，三丙胺(TPA)为电子供体，而设计的一种自动化分析仪器。电化学发光稳定、持续时间长，易于控制并可根据待测分子的大小设计成多种反应模式如夹心法、竞争法等。第12页/共54页仪器测定技术要点 抗原抗体结合 电化学发光反应 光信号检测 检测完毕 第13页/共54页ROCHE公司电化学发光免疫分析仪三联吡啶钌三联吡啶钌三联吡啶钌 三联吡啶钌 RU(bpy)32+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。第14页/共54页电化学发光剂反应原理电化学发光剂反应原理 第15页/共54页磁性微粒直径2.8m，表面的凸凹使包被面积放大。磁性微粒体积小，悬浮于反应体系中，形成均一稳定的液相，在磁场中易于分离。第16页/共54页在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体包被抗体包被抗体(抗原抗原)，用三联吡啶钌标记抗体，用三联吡啶钌标记抗体(抗原抗原)，在，在反应体系内待测标本与相应的抗原反应体系内待测标本与相应的抗原 (抗体抗体)发生免疫反发生免疫反应后，形成应后，形成磁性微粒包被抗体磁性微粒包被抗体-待测抗原待测抗原-三联吡啶钌三联吡啶钌标记抗体复合物标记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，同，这时将上述复合物吸入流动室，同时引人时引人TPATPA缓冲液缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和学发光反应，使三联吡啶钌和TPATPA在电极表面进行电子在电极表面进行电子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原的浓度转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原的浓度成正比。成正比。第17页/共54页标记磁颗粒在电场中发光工作示意图标记磁颗粒在电场中发光工作示意图第18页/共54页电化学发光免疫测定工作示意图电化学发光免疫测定工作示意图第19页/共54页二、ABBOTT公司免疫分析仪技术原理：1、微粒子酶免分析法（MEIA）2、荧光偏振免疫分析法（FPIA）3、粒子捕捉免疫分析法（ICIA）4、辐射能衰减分析法（REA）第20页/共54页1、微粒子酶免分析法（MEIA）以碱性磷酸酶标记抗原或抗体，以塑料微粒为固相载体包被抗体（或抗原），以4-4-甲基伞型酮磷酸盐（4-4-MUPMUP）作为酶促反应的荧光基质（底物），底物被酶水解后，脱磷酸根基团，形成4-4-甲基伞型酮(4-MU)(4-MU)，用360nm360nm激发光照射，发出450nm450nm的荧光。第21页/共54页4-甲基伞型酮磷酸盐（4-MUP）反应原理示意图 第22页/共54页仪器测定技术要点仪器测定技术要点 抗原抗体结合抗原抗体结合 洗涤、分离洗涤、分离 加入底物加入底物4-MUP 信号检测信号检测 第23页/共54页碱性磷酸酶标记的微粒子荧光免疫测定示意图第24页/共54页2、荧光偏振免疫分析法 FPIA是根据抗原、抗体竞争结合反应的原理，通过测定荧光偏振度定量检测待测抗原的浓度。FPIA兼具荧光分析的灵敏度和均相免疫法专一、快速的特点，故测定结果重现性好，在免疫测定法中引人注目。在临床检验、毒品分析、农药残留量分析、环境和食品监测等方面 第25页/共54页荧光偏振免疫测定(FPIA)，为一种均相荧光免疫测定方法，其利用荧光物质在溶液中被单一平面的偏振光照射后，可吸收光能而产生另一单一平面的偏振发射荧光，该荧光强度与荧光标记物质在溶液中旋转的速度与分子大小呈反比，常采用抗原-抗体竞争反应原理，适用于小分子半抗原（如药物浓度）的检测。第26页/共54页当光线通过偏振滤光片后，形成只有一个方向的电滋波，称之为偏振光。荧光物质经单一平面的偏振光（蓝色光，485nm）激发后，可吸收光能跃入激发态，在其恢复至基态时，释放能量并发射出单一平面的偏振荧光（绿色光，525nm550nm）。偏振荧光强度与荧光物质分子在液相中转动的速度呈反比，即分子大转动速度慢，荧光强度大，分子小转动速度快，荧光强度小。(一)原理第27页/共54页1.抗原抗体反应抗原抗体反应 2.偏振荧光强度测定偏振荧光强度测定（二）仪器测定技术要点第30页/共54页第三节 免疫分析临床应用可用于内分泌激素类、肿瘤标志物类、心肌标志物类、病毒标志物类、治疗性药物浓度、骨代谢指标和贫血类等方面的检测，是目前免疫化学应用最为广泛的新技术。第31页/共54页1、肿瘤标志物定义：由肿瘤组织产生的存在于肿瘤组织本身，或分泌至血液或其它体液，或因肿瘤组织刺激，由宿主细胞产生而含量明显高于正常参考值的一类物质。第32页/共54页一、肿瘤标志物1、肿瘤胚胎性抗原标志物：AFP、CEA第33页/共54页AFP简介AFP是甲种胎儿球蛋白，简称甲胎蛋白，AFP的合成部位主要是在人类胚胎的肝脏，是原发性肝癌最特异性的标志物。AFP阳性对早期肝癌的诊断具有重要价值，因此，40岁以上乙肝患者、每半年常规检查AFP。第34页/共54页CEA简介大肠癌组织可产生一种糖蛋白，作为抗原引起患者的免疫反应。此种抗原称为癌胚抗原（CEA），可广泛存在于内胚叶起源的消化系统癌，也存在于正常胚胎的消化管组织中，在正常人血清中也可有微量存在。癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计是一个较好的肿瘤标志物，但其特异性不强，灵敏度不高，对肿瘤早期诊断作用不明显。第35页/共54页2、糖类抗原标志物该类物质是肿瘤细胞表面的抗原物质，或肿瘤细胞所分泌的物质。（1）糖类高分子黏蛋白抗原。CA125、CA15-3。（2）血型类抗原。CA19-9、CA50第36页/共54页3、酶类标志物肿瘤状态时，机体的酶活力就会发生较大变化。PSA、NSE第37页/共54页PSA简介PSA是主要由前列腺上皮细胞产生的蛋白分解酶，正常情况下被分泌入前列腺液或精液中，以有活性的游离形式（f-PSA）存在，血清中的PSA主要以结合形式存在，通常以f-PSA与结合PSA的和即总PSA（t-PSA）代表血清总的PSA水平。血清PSA测定有助于前列腺癌早期诊断，监测治疗反应及判断预后。也可用于高危人群（50岁以上男性）前列腺癌的普查。第38页/共54页NSE简介神经元特异性烯醇化酶(NSE)：血清NSE是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶，神经内分泌肿瘤的特异性标志，如神经母细胞瘤、甲状腺髓质癌和小细胞肺癌(70%升高)，可用于鉴别诊断、病情监测、疗效评价和复发预报。正常人血清NSE水平12.5 U/mL。目前，NSE已作为小细胞肺癌重要标志物之一。第39页/共54页临床意义1小细胞肺癌患者NSE水平明显高于肺腺癌、肺鳞癌、大细胞肺癌等非小细胞肺癌（NSCLC），可用于鉴别诊断，监测小细胞肺癌放疗，化疗后的治疗效果，治疗有效时NSE浓度逐渐降低至正常水平，复发时血清NSE升高。用神经元特异性烯醇化酶监测小细胞肺癌的复发，比临床确定复发要早412周。2.神经元特异性烯醇化酶还可用于神经母细胞瘤和肾母细胞瘤的鉴别诊断，前者神经元特异性烯醇化酶异常增高而后者增高不明显。3神经内分泌细胞肿瘤，如嗜铬细胞瘤，胰岛细胞瘤，甲状腺髓样癌，黑色素瘤，视网膜母细胞瘤等患者的血清NSE也可增高。第40页/共54页4、激素类标志物当具有分泌激素功能的细胞癌变时，就会使分泌的激素发生异常。HCG、PRL第41页/共54页HCG介绍成熟女性因受精的卵子移动到子宫腔内着床后，形成胚胎，在发育成长为胎儿过程中，胎盘合体滋养层细胞产生大量的人绒毛膜促性腺激素（HCG），可通过孕妇血液循环而排泄到尿中。当妊娠12.5周时，血清和尿中的HCG水平即可迅速升高，第8孕周达到高峰，至孕期第4个月始降至中等水平，并一直维持到妊娠末期。第42页/共54页PRL介绍催乳素为腺垂体分泌的一种蛋白质激素。其主要生理功能是促进乳腺生长发育及乳汁形成，有抑制促性激素的作用。有随年龄增长而降低的趋势。测定催乳素水平对了解下丘脑及垂体的功能有重要的意义。第43页/共54页临床意义降低：见于全腺垂体功能减退症、单一性催乳素分泌缺乏症、卵巢切除术后、肾癌、未分化的支气管癌等。升高：见于下丘脑病变、垂体肿瘤、垂体柄肿瘤、原发性甲状腺功能减退症、支气管癌、多囊卵巢综合征、外源性催乳素分泌增多症、妊娠期及哺乳期、闭经期泌乳综合征等。第44页/共54页二、甲状腺激素T3、T4、fT3、fT4、TSHT3：三碘甲状原氨酸T4：甲状腺素TSH：促甲状腺素第45页/共54页疾病分类甲状腺疾病是多种原因造成的甲状腺功能增强、减弱，合成和分泌甲状腺激素过多、过少，所导致的一种常见内分泌疾病。主要包括：甲状腺机能亢进（俗称甲亢）、甲状腺功能减退（俗称甲减）、甲状腺炎、甲状腺肿、甲状腺瘤、甲状腺癌。第46页/共54页三、生殖激素LH、FSH、PRL、E2、P、TLH：黄体生成素FSH：卵泡刺激激素PRL：催乳素E2：雌二醇P：孕酮T：睾酮第47页/共54页激素名称分泌腺体或组织分类(化学本质)黄体生成素(LH)垂体前叶(腺垂体)糖蛋白卵泡刺激激素(FSH)垂体前叶(腺垂体)糖蛋白催乳素(PRL)垂体前叶(腺垂体)蛋白质雌二醇(E2)卵巢、胎盘类固醇孕酮(P)黄体、胎盘类固醇睾酮(T)睾丸类固醇生殖激素来源及化学本质 第48页/共54页促性腺激素促性腺激素是调节性腺发育，促进性激素生成和分泌的糖蛋白激素。如垂体前叶分泌的黄体生成激素（LH）和卵泡刺激激素（FSH），两者协同作用，刺激卵巢或睾丸中生殖细胞的发育及性激素的生成和分泌。第49页/共54页雌激素、孕激素雌激素主要合成于卵巢内卵泡的颗粒细胞，其中雌二醇的活性最强。孕酮是作用最强的孕激素，也称黄体酮，系卵巢的卵泡排卵后形成的黄体以及胎盘所分泌的激素。孕激素和雌激素在机体内的联合作用，保证了月经与妊娠过程的正常进行。第50页/共54页雄激素睾丸、卵巢及肾上腺均可分泌雄激素。睾酮是睾丸分泌的最重要的雄激素。雄激素作用于雄性副性器官如前列腺、精囊等，促进其生长并维持其功能，也是维持雄性副性征所不可少的激素。第51页/共54页性别相关疾病检测项目女性性早熟FSH，LH，E2，P青春期发育延迟FSH，LH，E2，P继发性闭经FSH，PRL，E2，P多毛症FSH，LH，PRL，E2，P，T原发性闭经FSH，LH，E2，P高催乳素血症PRL更年前期和绝经FSH，LH，E2，P男性性早熟FSH，LH，T青春期发育延迟FSH，LH，T性腺机能减退FSH，LH，PRL，T乳腺过度发育T，E2，PRL精子缺乏FSH，LH，T生殖激素检测项目及相关疾病 第52页/共54页第53页/共54页感谢您的观看！第54页/共54页