第十一章高效液相色谱法.pptx
11-1 概述高效液相色谱法与经典液相色谱法经典液相柱色谱装置高效液相色谱仪经典液相色谱经典液相色谱 HPLC固定相粒径固定相粒径流动相驱动方式流动相驱动方式流动相流速流动相流速150-200 m重力或低压泵重力或低压泵很慢很慢3-10 m高压泵高压泵快快(1-10mL/min)例：分离20种氨基酸柱长：170 cm柱径：0.9 cmF：30 mL/ht分离:20 h经典柱色谱HPLCt分离：1 h第1页/共44页11-2 基本理论一 色谱柱柱效的基本关系式二 分离度第2页/共44页三 速率方程溶质在液相流动相中的扩散系数，约为气相中扩散系数的万分之一第3页/共44页流动相流速对板高的影响1)小颗粒填料，填充均匀；2)选择较低的流动相流速；3)选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。修正的速率方程：提高柱效途径第4页/共44页11-2 高效液相色谱分离方法一 吸附色谱法1 分离原理Kad值越大，保留时间越长。第5页/共44页2 固定相硅胶强极性氧化铝弱极性活性炭非极性分子筛强极性高分子多孔微球(GDX)固体吸附剂第6页/共44页硅胶表面结构第7页/共44页硅胶表面结构经热处理发生的变化第8页/共44页3 流动相(洗脱剂)越大，表明流动相溶剂分子对吸附剂的亲和能力越强，则越易从吸附剂上将被吸附的溶质洗脱下来。溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能溶剂强度参数第9页/共44页硅胶固定相分离苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯流动相：干燥正庚烷1份水饱和的正庚烷2份干燥正庚烷水饱和的正庚烷改变流动相的组成可改变分离的选择性第10页/共44页4 应用具有不同官能团的化合物具有相同官能团，但数量不同的化合物异构体例：几种取代位置不同的硝基苯胺的分离。在硅胶吸附剂上的滞留顺序：邻位间位流动相极性正相分配色谱组分极性越大，保留时间越长反相分配色谱固定相极性流动相极性组分极性越小，保留时间越长第13页/共44页三 离子交换色谱法阳离子交换树脂阳离子交换阴离子交换1 分离原理第14页/共44页2 固定相阳离子：SO3H(强)CO2H(弱)阴离子：N+R3(强)NH2(弱)基质合成树脂纤维素硅胶离子交换剂第15页/共44页3 流动相水相缓冲液+有机改性剂调节选择性的主要参数盐种类及浓度pH值各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快第16页/共44页4 应用离子及可离解的化合物如氨基酸、核酸、蛋白质等第17页/共44页四 化学键合相色谱采用化学键合相的液相色谱固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种类繁多样品的分离。特点第18页/共44页1.键合固定相制备ODS(C18)键合相硅胶十八烷基氯硅烷非极性硅烷化反应使用pH范围：2-8第19页/共44页键合固定相类型疏水基团烷烃（C8和C18）、苯基等极性基团丙氨基氰乙基醚和醇等离子交换基团胺基、季铵盐磺酸、羧酸第20页/共44页2.键合相色谱法分类反相键合相色谱:常用固定相：C18分离对象非极性中等极性化合物常用流动相甲醇-水乙睛-水反相键合相色谱疏溶剂分离机制固定相极性 流动相极性离子性键合相色谱将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质表面上，就形成了离子性键合相色谱的固定相。其分离原理与离子交换色谱类同。第22页/共44页例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水出峰顺序：苯酚，甲苯出峰顺序：甲苯，苯酚十八烷基键合相二醇基键合相第23页/共44页保留时间：例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。没食子酸3,4-二羟基苯甲酸固定相:非极性;流动相:极性组分极性:3,4-二羟基苯甲酸没食子酸第24页/共44页五 尺寸排阻(凝胶)色谱法排阻色谱分离示意图相对分子质量差别大于10的化合物才可以分离1 分离原理第25页/共44页2 固定相是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体，其中含有大量液体（一般是水），柔软而富于弹性。凝胶3 流动相不采用改变流动相组成的方法控制分离度第26页/共44页分离方法的选择第27页/共44页11-3 高效液相色谱仪第28页/共44页高压泵流动相溶剂废液色谱柱进样口检测器第29页/共44页一 高压输液系统1 高压泵要求输出压力高平稳、脉冲小流量稳定可调耐腐蚀第30页/共44页2 梯度洗脱装置 低压梯度 高压梯度 通过改变流动相的组成来调整组分的k值，改变分离因子值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。梯度洗脱第31页/共44页等度洗脱与梯度洗脱第32页/共44页梯度洗脱的特点改善分离,加快分析速度；改善峰形,减少拖尾;可能引起基线漂移分配比变化范围宽的复杂样品应采取梯度洗脱方式分离第33页/共44页3 贮液瓶及流动相1)对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。2)适用于所选择的检测器。3)化学惰性好，以免破坏固定相。4)低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。5)纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。对流动相溶剂的一般要求第34页/共44页二 进样系统 准备状态 进样状态六通阀进样 装置自动进样器 第35页/共44页三 色谱柱内径：16 mm，柱长：530 cm；柱填料粒径：5m 分离柱第36页/共44页四 检测系统1 紫外吸收检测器(a)可变波长紫外检测器(b)二极管阵列检测器氘灯光栅流通池测量光电二极管参比光电二极管2 二极管阵列检测器第37页/共44页两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器(b)(a)第38页/共44页紫外检测器灵敏度高，精密度及线性范围较好，可用于梯度洗脱。流动相选择有限制。一些常用溶剂的紫外截止波长溶剂溶剂CS2氯仿氯仿 四氢四氢呋喃呋喃苯苯乙睛乙睛甲醇甲醇水水紫外截紫外截止波长止波长/nm380245212210 190205187第39页/共44页3 荧光检测器灵敏度高，选择性好，可用于梯度洗脱。第40页/共44页4 示差折光检测器利用组分与流动相的折射率之差进行检测。通用性好，灵敏度较低，不适用于梯度洗脱。第41页/共44页5 化学发光检测器第42页/共44页6 电化学检测器电导检测器安培检测器7 质谱检测器第43页/共44页感谢您的观看！第44页/共44页
