6流式细胞术的质量控制和影响因素1853.pptx

流式细胞术的质量控流式细胞术的质量控制和影响因素制和影响因素一、标本的采集和固定方法的质量控制一、标本的采集和固定方法的质量控制 标本采集是十分重要的环节，在标本的采标本采集是十分重要的环节，在标本的采集过程，需注意：集过程，需注意：手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时，要避免出血坏死组织。时，要避免出血坏死组织。标本采集后要及时固定或深低温保存，以标本采集后要及时固定或深低温保存，以免组织发生自溶，免组织发生自溶，DNA降解，而造成测试降解，而造成测试结果的误差。结果的误差。固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度。固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度。例如例如70%的乙醇固定比的乙醇固定比75%以上的以上的浓度固定效果好，因为高浓度的乙醇常浓度固定效果好，因为高浓度的乙醇常造成细胞表面快速形成一个蛋白膜，致造成细胞表面快速形成一个蛋白膜，致使细胞内的物质固定不良。使细胞内的物质固定不良。有作者分析研究了自溶对有作者分析研究了自溶对DNA测定测定的影响，发现自溶的组织细胞常出现假的影响，发现自溶的组织细胞常出现假性异倍体，且不固定的组织细胞随时间性异倍体，且不固定的组织细胞随时间的延长，的延长，DNA含量呈梯度降低含量呈梯度降低 根据检测的目的，选择什么类型的根据检测的目的，选择什么类型的固定剂，对流式检测质量也有显著的影固定剂，对流式检测质量也有显著的影响。响。例如细胞例如细胞DNA的分析，使用醇类固的分析，使用醇类固定剂较好而不选择醛类固定剂，醛类固定剂较好而不选择醛类固定剂，醛类固定剂明显影响细胞定剂明显影响细胞DNA荧光发射强度。荧光发射强度。实验证明，醛类固定剂对插入性荧光染实验证明，醛类固定剂对插入性荧光染料与核酸的结合有很强的干扰作用，其料与核酸的结合有很强的干扰作用，其荧光强度仅相当于新鲜组织荧光强度的荧光强度仅相当于新鲜组织荧光强度的50-70%左右。左右。如果作流式免疫研究工作，采用新如果作流式免疫研究工作，采用新鲜组织是最好的选择。在不能及时检测鲜组织是最好的选择。在不能及时检测又没有低温保存条件时，要根据所测物又没有低温保存条件时，要根据所测物质在细胞内还是在细胞膜表面，在膜表质在细胞内还是在细胞膜表面，在膜表面的抗原物质，以醛类固定剂为宜，尽面的抗原物质，以醛类固定剂为宜，尽管醛类固定剂产生的非特异性荧光较强，管醛类固定剂产生的非特异性荧光较强，但不宜采用醇类固定剂，因醇类固定剂但不宜采用醇类固定剂，因醇类固定剂可使细胞表面的糖蛋白、脂蛋白脱落丢可使细胞表面的糖蛋白、脂蛋白脱落丢失，失去标记的位点。失，失去标记的位点。如所测抗原物质在细胞内，可以使用如所测抗原物质在细胞内，可以使用醇类固定剂，这种固定方法简便易行，无醇类固定剂，这种固定方法简便易行，无需特殊低温冷冻条件，在一般冰箱需特殊低温冷冻条件，在一般冰箱(0-4)放置即可，能很好的保持细胞形态和放置即可，能很好的保持细胞形态和生物化学成分不发生变性。生物化学成分不发生变性。二、单细胞悬液制备的质量控制二、单细胞悬液制备的质量控制 人体的末梢血液和骨髓细胞及淋巴人体的末梢血液和骨髓细胞及淋巴组织是人体组织中缺乏细胞间连结装置组织是人体组织中缺乏细胞间连结装置的组织，尤其是血和骨髓细胞是天然的的组织，尤其是血和骨髓细胞是天然的单分散细胞材料，其中的细胞成分在生单分散细胞材料，其中的细胞成分在生理状态下呈单分散状态，它是流式分析理状态下呈单分散状态，它是流式分析最合适的样品来源。最合适的样品来源。二、单细胞悬液制备的质量控制二、单细胞悬液制备的质量控制 全血中含有多种有形成分，流式细全血中含有多种有形成分，流式细胞检测是以某一群细胞为检测对象，因胞检测是以某一群细胞为检测对象，因此在检测前须将所测的某群细胞成分分此在检测前须将所测的某群细胞成分分离出来。例如，以淋巴细胞离出来。例如，以淋巴细胞DNA定量分定量分析为例，就须把淋巴细胞分离出来，而析为例，就须把淋巴细胞分离出来，而将其他有核细胞或红细胞去除，对于血将其他有核细胞或红细胞去除，对于血小板的分析样品制备过程中须防止过高小板的分析样品制备过程中须防止过高离心速度造成血小板膜的损伤，出现血离心速度造成血小板膜的损伤，出现血小板凝集小板凝集 新鲜实体组织单细胞样品的制备，新鲜实体组织单细胞样品的制备，实体组织是流式分析工作的主要材料实体组织是流式分析工作的主要材料来源，但对其分散单细胞样品的技术来源，但对其分散单细胞样品的技术和方法，仍存在着很多问题，仍需大和方法，仍存在着很多问题，仍需大量的探索工作。就目前，国内外对实量的探索工作。就目前，国内外对实体组织分散单细胞还没有找到一个适体组织分散单细胞还没有找到一个适用的又通用方法，甚至同样组织，用用的又通用方法，甚至同样组织，用于不同的实验目的，就需要不同的方于不同的实验目的，就需要不同的方法处理，或者每一种组织就是一个单法处理，或者每一种组织就是一个单独的问题独的问题 因此必须根据实际情况，去选择合因此必须根据实际情况，去选择合适有效的单分散方法，选用的方法必适有效的单分散方法，选用的方法必须达到细胞产量高，细胞损伤小的目须达到细胞产量高，细胞损伤小的目标，但实际工作中达到这个目标是困标，但实际工作中达到这个目标是困难的，多年来对于实体组织的分散解难的，多年来对于实体组织的分散解聚多采用酶学法，化学法、机械物理聚多采用酶学法，化学法、机械物理方法以及低渗脱核方法等，根据各种方法以及低渗脱核方法等，根据各种组织的特点，以及实验目的的不同，组织的特点，以及实验目的的不同，可选择不同的方法。可选择不同的方法。选则酶学方法时，应注意选择酶类型选则酶学方法时，应注意选择酶类型的问题，含有大量结缔组织的，选择的问题，含有大量结缔组织的，选择胶原酶好，不宜选择胃蛋白酶或胰酶。胶原酶好，不宜选择胃蛋白酶或胰酶。并要注意酶的活性条件和影响因素，并要注意酶的活性条件和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间，要注意酶的溶剂，消化时间，pH值，值，浓度等对酶活性的影响浓度等对酶活性的影响酶学方法分散组织都有一定的应用限酶学方法分散组织都有一定的应用限制，特别用于流式免疫荧光实验时，制，特别用于流式免疫荧光实验时，酶处理可能改变或丢失膜的抗原成分，酶处理可能改变或丢失膜的抗原成分，从而影响分析结果，由于酶学方法分从而影响分析结果，由于酶学方法分散下来的细胞产量低，用组织较多，散下来的细胞产量低，用组织较多，还要注意酶的纯度，活性单位，以及还要注意酶的纯度，活性单位，以及生产厂家对酶的污染生产厂家对酶的污染化学方法，往往单独应用分散组织效化学方法，往往单独应用分散组织效果不理想，应与酶学方法综合使用，分果不理想，应与酶学方法综合使用，分散效果更佳。散效果更佳。机械方法，常采用剪碎，网搓研磨，机械方法，常采用剪碎，网搓研磨，细针抽吸等，对细胞损伤大，产生的细细针抽吸等，对细胞损伤大，产生的细胞碎片多，细胞团块多，在使用机械法胞碎片多，细胞团块多，在使用机械法时，要给于组织适当的压力，这种适当时，要给于组织适当的压力，这种适当的压力需要有较多的制样实践经验技术的压力需要有较多的制样实践经验技术人员来操作。人员来操作。低渗方法，其溶液是一种低渗液体，低渗方法，其溶液是一种低渗液体，造成细胞膜的破坏，使细胞核自行释放造成细胞膜的破坏，使细胞核自行释放出来，是一个裸核悬液样品，本方法简出来，是一个裸核悬液样品，本方法简便，但要避免脱核时间过长，造成核膨便，但要避免脱核时间过长，造成核膨胀碎裂。胀碎裂。以上几种方法是目前对实体组织解以上几种方法是目前对实体组织解聚常用的方法，往往不是单用，常常是聚常用的方法，往往不是单用，常常是一种或二种方法的结合使用，总的来说，一种或二种方法的结合使用，总的来说，对实体组织分散为单细胞还存在很多困对实体组织分散为单细胞还存在很多困难，因此还需要深入探讨流式样品的制难，因此还需要深入探讨流式样品的制备技术，制备出完整细胞产量高，细胞备技术，制备出完整细胞产量高，细胞损伤小的合格悬液损伤小的合格悬液,获得更好的流式检获得更好的流式检测结果。测结果。三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制 石蜡包埋组织标本的材料选择，应经石蜡包埋组织标本的材料选择，应经病理医师仔细检查，选取无自溶，坏死的病理医师仔细检查，选取无自溶，坏死的组织对肿瘤组织标本，选取含肿瘤组织细组织对肿瘤组织标本，选取含肿瘤组织细胞丰富的区域，且经病理形态或细胞学核胞丰富的区域，且经病理形态或细胞学核实病理诊断实病理诊断三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制 切取适当厚度的石蜡组织片，大量研切取适当厚度的石蜡组织片，大量研究证明，切取究证明，切取40-50m厚度的切片是适宜厚度的切片是适宜的，过厚的组织片消化费时，消化下来的的，过厚的组织片消化费时，消化下来的细胞数少，过薄的切片可产生大量的细胞细胞数少，过薄的切片可产生大量的细胞碎片，影响检测结果，使肿瘤异倍体的检碎片，影响检测结果，使肿瘤异倍体的检出率减少，我们研究了石蜡切片不同厚度出率减少，我们研究了石蜡切片不同厚度(5,10,20,30,40,50m)对流式分析对流式分析DNA的影响，发现较薄的切片造成碎片较多的影响，发现较薄的切片造成碎片较多,噪音增加噪音增加,组方图的基线提高组方图的基线提高,影响倍体分影响倍体分析的精度析的精度 在组织脱蜡的过程中，一定将蜡脱在组织脱蜡的过程中，一定将蜡脱净，残留的石蜡可影响酶的消化活性，净，残留的石蜡可影响酶的消化活性，检查是否将蜡脱净的方法是弃去二甲苯，检查是否将蜡脱净的方法是弃去二甲苯，加入加入100%乙醇，如果无絮状物浮起，乙醇，如果无絮状物浮起，表示蜡已脱净表示蜡已脱净 梯度酒精梯度酒精(100%70%50%)水化要水化要充分充分,使组织还原到与新鲜组织相似的使组织还原到与新鲜组织相似的状态。状态。消化酶液要掌握适当的浓度、消化酶液要掌握适当的浓度、pH值、温度等，不造成酶的活性降低为宜，值、温度等，不造成酶的活性降低为宜，消化时间很重要，时间短细胞消化不下消化时间很重要，时间短细胞消化不下来，时间长，消化下来的细胞又被破坏，来，时间长，消化下来的细胞又被破坏，在制备石蜡包埋单细胞时，常规使用在制备石蜡包埋单细胞时，常规使用0.5%胃蛋白酶（胃蛋白酶（PH 1.5）石蜡包埋组织的单细胞制备方法的石蜡包埋组织的单细胞制备方法的建立，使流式细胞术在医学研究中得到建立，使流式细胞术在医学研究中得到更广泛的应用，但仍存在一些问题有待更广泛的应用，但仍存在一些问题有待进一步解决，主要存在问题如下：进一步解决，主要存在问题如下：样样品品中中的的碎碎片片较较多多，所所测测得得的的DNA组组方方图图质质量量不不及及新新鲜鲜组组织织好好，组组方方图图的的峰峰位较宽，位较宽，CV值偏大。值偏大。异异倍倍体体率率减减少少，由由于于组组方方图图细细胞胞峰峰CV值值较较大大，一一些些近近于于二二倍倍体体的的DNA异异倍倍体峰被掩盖体峰被掩盖 石蜡包埋组织的单细胞制备方法的石蜡包埋组织的单细胞制备方法的建立，使流式细胞术在医学研究中得到建立，使流式细胞术在医学研究中得到更广泛的应用，但仍存在一些问题有待更广泛的应用，但仍存在一些问题有待进一步解决，主要存在问题如下：进一步解决，主要存在问题如下：S期期细细胞胞百百分分比比不不如如新新鲜鲜组组织织的的S期期计计算算精精确确，S期期细细胞胞的的计计算算偏偏高高，这这仍仍然然与与CV值较大有关值较大有关 DNA二倍体标准不稳定二倍体标准不稳定 Schutter等发现用新鲜正常组织的二等发现用新鲜正常组织的二倍体细胞或者用其他生物细胞倍体细胞或者用其他生物细胞 DNA含量含量(例如，鸡红细胞，鳟鱼血细胞等例如，鸡红细胞，鳟鱼血细胞等)作为作为石蜡包埋组织细胞石蜡包埋组织细胞DNA含量的标准不适含量的标准不适用，石蜡包埋组织比新鲜组织细胞用，石蜡包埋组织比新鲜组织细胞DNA荧光强度低，且样品间的荧光强度不稳荧光强度低，且样品间的荧光强度不稳定定 DNA二倍体标准不稳定二倍体标准不稳定 对存档中的石蜡包埋组织材料，可对存档中的石蜡包埋组织材料，可以采用正常组织石蜡包埋标本，作为一以采用正常组织石蜡包埋标本，作为一个外参的二倍体标准，但要求采用的外个外参的二倍体标准，但要求采用的外参二倍体样品和肿瘤样品中加入内标准参二倍体样品和肿瘤样品中加入内标准样品样品(例如鸡血细胞等例如鸡血细胞等)四、脱落细胞样品的采集四、脱落细胞样品的采集 脱落细胞样品的采集要保证足够的脱落细胞样品的采集要保证足够的细胞数，在临床实际工作中，可以收集细胞数，在临床实际工作中，可以收集到大量自然脱落的细胞标本，这些细胞到大量自然脱落的细胞标本，这些细胞标本经简单处理后，即可得到较好的单标本经简单处理后，即可得到较好的单分散细胞，例如胸腹水，内镜刷检细胞，分散细胞，例如胸腹水，内镜刷检细胞，膀脱冲洗液等膀脱冲洗液等四、脱落细胞样品的采集四、脱落细胞样品的采集 这些材料得到的流式结果，要谨慎这些材料得到的流式结果，要谨慎的分析解释结果的生物学意义。因这些的分析解释结果的生物学意义。因这些材料获得的结果常出现假阴性或假阳性。材料获得的结果常出现假阴性或假阳性。原因是其中的白细胞常有变性，且样品原因是其中的白细胞常有变性，且样品细胞数量少。制备出一个合格的单细胞细胞数量少。制备出一个合格的单细胞样品，其细胞数要求在样品，其细胞数要求在1106/ml，其杂其杂质碎片团块应小于质碎片团块应小于2%以下，否则应放以下，否则应放弃检测，对肿瘤细胞弃检测，对肿瘤细胞DNA异倍体的分异倍体的分析样品中，至少应有析样品中，至少应有20%的肿瘤细胞存的肿瘤细胞存在，在，(因占主峰因占主峰1/5以上的异倍体峰才可以上的异倍体峰才可确认为异倍体确认为异倍体)五、细胞悬液荧光染色的质量控制五、细胞悬液荧光染色的质量控制 单细胞悬液样品荧光染色对流式定量分单细胞悬液样品荧光染色对流式定量分析的精度很重要。目前常使用的荧光染料析的精度很重要。目前常使用的荧光染料有有EB、PI、DAPI、AO、FITC、PE等，等，对细胞染色时应特别注意染料的特性及量对细胞染色时应特别注意染料的特性及量效关系，定量细胞学荧光染色易受到多种效关系，定量细胞学荧光染色易受到多种因素的影响，以致造成不正确的测定结果，因素的影响，以致造成不正确的测定结果，了解荧光染色的影响因素，将有助于在荧了解荧光染色的影响因素，将有助于在荧光定量细胞学分析中，尽可能避免测量误光定量细胞学分析中，尽可能避免测量误差，并进行有效的校正措施，如下的一些差，并进行有效的校正措施，如下的一些常见影响因素需特别注意。常见影响因素需特别注意。温度对荧光染色强度的影响：温度对荧光染色强度的影响：在一般情况下，环境温度的升高对荧在一般情况下，环境温度的升高对荧光染色有明显的影响。温度升高可造成溶光染色有明显的影响。温度升高可造成溶液粘滞性增加，溶剂和荧光染料分子的动液粘滞性增加，溶剂和荧光染料分子的动力增大，这就使荧光分子和其他分子之间力增大，这就使荧光分子和其他分子之间的相互碰撞几率增加，使荧光猝灭的可能的相互碰撞几率增加，使荧光猝灭的可能性增加。因此，影响了荧光分子发光量子性增加。因此，影响了荧光分子发光量子产额产额 温度对荧光染色强度的影响：温度对荧光染色强度的影响：温度升高时，荧光减弱，荧光减弱的温度升高时，荧光减弱，荧光减弱的百分比称温度系数。就一般荧光物质而言，百分比称温度系数。就一般荧光物质而言，温度系数大约为温度系数大约为1%，如果温度在，如果温度在20时，时，一般荧光染料即出现温度猝灭效应，随温一般荧光染料即出现温度猝灭效应，随温度的升高，荧光猝灭作用越强，以致造成度的升高，荧光猝灭作用越强，以致造成完全猝灭，温度在完全猝灭，温度在20以下，荧光分子发以下，荧光分子发光量子产额的变化不明显，基本上保持恒光量子产额的变化不明显，基本上保持恒量。因此在荧光测定时要保持染色后的样量。因此在荧光测定时要保持染色后的样品在适当低温环境下运行，尽可能减少样品在适当低温环境下运行，尽可能减少样品的照射时间，有条件时应使样品观察室品的照射时间，有条件时应使样品观察室做到恒温装置，会得到更好的荧光定量结做到恒温装置，会得到更好的荧光定量结果果2.荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直接比例关系：接比例关系：在溶液较稀时，荧光强度与浓度成在溶液较稀时，荧光强度与浓度成正比关系，随浓度加大，荧光强度也增正比关系，随浓度加大，荧光强度也增大，当荧光染料达到一定浓度时，如继大，当荧光染料达到一定浓度时，如继续增加浓度不仅不会使荧光强度有相应续增加浓度不仅不会使荧光强度有相应的增加，反而使荧光强度减低，这种因的增加，反而使荧光强度减低，这种因染料浓度增大使荧光量子的产额下降的染料浓度增大使荧光量子的产额下降的现象称为浓度猝灭现象现象称为浓度猝灭现象2.荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直接比例关系：接比例关系：因此在研究浓度与荧光强度关系时，因此在研究浓度与荧光强度关系时，必须检查所得的荧光值是曲线高峰前的必须检查所得的荧光值是曲线高峰前的浓度，还是曲线高峰后的浓度浓度，还是曲线高峰后的浓度(方法是减方法是减少溶液浓度，如荧光减弱则为高峰前浓少溶液浓度，如荧光减弱则为高峰前浓度度)。鉴于荧光染料浓度对荧光强度的影。鉴于荧光染料浓度对荧光强度的影响之大，因此要选择最合适的浓度，对响之大，因此要选择最合适的浓度，对于荧光定量检测技术是极其重要的于荧光定量检测技术是极其重要的 3.pH 值对荧光发射强度的影响：值对荧光发射强度的影响：荧光分子在溶剂中处于离子化状态，荧光分子在溶剂中处于离子化状态，因此，溶液中的氢离子浓度对荧光强度因此，溶液中的氢离子浓度对荧光强度影响极大，荧光分子发光的最有利条件影响极大，荧光分子发光的最有利条件是其在溶剂中呈离子化或极化状态，从是其在溶剂中呈离子化或极化状态，从而通过染料分子本身所具有的斥力作用而通过染料分子本身所具有的斥力作用尽可能避免分子之间的相互碰撞作用，尽可能避免分子之间的相互碰撞作用，每一种荧光分子都有自己合适的每一种荧光分子都有自己合适的pH值值4.其他一些影响荧光强度的因素：其他一些影响荧光强度的因素：像醛类固定剂像醛类固定剂(戊二醛，甲醛戊二醛，甲醛),可以可以干扰荧光染料与核酸分子的结合干扰荧光染料与核酸分子的结合,像溶剂像溶剂中的一些不发光的物质中的一些不发光的物质(如溴化物、碘化如溴化物、碘化物、氨基苯、硝基苯、铁、银离子等物、氨基苯、硝基苯、铁、银离子等)均均可造成荧光的猝灭现象可造成荧光的猝灭现象 六六、流式细胞分析资料处理的质量控制、流式细胞分析资料处理的质量控制 样样品品中中的的碎碎片片杂杂质质和和团团块块过过多多，所所测测细细胞胞数数仅仅占占20%以以下下，组组方方图图的的基基线线抬抬高高，尤尤其其不不能能进进行行细细胞胞周周期期分分析析，尽尽管管目目前前有有计计算算机机的的硬硬件件删删除除或或软软件件补补偿偿来来消消除除碎碎片片和和团团块块的的影影响响，也也应应放放弃弃不不作分析处理作分析处理六六、流式细胞分析资料处理的质量控制、流式细胞分析资料处理的质量控制 一个样品细胞数检测应在一个样品细胞数检测应在1万个细胞万个细胞(不包括碎片、杂质、团块不包括碎片、杂质、团块)。如果单独。如果单独作作DNA倍体分析而不作细胞周期的处理，倍体分析而不作细胞周期的处理，小于小于1万个细胞也可以，但异倍体细胞占万个细胞也可以，但异倍体细胞占总细胞数的总细胞数的10%以下时，不可盲目下结以下时，不可盲目下结论，至少异倍体细胞占总细胞的论，至少异倍体细胞占总细胞的20%以以上，可以确定异倍体的存在上，可以确定异倍体的存在 正常二倍体细胞组方图的正常二倍体细胞组方图的CV值大于值大于8%以上，应放弃细胞周期的分析，但肿以上，应放弃细胞周期的分析，但肿瘤细胞瘤细胞CV值大于值大于8%，这与肿瘤细胞，这与肿瘤细胞DNA异质性增大有关。异质性增大有关。对于一个正常人体的二倍体细胞群，对于一个正常人体的二倍体细胞群，G0/1期细胞占期细胞占85-90%左右，左右，S+G2M细胞细胞占占10-15%，但在同一个体的不同正常组，但在同一个体的不同正常组织，细胞织，细胞DNA含量也有漂移，在不同个含量也有漂移，在不同个体的同源组织也会出现体的同源组织也会出现10%的漂移的漂移 S期细胞可作为评价肿瘤的增殖活性期细胞可作为评价肿瘤的增殖活性指标。大量报道认为，指标。大量报道认为，S期有明显的临床期有明显的临床预后意义，但预后意义，但S期计算方面容易产生误差期计算方面容易产生误差,而造成评价而造成评价S期在肿瘤生物学行为不确切期在肿瘤生物学行为不确切性性 对于对于S期细胞计算较准确的方法，就期细胞计算较准确的方法，就是分别作两次样品的检测，加入是分别作两次样品的检测，加入DNA倍体倍体标准样品检测一次，不加二倍体标准的样标准样品检测一次，不加二倍体标准的样品检测一次，品检测一次，G0/1峰应是一个正态分布峰应是一个正态分布(或称高斯分布或称高斯分布)。但实际测量过程。但实际测量过程,有部有部分组方图有时会出现分组方图有时会出现G0/1峰的右偏峰或脱峰的右偏峰或脱尾尾(Teiling)现象，或出现一个右或左侧现象，或出现一个右或左侧的峭峰的峭峰(Kurtosis)，造成，造成S期细胞计算的期细胞计算的不准确性。对于这样峰位，除了可用计算不准确性。对于这样峰位，除了可用计算机软件加以消除外，可放弃机软件加以消除外，可放弃S期的计算期的计算 DNA倍体标准的质量控制：倍体标准的质量控制：DNA倍体的标准是根据正常二倍体细胞倍体的标准是根据正常二倍体细胞DNA含量的分布范围而确定的，对于二含量的分布范围而确定的，对于二倍体的标准的选择，应遵照如下原则：倍体的标准的选择，应遵照如下原则：采用同个体同源正常组织。采用同个体同源正常组织。同种固定方法。同种固定方法。相同的样品处理方法。相同的样品处理方法。同样的染色方法同样的染色方法,同步染色。同步染色。同样的仪器检测条件。同样的仪器检测条件。正常二倍体细胞作为内标准。正常二倍体细胞作为内标准。在不具备同个体，同源组织的情况在不具备同个体，同源组织的情况下，可以使用鸡红细胞，或其他生物下，可以使用鸡红细胞，或其他生物细胞为内参标准，作为计算倍体的标细胞为内参标准，作为计算倍体的标准细胞，但这种标准细胞的使用，仅准细胞，但这种标准细胞的使用，仅限于新鲜组织倍体的判定，对于石蜡限于新鲜组织倍体的判定，对于石蜡包埋组织倍体标准，解决的办法是将包埋组织倍体标准，解决的办法是将正常组织与肿瘤组织同时包埋于一个正常组织与肿瘤组织同时包埋于一个石蜡组织块中，这样正常组织作为一石蜡组织块中，这样正常组织作为一个二倍体内标准个二倍体内标准,能减少能减少DNA倍体分析倍体分析的误差。的误差。假性异倍体的识别与排除：假性异倍体的识别与排除：假性异倍体多出现在近二倍体肿瘤假性异倍体多出现在近二倍体肿瘤(Near diploid)或或DNA指数小于指数小于1.30以下的以下的异倍体肿瘤。异倍体肿瘤。假性异倍体出现的原因主要有组织自假性异倍体出现的原因主要有组织自溶造成或在组织固定前或期间，细胞溶造成或在组织固定前或期间，细胞DNA出现变性出现变性(而非降解阶段而非降解阶段)，染色质结，染色质结构发生变性，与荧光染料结合增加或减少，构发生变性，与荧光染料结合增加或减少，更多出现在异倍体细胞数仅占总测细胞数更多出现在异倍体细胞数仅占总测细胞数的的5-10%的情况下的情况下 对于二倍体为主峰的右侧出现的异对于二倍体为主峰的右侧出现的异倍体峰，用倍体峰，用0.5%胃蛋白酶或胃蛋白酶或1%的的DNA酶酶消化消化3-5分钟，如果再测仍然出现异倍体分钟，如果再测仍然出现异倍体峰可为真性异倍体，如果异倍体峰消失，峰可为真性异倍体，如果异倍体峰消失，则认为是假性异倍体。则认为是假性异倍体。对于二倍体峰左侧出现的异倍体峰对于二倍体峰左侧出现的异倍体峰(称亚二倍体称亚二倍体)要首先排除自溶的原因。要首先排除自溶的原因。八、流式免疫学检测的质量控制八、流式免疫学检测的质量控制 在免疫荧光染色过程中常出现一些人为在免疫荧光染色过程中常出现一些人为非特异性荧光，造成本底荧光过高，出非特异性荧光，造成本底荧光过高，出现假阳性结果，常见的原因有：现假阳性结果，常见的原因有：降低抗体非特异性结合的措施不够。降低抗体非特异性结合的措施不够。洗涤不充分。洗涤不充分。细胞重叠和凝集团块。细胞重叠和凝集团块。细胞碎片过多贴附在细胞上。细胞碎片过多贴附在细胞上。解决这些影响因素的方法：解决这些影响因素的方法：1 使动物血清蛋白等封闭非特异性结合位使动物血清蛋白等封闭非特异性结合位点，荧光抗体染色后充分洗涤。点，荧光抗体染色后充分洗涤。2 减少重叠细胞和碎片。减少重叠细胞和碎片。3设对照样品，与抗体来源的同型对照和设对照样品，与抗体来源的同型对照和荧光抗体的本底对照荧光抗体的本底对照 对于需要保存不能马上进行定量分对于需要保存不能马上进行定量分析的标本，在免疫荧光染色后，不固定析的标本，在免疫荧光染色后，不固定可以在可以在4放置放置48小时不出现荧光强度小时不出现荧光强度或标记阳性率降低。时间更长时需要进或标记阳性率降低。时间更长时需要进行固定保存，但固定方法要求方法步骤行固定保存，但固定方法要求方法步骤简单，固定液单一，不明显影响细胞膜简单，固定液单一，不明显影响细胞膜表面抗原的免疫荧光标记，细胞体积和表面抗原的免疫荧光标记，细胞体积和荧光强度等，可保存较长时间荧光强度等，可保存较长时间 较理想的固定剂为较理想的固定剂为1-4%的多聚甲的多聚甲醒缓冲液或醒缓冲液或4%的甲醒缓冲液的甲醒缓冲液(pH7.2)，实验证明，固定实验证明，固定1-2个月，仍可得到较个月，仍可得到较好定量分析结果，对细胞膜内的抗原物好定量分析结果，对细胞膜内的抗原物质的免疫荧光检测，可用质的免疫荧光检测，可用70%的冷乙醇的冷乙醇(4)固定可获得满意的检测结果固定可获得满意的检测结果 谢谢观看/欢迎下载BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES.BY FAITH I BY FAITH