食品中大肠菌群的测定.pptx

1 1、了解大肠菌群的定义及食品中大肠菌群测定在食品卫生检验中的意义。了解大肠菌群的定义及食品中大肠菌群测定在食品卫生检验中的意义。2 2、练习并掌握大肠菌群的检验方法、练习并掌握大肠菌群的检验方法。一、目的一、目的第1页/共62页二、原理二、原理1、大肠菌群大肠菌群系指一群在大肠菌群系指一群在3737、2424小时能发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性小时能发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。第2页/共62页 主要由肠杆菌科中主要由肠杆菌科中埃希氏菌属埃希氏菌属、肠杆菌属肠杆菌属、克雷伯氏菌属克雷伯氏菌属的一部分及的一部分及沙门氏沙门氏属属的的亚属细菌组成。亚属细菌组成。第3页/共62页该菌主要来源于该菌主要来源于人畜粪便人畜粪便，故以此作为粪便污，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。品是否有肠道致病菌污染的可能性。食品中大肠菌群数系以每食品中大肠菌群数系以每1g1g（或（或mLmL）检样内）检样内大肠大肠菌群近似可能数菌群近似可能数MPNMPN（themostprobablenumber-themostprobablenumber-简称简称MPNMPN）表示）表示2 2 2 2、测定的意义、测定的意义、测定的意义、测定的意义第4页/共62页3 3 3 3、大肠杆菌的生物学特性、大肠杆菌的生物学特性、大肠杆菌的生物学特性、大肠杆菌的生物学特性基本形态基本形态此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.5-0.8m*1.0-3.0m0.8m*1.0-3.0m，多单独存在或成双，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约但不呈长链排列。约50%50%的菌株有周生鞭的菌株有周生鞭毛，但多数只有毛，但多数只有1-41-4根，一般不超过根，一般不超过1010根，根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。染料着色良好，革兰氏染色阴性。第5页/共62页 在普通营养琼脂上有在普通营养琼脂上有3 3中菌落形中菌落形态：态：1 1）光滑型：菌落边缘整齐，）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散；中易分散；2 2）粗糙型：菌落扁平、干）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易涩、边缘不整齐，易 在生理盐水中自凝；在生理盐水中自凝；3 3）黏液型：常为含有荚膜）黏液型：常为含有荚膜的菌株。的菌株。培养特性：大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为3737，在在在在42-44 42-44 条件下仍能生长，生长温度范围条件下仍能生长，生长温度范围条件下仍能生长，生长温度范围条件下仍能生长，生长温度范围15-46 15-46。第6页/共62页三三、材料、材料1、食品样品 乳制品乳制品第7页/共62页除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：他设备和材料如下：恒温培养箱、恒温水浴箱、恒温培养箱、恒温水浴箱、振荡器、振荡器、无菌吸管无菌吸管或微量移液器及吸头、或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶无菌锥形瓶、无菌培养皿无菌培养皿、菌落计数器菌落计数器等。等。3 3 3 3、仪器设备仪器设备仪器设备仪器设备第8页/共62页月桂基硫酸盐胰蛋白胨（月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LSTLST）肉汤）肉汤、煌绿乳煌绿乳糖胆盐（糖胆盐（BGLBBGLB）肉汤、）肉汤、结晶紫中性红胆盐琼结晶紫中性红胆盐琼脂（脂（VRBA)VRBA)、无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液、1mol/L1mol/L氢氧化钠（氢氧化钠（NaOH)NaOH)、1mol/L1mol/L盐酸盐酸（HCI)HCI)。4 4 4 4、培养基和试剂培养基和试剂培养基和试剂培养基和试剂第9页/共62页 第一法第一法 大肠菌群大肠菌群MPNMPN计数法。计数法。第二法第二法 大肠菌群平板计数法。大肠菌群平板计数法。四、四、检验方法检验方法第10页/共62页1010倍系列稀释倍系列稀释倍系列稀释倍系列稀释 选择合适稀释度接种选择合适稀释度接种选择合适稀释度接种选择合适稀释度接种LST LST 肉汤管肉汤管肉汤管肉汤管 36 3611.48h2h.48h2h产气产气不产气不产气不产气不产气25 g 25 g 检样检样检样检样-225 mL-225 mL 稀释液稀释液稀释液稀释液大肠菌群阴性大肠菌群阴性大肠菌群阴性大肠菌群阴性BGLBBGLB肉汤肉汤肉汤肉汤(361)(361)48h2h48h2h不产气不产气不产气不产气大肠菌群阳性大肠菌群阳性大肠菌群阳性大肠菌群阳性大肠菌群阴性大肠菌群阴性大肠菌群阴性大肠菌群阴性产气产气产气产气报告报告报告报告大大肠肠菌菌群群MPN检检验验流流程程查查查查MPNMPN表表表表第11页/共62页1、样品的稀释（1 1）固体和半固体样品固体和半固体样品 称取称取25g25g样品，放入盛有样品，放入盛有225ml225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，内，88000r/min-10000r/min-10000r/min000r/min均质均质1min-2min1min-2min，或放入盛有，或放入盛有225ml225ml磷磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-21min-2minmin，制成，制成1:101:10的样品匀液。的样品匀液。第一法第一法 大肠菌群大肠菌群MPNMPN计数法计数法第12页/共62页（2 2）液体样品液体样品 以无菌吸管吸取以无菌吸管吸取25m25mL L样品，置盛有样品，置盛有225m225mL L磷酸盐磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:101:10的样品的样品匀液。匀液。（3 3）样品匀液的样品匀液的pHpH值应在值应在6.5-7.56.5-7.5之间，必要时之间，必要时分别用分别用1mol/L1mol/L氢氧化钠（氢氧化钠（NaOHNaOH）或）或1mol/L1mol/L盐酸盐酸（HCIHCI）调节。）调节。第13页/共62页第14页/共62页（4 4）用用1m1mL L无菌吸管或微量移液器吸取无菌吸管或微量移液器吸取1:101:10样品匀液样品匀液1m1mL L，沿管壁缓缓注入，沿管壁缓缓注入9m9mL L磷酸盐缓磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用11支支1m1mL L无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成制成1:1001:100的样品匀液。的样品匀液。第15页/共62页（5 5）根据对样品污染状况的估计，按上述操）根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成作，依次制成1010倍递增系列稀释样品匀液。每倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释递增稀释11次，换用次，换用11支支1m1mL L无菌吸管或吸头。无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过超过15min15min。第16页/共62页每个样品，选择每个样品，选择33个个适宜的适宜的连续稀释度连续稀释度的样品匀的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种33管管月桂基硫酸盐胰蛋白胨月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LSTLST）肉汤）肉汤，每管，每管接种接种1m1mL L（如接种量超过（如接种量超过1m1mL L，则用双料，则用双料LSTLST肉肉汤）汤）,36,3611 培养培养24h24h2 2hh，观察倒管内是否，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至有气泡产生，如未产气则继续培养至48h2h48h2h。2 2、初发酵试验初发酵试验第17页/共62页记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。第18页/共62页用接种环从所有用接种环从所有48h2h48h2h内发酵产气的内发酵产气的LSTLST肉汤肉汤管中分别取培养物管中分别取培养物l l环，移种于煌绿乳糖胆盐环，移种于煌绿乳糖胆盐(BGLBBGLB）肉汤管中，）肉汤管中，363611 培养培养48h2h48h2h，观，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。3 3、复发酵试验、复发酵试验第19页/共62页根据大肠菌群阳性管数，检索根据大肠菌群阳性管数，检索MPNMPN表（见附录表（见附录B)B)，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPNMPN值值。注意：当检样的量与表中的量有增加或减少时，表内的数也应相应减少或增注意：当检样的量与表中的量有增加或减少时，表内的数也应相应减少或增加。加。4、大肠菌群最可能数（大肠菌群最可能数（MPN）的报）的报告告第20页/共62页第21页/共62页大肠杆菌大肠杆菌0157显色培显色培养基上的菌落养基上的菌落第22页/共62页在伊红美兰乳糖在伊红美兰乳糖琼脂（EMB）上上第23页/共62页大肠菌群在去氧胆酸钠琼脂上的典型特征大肠菌群在去氧胆酸钠琼脂上的典型特征典型菌落为红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为2-3mm或更大。第24页/共62页大肠菌群在结晶紫中性红琼脂大肠菌群在结晶紫中性红琼脂(VRBA)上典型特征上典型特征典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5mm或更大。第25页/共62页大肠杆菌在大肠杆菌在MFC琼脂上的典型特征琼脂上的典型特征第26页/共62页第27页/共62页试验流程试验流程第28页/共62页1 1、样品的稀释样品的稀释按第一法中的稀释方法进行。第29页/共62页（1）选取2个3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1mL。同时分别取1mL生理盐水加入两个无菌平皿作空白对照。（2）及时将15 mL-20mL冷至46 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL-4mLVRBA 覆盖平板表层。翻转平板，置于36l 培养18h-24h。2 2、平板计数平板计数第30页/共62页第31页/共62页第32页/共62页第33页/共62页例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105CFU/g（mL）。第34页/共62页国标国标4789.3的的08版与版与03版主要不同版主要不同1、名称更改 以大肠菌群计数代替原来的大肠菌群测定。2、增加了大肠菌群的平板计数法和纸片检测法。3、大肠菌群的MPN法以乳糖为主改为以月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤为主的要培养基的MPN法。4、大肠菌群的MPN法中原“报告每100 ml（或g）大肠菌群的MPN值”改为“报告每1 ml（或1g）大肠菌群的MPN值”。第35页/共62页比较区别GB/T4789.38-2008大肠杆菌的计数第36页/共62页03版流程第37页/共62页第38页/共62页第39页/共62页同一稀释度在做菌落总数测定的同时接种乳糖胆盐发酵管，并且用大肠埃希氏菌、产气肠杆菌混合菌种作对照。第40页/共62页第41页/共62页第42页/共62页第43页/共62页第44页/共62页可疑菌落特点：具有金属光泽的深紫黑色菌落；不带或略带金属光泽的菌落；中心色较深的淡紫黑色菌落。第45页/共62页第46页/共62页第47页/共62页第48页/共62页第49页/共62页第50页/共62页第51页/共62页第52页/共62页5、对初发酵时未产气的发酵管有疑问时，可用手轻轻敲动或摇动试管，如有气泡沿管壁上升，应考虑有气体产生，做进一步试验。第53页/共62页6、MPN检索表是采用三个稀释度九管法，较理想的结果是最低3管为阳性，最高3管为阴性。如无法估测样品中的菌数时，应做一定范围的稀释度。第54页/共62页7、MPN检索表只提供了3个稀释度，若改用其它浓度时，表内数字应相应增加或减少。第55页/共62页酱油（GB/T2717-2003）细菌菌落总数：30000cfu/ml大肠菌群：30MPN/100ml肠道致病菌：不得检出第56页/共62页全脂奶粉、脱脂奶粉（GB5410-1999）特级一级二级细菌菌落总数：200003000050000（cfu/ml）大肠菌群409090（MPN/100g）肠道致病菌：不得检出不得检出不得检出第57页/共62页巴氏杀菌乳（GB5408.1-1999）细菌菌落总数：30000cfu/ml大肠菌群：90MPN/100ml肠道致病菌：不得检出第58页/共62页生活饮用水卫生标准（GB5749-2006）菌落总数cfu/ml：100总大肠菌群cfu/100ml或MPN/100ml：不得检出耐热大肠菌群cfu/100ml或MPN/100ml：不得检出大肠埃希氏菌cfu/100ml或MPN/100ml：不得检出第59页/共62页瓶(桶)装饮用纯净水卫生标准(GB17324-2003)细菌菌落总数cfu/ml：20大肠菌群MPN/100ml：3致病菌(肠道致病菌和致病性球菌)：不得检出霉菌和酵母菌cfu/ml:不得检出第60页/共62页第61页/共62页