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生物检测技术（第二版）第六章 电子课件【知识目标】掌握细胞培养技术的特点和方法。掌握显微观察技术的操作方法。掌握常见细胞检测技术的基本原理和操作要点。掌握染色体的核型和分带的特点、操作方法。了解流式细胞技术的基本原理、方法及应用。【能力目标】能够进行常见动植物细胞和微生物细胞的培养。能够用显微镜对细胞形态进行观察。能够对细胞进行常规的检测和染色体的核型分析。第一节 细胞培养技术 一、微生物细胞培养（一）培养基的组成微生物人工培养的条件比动、植物细胞简单得多。虽然微生物种类繁多，所需的培养条件相差很大，但一般的培养基包括以下成分：.碳源碳元素是构成菌体成分的主要元素，又是产生各种代谢产物的重要原料。培养微生物最常用的碳源主要有葡萄糖、蔗糖、淀粉等。此外，由其他谷物、马铃薯、红薯、木薯等得到的糖类物质，也可用于培养。.氮源氮元素是构成微生物细胞、蛋白质和核酸的主要元素。因此，氮源在微生物培养过程中，是仅次于碳源的另一重要元素。工业微生物利用的氮源可分为无机氮源和有机氮源两类。无机氮源主要包括氨气、铵盐和硝酸盐等，其中铵盐用得最多，利用率也较高。有机氮源有氨基酸、蛋白质和尿素等，最常用的是牛肉膏、酵母膏、植物的饼粕粉和蚕蛹粉等，由动、植物蛋白质经酶消化后的各种蛋白胨尤为广泛使用。.无机盐无机盐类是微生物生命活动所不可缺少的物质。大量元素有磷、硫、镁、钾、钙等，通常在配制培养基时加入相应化学试剂即可，但其中首选的应是 和，因为它们可同时提供 种大量元素。微量元素有钴、铜、铁、锰、钼及锌等，因为它们在其他天然成分、一般化学试剂、天然水或玻璃器皿中都以杂质状态普遍存在，所以除非做特别精密的营养或代谢研究，一般不需要另外添加。.维生素微生物在生长时，自身往往缺乏合成这种有机物的能力，因此必须由外界提供。与微生物培养关系较大的主要是 族维生素，如乳酸菌生长时必须有泛酸。在很多天然的氮源与碳源中，均含有多种维生素，所以在配制培养基时，一般不需要另外加入。（二）微生物细胞培养的方法根据研究目的的不同，可采用不同的微生物培养方法。如为了获得纯培养的平板分离法，为了获得在自然界数量少或难培养的微生物的富集培养法；为了获得寄生微生物而与其寄主微生物共同培养的二元培养法；为了获得在特定环境中相互依赖共同生存的微生物的共培养法等，以及培养系统相对密闭的分批培养法、培养系统相对开放的连续培养法和特殊基础研究采用的同步培养法等。（三）培养时注意事项.注意温度和通气培养时必须经常注意温度和通气（振荡器的转速），有时还要注意湿度的变化。将烧瓶放置振荡器时，要注意从最下部开始，且使整体平衡。放好烧瓶，闭合开关后，先应检查振荡器有无异常运动、瓶上棉塞是否脱落、有无异常声音以及振荡器皮带有无异常磨损等。.注意 和培养基组成取样，调节 等均需在无菌室等无菌环境下进行。在振荡培养实验中，一般不能用 计自动调节，所以可以在培养液中预先加入 指示剂，根据其色泽变化添加酸或碱，或者在培养液中预先加入碳酸钙、缓冲液等。通常使用的试剂如下。（）碱液.氢氧化钠，氨水，碳酸铵水。（）酸液.盐酸、硫酸、磷酸、醋酸。（）碳酸钙 约 。（）缓冲液 、苹果酸、磷酸缓冲液。.防止杂菌污染在连续多天培养场合，每日应观察一次菌的生长状态，检查有无杂菌、棉塞有无脱落或沾湿。防止杂菌污染是最基本且最重要的注意事项。杂菌污染多数可由肉眼观察或臭味发现，还可用显微镜观察、平板划线培养来判断。还有噬菌体出现、营养缺陷型的营养要求丧失等情况，要根据不同情况使用不同的处理方法。二、植物细胞培养植物细胞培养是指对植物器官或愈伤组织上分离出的单细胞或小细胞团进行培养，形成单细胞无性系或再生植株，或生产代谢产物的技术。该技术是将组织振荡分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖来获得大量细胞群体从而获得细胞代谢产物。离体的植物器官、组织或细胞，培养一段时间，通过细胞分裂形成愈伤组织。由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者称为去分化。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程称为再分化。再分化形成的试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物体。这个过程依据的原理是植物细胞的全能性。植物细胞、组织培养是否成功，在很大程度上取决于对培养基的选择。不同培养基有不同特点，适合于不同的植物种类和接种材料。目前，应用最广的基础培养基主要有、培养基。植物细胞培养已形成了多种方法，下面主要介绍悬浮培养、固定化培养、单细胞培养。.悬浮培养悬浮培养是指把离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行无菌培养，使其增殖并分离提取细胞产生的代谢产物。悬浮细胞可以直接用来进行原生质体的分离、培养与杂交以及次生代谢物生产等，悬浮细胞具有愈伤组织或其他外植体无可比拟的优越性。.固定化培养固定化培养是指把细胞固定在一种惰性基质（如琼脂、藻类盐、聚丙烯酰胺、纤维膜）上或里面，细胞不能运动，而营养液可以在细胞间流动，供应其营养。固定化培养系统的优点在于：可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节；细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成；由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制；由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用；细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。目前，用于植物细胞固定化培养的固定化细胞反应器主要有平床培养系统、填充床和流化床反应器和膜反应器。.单细胞培养单细胞培养是对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直至长成完整植株的技术。单细胞的培养方法有看护培养法、平板培养法和微室培养法等。三、动物细胞培养动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工无菌条件下的生长增殖，在整个过程中细胞不出现分化，不再形成组织。所有的细胞离体培养中，最困难的就是动物细胞培养。根据培养的动物细胞是否附于支持物上的生长特性，可分为贴附型和悬浮型。贴附型是指细胞贴附在支持物表面生长，只依赖贴附才能生长的细胞称为贴附型细胞。这种现象与细胞分化有关，如来自中胚层的成纤维型细胞，来自外胚层的上皮型细胞。悬浮型细胞是指不贴附在支持物上生长的细胞，胞体圆形，在培养液中生长空间大，可长时间地生长，繁殖旺盛便于做细胞代谢研究，如血液里的白细胞等。从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养，称为原代培养，这是建立各种细胞系的第一步，也是获得细胞的主要手段。这一时期细胞比较活跃，进行细胞分裂，但不旺盛，多呈二倍体核型。原代与体内原组织形态结构和功能活动基本相似，各细胞的遗传性状互不相关，细胞相互依存性强。细胞的生存空间及营养是有限的，当细胞增殖到一定密度后，分离出一部分细胞和更新营养液，使细胞更好地生存，这一过程称为传代（图 ）。培养细胞的容器一般是培养瓶、器皿或其他容器。每次传代，细胞在生长和增殖方面受到一定的影响。如果把原代稀释分散成单细胞，再在软琼脂培养基中进行培养，细胞克隆的形成率下降，表明细胞独立生存性差。初代培养细胞一经传代便称为细胞系，在整个培养过程中，此期的持续时间最长，一般可传 代。这一时期细胞主要特点是细胞增殖旺盛，并维持二倍体核型，也称为二倍体细胞系，为了保存二倍体细胞性质，细胞应在初代或传代早期冻存最好，一般细胞在 代以内冻存，如图 所示。.培养基的组成用于动物细胞的培养基可以分为天然培养基和合成培养基两大类。天然培养基是使用最早、最为有效的动物细胞培养基，它主要取自于动物体液或从动物组织分离提取而得，其优点是营养成分丰富、培养效果良好；缺点是成分复杂、个体差异大、来源有限。天然培养基的种类有很多，包括生物性液体（如血清）、组织浸出液（如胚胎浸出液）、凝固剂（如血浆）等。合成培养基是对动物体内生存环境中各种已知物质在体外人工条件下的模拟，它给细胞提供了一个近似体内的生存环境，又便于控制和标准化的体外生存空间。由于细胞种类和生存条件的不同，合成培养基的种类也相当多。但在合成培养基中加入一定比例的天然培养基，可以克服合成培养基的只能维持细胞不死、不能促进细胞分裂的缺点。现在动物细胞培养基中常用成分有：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、有机添加剂和动物血清等。（）葡萄糖 多数培养基都含有葡萄糖以作为能源。（）氨基酸 必需氨基酸是生物体本身不能合成的，所以在培养基中需要添加，另外还需要添加半胱氨酸和酪氨酸。（）无 机 盐 主 要 是 指 、4 、4 和 3 等金属离子和酸根离子，它们是决定培养基渗透压的主要成分。悬浮培养 减少钙的用量，可以降低细胞的聚集和贴壁。（）维生素 最低基本培养基只含有 族维生素，其他都由血清来提供。（）有机添加剂 复杂培养基中含有核苷、柠檬酸循环中间体、丙酮酸、脂类及其他各种化合物。（）动物血清 血清中含有包括大分子的蛋白质和核酸等丰富的营养物质，对促进细胞生长繁殖、粘附及中和某些物质的毒性起着一定的作用。用于组织细胞培养的血清种类很多，其来源主要是动物，有小牛血清、胎牛血清、马血清、兔血清以及人血清等，使用最广泛的是小牛血清和胎牛血清。.动物细胞培养的方法根据动物细胞的类型，可采用悬浮培养、贴壁培养、固定化培养和灌注培养等多种方法进行大规模培养。（）悬浮培养是指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程，是在微生物发酵的基础上发展起来的，主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等。对于小规模培养，悬浮培养可采用转瓶和滚瓶培养方式，大规模培养则可采用发酵罐式的细胞培养反应器。悬浮培养对设备要求简单，但是此方法培养的细胞密度低且容易发生变异，因此有潜在的致癌危险，用悬浮培养的病毒易失去病毒标记而降低免疫力，此外，有许多动物细胞属于贴壁依赖性细胞，不能进行悬浮培养。（）贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。贴壁依赖性细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养器皿表面，并形成致密的细胞单层。贴壁培养系统主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等。这种培养的优点：容易更换培养液，细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液；容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，无需过滤系统；当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效地表达一种产品；同一设备可采用不同的培养液与细胞的比例；适用于所有类型的细胞。（）固定化培养是将动物细胞与水不溶性载体结合起来，再进行培养。既适用于贴壁依赖性细胞的培养，又适用于非贴壁依赖性细胞的培养，具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强等优点，细胞易与产物分开，有利于产物分离纯化。制备方法很多，包括吸附法、共价贴附法、离子 共价交联法、包埋法、微囊法等。（）灌注培养 在灌注培养中，细胞保留在反应器系统中，收集培养液的同时不断地加入新鲜的培养基。其主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分，并可带走代谢产物，同时细胞保留在反应器系统中，可以达到很高的细胞密度。同其他方法相比，灌注培养的产率可以提高一个数量级，并且可以降低劳动力消耗。该技术已成为动物细胞大规模培养的主要方法。灌注培养主要可分为悬浮灌注培养和床层培养。悬浮灌注培养是在普通悬浮培养的基础上，加上一个细胞分离器而成，以微载体悬浮培养加旋转过滤分离器最为常见；床层培养是把细胞直接保留于床层，不需要细胞分离器，其中堆积床和大孔载体培养的应用较广。.动物细胞培养的基本过程 取动物胚胎或幼龄动物器官、组织。将材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用胶原蛋白酶）处理（消化）处理形成单个细胞，将单个的细胞放入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。悬浮液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，出现接触抑制，这时期的细胞培养是原代培养。然后需要将出现接触抑制的细胞重新使用胰蛋白酶处理，再配成一定浓度的细胞悬浮液，这时进入传代培养。通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞称为细胞株。当培养超过 代时，大多数的细胞已经衰老死亡，但仍有部分细胞发生了遗传物质的改变出现了无限传代的特性，即癌变。此时的细胞称为细胞系。大规模动物细胞培养工艺流程如图 所示。四、微生物细胞和动物、植物细胞培养的区别虽然动物、植物和微生物细胞培养都是以在体外条件下的存活或生长为特征。但是动物、植物细胞培养与微生物细胞培养有很大的不同，如表 所示。三类细胞中植物细胞体积最大，其次是动物细胞，两者的生产周期也长于微生物。由于动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固体或半固体的表面才能生长，对营养要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血清。动物细胞对环境敏感，包括、溶氧、温度、剪切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格地监测和控制。相比之下，植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但植物细胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养产物，而且植物细胞生长较微生物要缓慢，营养基质中需要添加激素，生长及次级代谢物的生产要求一定的光照。因此，长时间的培养对无菌条件及反应器的设计具有特殊的要求。.动物细胞特点（）动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差。（）倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时须用抗生素。（）培养过程需氧量少（氧传质系数大于 即可满足 个 的细胞生长）。（）培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在。（）原代培养细胞一般繁殖 代即退化死亡。.植物细胞特点（）与微生物细胞相比，植物细胞要大得多，细胞壁以纤维素为主要成分，耐拉不耐扭，抗剪切能力低。（）植物细胞的倍增时间较长，一般超过，约是微生物的 倍，为防止培养过程中染菌，需加抗生素。（）植物细胞高密度培养才能达到经济生产，同时植物细胞很少是以单一细胞形式悬浮存在，而通常是以细胞数 个、直径为 左右的非均相集合细胞团的方式存在。因而带来培养液高的表观黏度和细胞对剪切应力敏感的问题，增加了悬浮培养的难度。（）细胞培养需氧，而培养液黏度大，且不能强力通风搅拌；产物在细胞内，且产量低。（）植物细胞培养具有形成组织甚至整体植株的潜力。.动物、植物细胞和微生物细胞培养的特殊条件要求（）动物细胞培养的特殊条件 在所有的细胞离体培养中，最困难的是动物细胞培养。下面是它所需要的特殊条件。血清：动物细胞离体培养常常需要血清，最常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。在这里，血清等于是动物细胞离体培养的天然营养液。支持物：大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃、高速冷冻离心机塑料等作为支持物。气体交换：二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件，每一次开箱操作后需快速恢复。由此决定了动物细胞离体培养设备要求高、投资大。（）植物细胞培养的特殊条件光照：离体培养的植物细胞对光照条件非常严格。虽然细胞生长所需要的物质主要是靠培养基供给的，但光照不但与光合作用有关，而且与细胞分化有关。例如，光照周期可对性细胞分化和开花起调控作用，因此以获得植株为目的的早期植物细胞培养过程中，光照条件特别重要。以植物细胞离体培养方式获得重要物质（如药物）的过程，植物细胞大多是在反应器中悬浮培养。激素：植物细胞的分裂和生长特别需要植物激素的调节，促进生长的生长素和促进细胞分裂的分裂素是最基本的激素。植物细胞的分裂、生长、分化和个体生长周期都有相应的激素参与调节。和动物细胞相比，植物细胞离体培养对激素要求的原理已经了解，其应用技术也已相当成熟，已经有一套广泛作为商品使用的培养液。同时解决了植物细胞对水、营养物、激素、渗透压、酸碱度、微量元素等的需求。（）微生物细胞培养的特殊条件 微生物多为单细胞生物，野生生存条件比较简单。因此，微生物人工培养的条件比动、植物细胞简单得多。其中厌氧微生物培养比好氧微生物复杂，因为严格厌氧需要维持二氧化碳等非氧的惰性气体浓度，而好氧微生物则只需要通过不断搅拌提供无菌氧气。微生物对培养条件要求不如动、植物细胞那样苛刻，玉米浆、蛋白胨、麦芽汁、酵母膏等成为良好的微生物天然培养基。对于一些特殊微生物的营养条件要求，可以在这些天然培养基的基础上额外添加。.培养产物的差异动物细胞培养是获得大量新生细胞或细胞产品，应用方面是获得细胞的产物或直接利用细胞等。植物细胞培养的目的是获得新个体或细胞产品，应用方面则是快速繁殖试管苗、细胞产品、人工种子、转基因植物的培育等。微生物细胞培养主要是获得其代谢产物或次级代谢产物或得到细胞本身。应用举例动物细胞培养第二节 显微观察技术 一、光学显微镜（一）显微镜的结构显微镜是由一个透镜或几个透镜的组合构成的一种光学仪器，主要用于放大微小物体，使其成为人的肉眼所能看到的物象。光学显微镜（图 ）通常由机械部分和光学部分组成。机械部分主要由镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器与调焦装置组成。光学部分主要有反光镜、集光器、物镜、目镜。显微镜的放大倍数，粗略计算方法为目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。如观察时所用物镜为 、目镜为 ，则物体放大倍数为 倍。（二）显微镜的使用方法.观察前的准备（）置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为 （.）左右。镜检者姿势要端正，一般用左眼观察，右眼便于绘图或记录，两眼必须同时睁开，以减少疲劳，亦可练习左右眼均能观察。（）显微镜是光学精密仪器，在使用时要特别小心，使用前要熟悉显微镜的结构和性能，检查各总零件是否完好无损。镜身有无灰尘，镜头是否清洁，做好必要的清洁和调整工作。（）调节光源。对光时应避免直射光源，因直射光源影响物像的清晰，损坏光源装置和镜头，并刺激眼睛。晴天可直接用窗外的散射光，如明暗天气，可用 日光灯或显微镜灯照明。调节光源及光照的一般步骤如下。将低倍物镜旋至镜筒下方，旋转粗调节轮，使镜头和载物台距离约为.左右。上升聚光器，使与载物台表面同样高。否则使用油镜时光线较暗。左眼看目镜，调节反光镜镜面角度（反光镜有凹平两面，光线较强的自然光源，宜用平面镜；光线较弱的自然光源或人工光源，宜用凹面镜）。对光使全视野内为均匀的明亮度。凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线。.低倍镜观察检查的标本须先用低倍镜观察，因为低倍镜视野较大，易发现目标和确定检查的位置。（）先将标本玻片置于载物台上，并将标本部位处于物镜的正下方，转动粗调节轮，下降物镜或上升载物台使物镜至标本0.5 处。（）左眼看目镜，同时逆时针方向慢慢旋转粗调节轮，当在视野内出现物像后，改用细调节轮，上下微微转动，直至视野内获得清晰的物像。然后认真观察标本各部位，确定并将需进一步要观察的部位移视野中央，准备用高倍镜观察。.高倍镜观察将高倍镜转正至正下方，在转换接物镜时，需用眼睛在侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后由目镜观察，再仔细调节光圈和聚光镜，使光线的明亮度适宜，同时再仔细正反两方向微转动细调节轮，直至获得清晰的物像后为止，找到最适宜于观察的部位。需进一步要观察的部位移视野中央，准备用油镜观察。.油镜观察显微镜上转换器上一般有四个物镜，放大倍数一般分别是 、，那个放大倍数最大的（）就是油镜，在使用的时候，需要在玻片上滴加香柏油才能看清楚镜下的物像。（）上升聚光器，全开虹彩光圈。（）用粗调节轮提起镜筒或下降载物台，转动转换器将油镜转至镜筒正下方。在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。右手顺时针方向慢慢转动粗调节轮使镜筒下降或载物台上升，与此同时，从显微镜的侧面观察使油镜浸入油中，直到几乎与标本接触时为止。注意不要压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏油镜头。（）从目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节轮将镜筒徐徐上升或将载物台徐徐下降，直到视野内出现物像为止，然后用细调节轮校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。.换片观察完一个标本后，如果想要再观察另一标本时，需先将高倍物镜（或油镜）转回到低倍物镜，取出标本，按放片的方法换上新片，即可观察。千万不可在高倍物镜（或油镜）下换片，以防损坏镜头。（三）显微镜使用的注意事项（）拿取显微镜必须一只手拿着镜臂，一只手托着镜座，并保持镜身的上下垂直，应避免震动，轻放台上。切不可一只手提起，以防显微镜、反光镜和目镜坠落。（）使用前应将镜身擦拭一遍，用擦镜纸将镜头擦净（切不可用手指擦抹）。若遇到镜台或镜头上有干香柏油，可用擦镜纸蘸取少量二甲苯将其擦去。（）使用时如发现显微镜操作不灵活或有损坏。不要擅自拆卸修理，应立即报告指导教师处理。（）注意保护镜头，切不可压碎标本玻片，损坏镜头。（）显微镜使用完毕，应登记显微镜使用卡经指导教师检查后放回镜箱。（）注意显微镜的保养油镜使用完毕，先用擦镜纸擦去镜头上的油。再取一张擦镜纸，滴上少量的二甲苯擦拭，然后再取另一张新擦镜纸将镜头上残留的二甲苯擦净。否则粘固透镜的胶质会被二甲苯溶解，日久镜片易移位脱落。下降聚光器，打开虹彩光圈，使反光镜垂直于镜座，以免积聚灰尘。用绸布将镜身擦拭干净（切不可用手擦拭），除去灰尘、油污、水汽，以免生锈长霉。使显微镜的各部件恢复回原位，下降镜筒，使物镜呈“八”字形置于载物台上，然后将显微镜送回镜箱中。显微镜应存放在干燥阴凉的地方，不要放在强烈的日光下暴晒，梅雨季节应在显微镜箱内放置干燥剂（硅胶），如长时间不用，则光学部分应卸下放在干燥器中，以免受潮生霉。显微镜应严禁与挥发性药品或腐蚀性药品放在一起，如碘片、盐酸、硫酸等药品。二、荧光显微镜荧光显微镜与普通光学显微镜不同，它不是通过普通光源的照射观察标本，而是利用一定波长的光（通常是紫外光，蓝紫光）激发显微镜下标本内的荧光物质，使之发射荧光，所以，荧光显微镜的光源所起的作用不是直接照明，而是作为一种激发标本内的荧光物质的能源。荧光显微镜主要由光源和滤光片系统组成。滤光片系统是荧光显微镜最重要的组成部分。（一）基本原理某些物质经一定波长的光（如紫外光）照射后，物质中的分子被激活，吸收能量后跃迁至激发态，当从激发态返回到基态时，所吸收的能量除部分转化为热量或用于光化学反应外，其余较大部分则以光能形式辐射出来，由于能量没能全以光的形式辐射出来，故所辐射出的光的波长比激发光的要长，这种波长长于激发光的可见光部分就是荧光。由此可见，被照射物质产生荧光必须具备以下两个条件：物质分子（或所特异性结合的荧光染料）必须具有可吸收能量的生色团；该物质还必须具有一定的量子产率和适宜的环境（如溶剂、温度等）。荧光显微技术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种实验技术。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接产生荧光，称为自发荧光（或直接荧光），如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不能产生荧光，但它吸收荧光染料后却同样能发出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后便可发出橘红色荧光。荧光显微镜具有特殊光源（多为紫外光光源），提供足够强度和波长的激发光，诱发荧光物质发出荧光。在视场中所观察到的图像，主要是样品的荧光映像。（二）操作流程及注意事项（）严格按照荧光显微镜厂家说明书要求进行操作，不要随意改变程序。（）滤光片的选用 荧光显微镜一般都带有各种波长的激发和截止滤光片，根据具体测试样品选择，即根据能够激发荧光的紫外光波长来选择激发滤光片（组），再根据所激发的荧光波长来选择截止滤光片（组）。这主要根据生物学方面的专业知识来选取，而仪器只是提供各种滤光片组。（）在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯 。待光源发出强光并稳定后，眼睛也已完全适应暗室再开始观察标本。（）载玻片、盖玻片及镜油应不含自发荧光杂质，载玻片的厚度应在.，太厚可吸收较多的光，不能使激发光在标本平面上聚焦。载玻片必须光洁，厚度均匀，无油渍或划痕。盖玻片厚度应在.左右。（）防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜。较长时间观察荧光标本时，一定要戴能阻挡紫外光的护目镜，加强对眼睛的保护。在未加入阻断滤光片前不要用眼直接观察，否则会损伤眼睛。（）检查时间每次以 为宜。超过，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱，标本受紫外线照射 后，荧光也会明显减弱，所以，最多不得超过 。（）荧光标本一般不能长久保存，若持续长时间照射（尤其是紫外线）会很快褪色。因此，如有条件则应先照相存档，再仔细观察标本。（）荧光显微镜的光源寿命有限，启动高压汞灯后，不得在 内将其关闭，一经关闭，必须待汞灯冷却后方可再开启。严禁频繁开闭，否则，会大大降低汞灯的寿命。标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。一天中应避免数次点燃光源。（）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中 保存，则可延缓荧光减弱时间，但应注意防止封裱剂蒸发。（）若暂不观察标本，可拉过阻光窗帘阻挡光线。这样，既可避免对标本不必要的长时间照射，又减少了开闭汞灯的频率和次数。三、激光共聚焦显微镜（一）基本原理激光共聚焦显微镜技术（，）是 世纪 年代在荧光显微镜的基础上发展起来的一项具有划时代意义的新技术，它集激光扫描、共聚焦成像和计算机处理等现代技术为一身，采用激光作为光源，在荧光显微镜成像的基础上，采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对观察样品进行数字图像处理的一套观察、分析和输出系统，主要包括激光光源、扫描器、荧光显微镜、光学装置、计算机控制系统等。通过 可对观察样品进行断层扫描和成像；可无损伤地观察和分析细胞的三维空间结构；可对活细胞进行动态观察及细胞分选等；对多重免疫荧光标记和离子荧光标记进行检测；并可修正图像的亮度及对比度。这样既容易记录和保存，也非常方便；在多重染色时，各荧光间的干涉很少，也可使用非荧光性探针。如金属染色剂及可以反射激光的染色剂。其具体操作方法需严格按照仪器说明书，并由专业人员操作。该技术的主要特点是可以得到非常鲜明的荧光图像，尤其在观察有一定厚度的胚胎及卵细胞等时，其效果更加明显。现已常用于细胞、细胞钙离子、膜蛋白、膜电位、受体和酶类等的分析和检验，以及广泛应用于细胞生物学各领域，成为形态学、分子细胞生物学、神经科学和药理学等研究领域中很重要的研究工具，为生命科学研究提供了更加灵活多样的方法。（二）应用由于 LSCM的光源为激光，激光点光源可通过对样品进行上下左右的扫描，同时具有横向和纵向的分辨率，可以获得400 700 厚标本不同层面的图像。而且，组织厚片的制作不需常规包埋、切片等繁琐的过程，因而最大限度地维持了细胞组织的正常形态和生理功能。加之众多的特异荧光探针的发展，使得人们可以方便地研究和观察组织细胞的特异结构、分子离子以及生物学行为等重要的问题。（）观察活细胞、活组织 在不损伤细胞的前提下，对活组织、活细胞进行观察和测量，这样不仅省去了繁琐的样品前期处理过程（如脱水、脱蜡、染色等）；而且观察过的样品还可以继续用于其他研究。这种功能对于细胞培养如原代培养的神经细胞、神经干细胞等研究尤为重要。（）生化成分精确定位观察 配合专用的分子探针，对于要检测的成分不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞水平和分子水平。（）对细胞生物学行为的动态观察 将样品固定在同一个样品视野，利用动态时间程序软件，控制仪器在一定的时间内按照一定的时间间隔，自动采集该视野的一系列图像，获取样品中待测荧光信号（强度、空间分布）动态变化的定量结果。现已用于心肌或平滑肌细胞、神经细胞内游离钙、钠、钾离子浓度或 的动态变化观察。（）数据、图像的数字化处理 可对数字化图像等及时输出或长期贮存，以及进一步地加工处理。（）定量分析 通过专一荧光探针对样品的染色，其荧光强度和所测成分的含量呈正比，当其余条件固定时，通过对比各组样品之间的荧光强度值，可得出特定成分的含量比。（三）注意事项（）关机时一定等激光冷却后再按下开关关机。（）汞灯电源关断后再开启汞灯要等 以上。（）使用中不得随意关断显微镜、控制箱等的电源。（）主机电脑中不得安装其他硬件、软件（尤其是盗版软件，严防电脑病毒），不得删除主机电脑中的程序。（）装卸物镜、片（即微分干涉差显微镜片，）要轻拿轻放，勿振动。（）油镜用后一定要清洁，但不得用二甲苯清洁。（）平时注意整机防尘。（）未经培训人员不得操作本机。（）如遇到异常状况，请与工程师联系。（）其他具体操作请参照随机的操作手册。（）如果本机长期不用，要确保每周至少开机一次（开机预热，运行）。四、扫描电子显微镜（一）基本原理扫描电子显微镜（，）（图 ）是继 之后发展起来的一种电子显微镜。它以电子束为照明源，把聚焦很细的电子束以光栅状扫描方式照射到样品表面，产生各种与样品性质有关的信息，将这些信息加以收集和处理从而获得微观形貌放大像。的分辨本领虽然不如透射电镜（），但却具有很强的立体感，可以在亚细胞水平上生动地显现生物样品的三维结构，适合于观察样品的表面形貌。在生物学上，通常用于观察研究组织和细胞表面的三维立体显微及亚显微结构。扫描电镜与透射电镜共同点是都采用电子束作光源，电磁场作透镜。所不同的主要是电子束、电子束照射样品的方式和被利用来成像的信号电子不同。扫描电镜主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生各种效应，其中主要是样品的二次电子发射。二次电子发射能够产生样品表面放大的形貌像。这个像是在样品被扫描时按时序建立起来的，即使用逐点成像的方法获得的放大像。由于观察目的不同，除了使用相同的固定液之外，生物样品制备与 有较大的差异。为了得到无损、真实而清晰的表面形貌结构，样品制备的全过程都必须十分小心地保护被观察面。在取材时，针对不同的样品、不同的观察要求，采取不同的技术，使被观察表面充分地暴露出来；脱水时，为了避免观察表面皱缩变形，设计了特殊的干燥方法；此外，还必须对样品进行导电处理，在样品表面喷镀一层厚度适当、均匀的金属膜。（二）样品制备.取材与清洗生物组织标本，包括血细胞和培养的肿瘤细胞均应事先充分冲洗，去除附于组织或细胞表面的组织液、血浆与黏液，使其充分暴露出其表面的构型。通常，用醋酸佛罗那缓冲液清洗培养于盖玻片上的细胞、组织标本 次。若未能洗净细胞、组织的表面，则可根据具体情况，考虑选用合适的酶进行处理。.固定将冲洗后的组织或细胞在.戊二醛中固定 至，用醋酸佛罗那缓冲液洗涤 次（次）。用、固定 至，用醋酸佛罗那缓冲液洗涤 次（次）。.脱水为了防止组织和细胞在干燥时变形，常用脱水剂（丙酮或丙酮 醋酸异戊酯）进行浓度梯度脱水。（）丙酮脱水法 配制 、的丙酮，样品从 丙酮逐级移至 丙酮，每次脱水 至。（）丙酮 醋酸异戊酯脱水法 配制 、的丙酮 醋酸异戊酯脱水剂，样品从 脱水剂开始，逐步移至 的脱水剂。（）干燥 生物标本与细胞均含有一定的水分，一般干燥后会使细胞扭曲变形，改变细胞的真实形态与结构。常用的方法如下。空气干燥法：将已固定、脱水的标本在空气中自然干燥。用此方法时，表面张力的牵拉可使细胞收缩变形。另外，标本的水分急骤汽化时，可因温度的降低而形成水晶，影响细胞与组织的形态结构。冷冻干燥法：将已固定与丙酮脱水的标本放至 的样品杯中，置液氮中冷冻。再将于液氮中冷冻的样品杯放置在真空喷镀仪中抽真空，使固化液氮和标本或细胞中的丙酮升华，得到干燥样品。此法简便易行，不要求特殊设备，也不会出现由于表面张力的牵拉而引起的样品损伤，但因急速冻结易产生冰晶，故可导致组织、细胞膨胀等损伤。临界点干燥法：将浸入醋酸异戊酯的标本取出，放入特制的标本盒内，送入临界点干燥仪的封闭标本室内。将此室充以液态 CO （临界温度为 31.4，临界压力为 7.2），然后加温到 15，使液态 CO 与标本中的醋酸异戊酯置换15。然后打开泄气阀使 CO 缓缓放出，自盒中取出干燥后的标本。具体注意事项包括：标本应预先充分固定与脱水，并确定观察面；保证标本室及相关管道的清洁，以防止标本污染；封闭标本室及 CO 瓶内的压力非常高，有关部位螺旋应拧紧，以防发生意外；排气速度不宜过快，温度应控制于45 50，否则标本可能膨胀；封闭标本室内的 CO 液体必须浸没标本，否则不能做到临界点干燥。（）喷镀 将干燥后的标本用导电胶粘在样品托上，待导电胶干燥后，立即将样品托上的标本置于真空喷镀仪内，先喷一层 厚的碳膜，然后再喷镀一层 厚的金或铂膜。镀膜后的标本可在扫描电镜下观察，或保存于干燥器内。（三）观察方法先打开电源，抽真空，待达到设定的真空度后，放入样品，进行加速高压选择、观察区域选择、放大倍数选择、倾斜度选择、工作距离选择、图像聚焦、观察及拍照记录。观察完成后，取出样品，关闭显微镜。应用举例扫描电子显微镜及细胞表面结构观察第三节常见细胞检测技术一、细胞大小测定（一）原理测量细胞的大小，一般是在显微镜下应用目镜测微尺进行操作的。目镜测微尺是一个可放入目镜内的特制圆形小玻片，玻片的中央是一根细长的带刻度的尺，等分成 小格或 小格。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上（图），用以测量经显微镜放大后的细胞物像的大小。目镜测微尺中每小格代表的实际长度是不固定的，它是随所使用目镜和物镜的放大率的不同而改变的，故在测量前必须先用镜台测微尺进行标定校正，以得出在显微镜的特定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。这样，根据细胞大小在显微镜中相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。镜台测微尺是一块特制的载玻片，中央粗线圆圈内有一根封固的标准刻度尺（图）。该尺总长为，精确等分为 个大格，每个大格又等分为 个小格共 个小格，每一小格长度为.，即。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于标定校正目镜测微尺每格的相对长度。所谓标定，即是求出在某一放大倍数时，目镜测微尺每小格代表的实际长度，然后用标定好的目镜测微尺来测量细胞的大小（图 ）。（二）操作步骤.准备工作取出目镜，旋开目镜透镜，将目镜测微尺放在目镜的光阑上（有刻度一面向下），然后旋上目镜透镜，插入镜筒。.看清刻度将镜台测微尺放在载物台上，通过调焦能看清镜台测微尺的刻度。镜台测微尺中央有一刻度标尺，全长为，划分 大格，每大格又分为 小格，故每小格长为0.01，即等于。.计算目镜测微尺每格的相应长度用低倍物镜观察，移动镜台测微尺和转动目镜测微尺，使两者刻度平行，并使两者间某段的起、止线完全重合，数出两条重合线之间的格数，即可求出目镜测微尺每格的相应长度（目镜测微尺和镜台测微尺两个重合点的距离愈长，则所测得的数字愈准确）。用同样的方法分别测出在高倍物镜和油镜下观察时目镜测微尺每格的相对长度。具体方法为：记录两对重合线间的目镜测微尺所占的格数和镜台测微尺所占的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。目镜测微尺每格长度（）两重合线间镜台测微尺小格数 两重合线间目镜测微尺小格数。以图 为例，目镜测微尺 小格正好与镜台测微尺 小格重叠，则目镜测微尺上每小格长度为 。注意：由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，若更换物镜或目镜的放大倍数时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。.测量细胞的大小取下镜台测微尺，将待观察载玻片等放在镜台上，通过调焦，使物像清晰后，转动目镜测微尺并移动载玻片，测量目标细胞的长与宽各占几格。将测得的格数乘以目镜测微尺每格长度即可求得细胞的长和宽。（三）实验注意事项（）目镜测微尺很轻薄，在取放时应特别注意防止因跌落而损坏。（）使用双目显微镜时目镜测微尺一般都要安装在右目镜中，因左目镜通常配有屈光度调节环，不能被取下。（）使用镜台测微尺进行标定时，可先对刻度尺外的粗圆圈线进行调焦，再通过移动标本推进器向圆圈中心寻找测微尺刻度。（）注意在观察测量时，光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度。（）换用高倍镜和油镜标定时，要防