免疫学检测技术.pptx

会计学1免疫学检测技术免疫学检测技术第1页/共101页抗原和抗体可以发生高度专一性的结合第2页/共101页 抗原和抗体可以发生高度专一性的结合第3页/共101页抗原和抗体可以发生高度专一性的结合第4页/共101页n n抗原或抗体检测原理：抗原或抗体检测原理：借助抗原和抗体在体外特异结合后抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对标本中的抗原或抗体进行定性或定量的检测。Equivalence Lattice formation抗原和抗体可以发生高度专一性的结合抗原和抗体可以发生高度专一性的结合第5页/共101页抗原或抗体检测原理第6页/共101页n n免疫学免疫学（Immunology）：是研究抗原性物质、免疫系是研究抗原性物质、免疫系统、免疫应答的规律及免疫应统、免疫应答的规律及免疫应答的调节的一门科学。答的调节的一门科学。n n免疫的定义免疫的定义（Immunity）：免疫免疫是机体识别自我与非自我的过是机体识别自我与非自我的过程。排除异己，维护自身稳定程。排除异己，维护自身稳定的生理反应。的生理反应。第7页/共101页免疫的功能：1.抵抗感染（Defense）：机体能抵抗病原微生物侵袭的能力。又称免疫防御。抗菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫免疫2.自身稳定（Homeostasis）：机体在新陈代谢过程中，产生大量的衰老死亡细胞，免疫的第二个功能就是清除这些细胞，维持机体的生理平衡。3.免 疫监视（Immunological surveillance）：机体细胞会因物理、化学和病毒等生物因素的影响，使细胞发生癌变，形成肿瘤等，机体可识别、清除这些细胞，这是免疫系统的第三个功能。当这一功能低下或失调时，会导致肿瘤或癌症。第8页/共101页抗原抗原抗原抗原 （AntigenAntigen）抗原概念抗原概念抗原概念抗原概念 凡能刺激机体产生特异性抗体和致敏淋巴细胞，凡能刺激机体产生特异性抗体和致敏淋巴细胞，凡能刺激机体产生特异性抗体和致敏淋巴细胞，凡能刺激机体产生特异性抗体和致敏淋巴细胞，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发生反应的物质。生反应的物质。生反应的物质。生反应的物质。抗原性抗原性（AntigenicityAntigenicity）：包括免疫原性和反应原）：包括免疫原性和反应原）：包括免疫原性和反应原）：包括免疫原性和反应原性二个方面性二个方面性二个方面性二个方面n n免疫原性免疫原性免疫原性免疫原性：抗原能：抗原能：抗原能：抗原能刺激机体产生抗体刺激机体产生抗体刺激机体产生抗体刺激机体产生抗体和致敏淋巴和致敏淋巴和致敏淋巴和致敏淋巴细胞的性能。细胞的性能。细胞的性能。细胞的性能。n n反应原性反应原性反应原性反应原性：抗原与特异性抗体或致敏淋巴细胞在：抗原与特异性抗体或致敏淋巴细胞在：抗原与特异性抗体或致敏淋巴细胞在：抗原与特异性抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发生反体内或体外发生反体内或体外发生反体内或体外发生反 应的性能。应的性能。应的性能。应的性能。第9页/共101页抗原抗原抗原抗原 （AntigenAntigen）构成抗原的条件构成抗原的条件构成抗原的条件构成抗原的条件1.1.异物性：机体免疫细胞能识别自身和异己物质，异物性：机体免疫细胞能识别自身和异己物质，异物性：机体免疫细胞能识别自身和异己物质，异物性：机体免疫细胞能识别自身和异己物质，只只只只有外源性的物质才具有免疫原性，产生免疫反应。有外源性的物质才具有免疫原性，产生免疫反应。有外源性的物质才具有免疫原性，产生免疫反应。有外源性的物质才具有免疫原性，产生免疫反应。亲缘关系越远，差异越大，抗原性越强。亲缘关系越远，差异越大，抗原性越强。亲缘关系越远，差异越大，抗原性越强。亲缘关系越远，差异越大，抗原性越强。自身抗原：自身组织发生异常变异、免疫功能紊乱、眼球晶体自身抗原：自身组织发生异常变异、免疫功能紊乱、眼球晶体自身抗原：自身组织发生异常变异、免疫功能紊乱、眼球晶体自身抗原：自身组织发生异常变异、免疫功能紊乱、眼球晶体蛋白、精子蛋白、甲状腺蛋白蛋白、精子蛋白、甲状腺蛋白蛋白、精子蛋白、甲状腺蛋白蛋白、精子蛋白、甲状腺蛋白2.2.大分子胶体：一般在大分子胶体：一般在大分子胶体：一般在大分子胶体：一般在10 kD10 kD以上以上以上以上 。3.3.具有复杂的立体结构或空间构象具有复杂的立体结构或空间构象具有复杂的立体结构或空间构象具有复杂的立体结构或空间构象.如明胶分子量虽然为如明胶分子量虽然为如明胶分子量虽然为如明胶分子量虽然为100 kD100 kD，但结构简单，免疫原性差。，但结构简单，免疫原性差。，但结构简单，免疫原性差。，但结构简单，免疫原性差。第10页/共101页抗原如何被识别抗原如何被识别抗原如何被识别抗原如何被识别抗原的特异性抗原的特异性 抗原决定簇：抗原分子表面具有免疫活抗原决定簇：抗原分子表面具有免疫活性的化学基因性的化学基因,是抗原与抗体结合的部位。是抗原与抗体结合的部位。抗原分子中抗原的特异性由抗原分子中抗原的特异性由抗原决定簇抗原决定簇抗原决定簇抗原决定簇决决定。定。第11页/共101页第12页/共101页一种细菌可以刺激多少种抗体产生？一种细菌可以刺激多少种抗体产生？一种细菌可以刺激多少种抗体产生？一种细菌可以刺激多少种抗体产生？抗原抗原第13页/共101页一种细菌可以刺激多少种抗体产生？一种细菌可以刺激多少种抗体产生？一种细菌可以刺激多少种抗体产生？一种细菌可以刺激多少种抗体产生？根据抗原的化学性质分：根据抗原的化学性质分：n n天然抗原：微生物及其产物抗原天然抗原：微生物及其产物抗原如如n n菌体抗原（菌体抗原（O 抗原）抗原）n n鞭毛抗原（鞭毛抗原（H 抗原）抗原）n n表面抗原（如大肠杆菌的表面抗原（如大肠杆菌的K 抗原）抗原）n n细菌的毒素抗原细菌的毒素抗原n n病毒抗原（病毒抗原（V 抗原）抗原）n n人工抗原：人工合成多肽、蛋白人工抗原：人工合成多肽、蛋白等等第14页/共101页抗体（抗体（Antibody)一、概念一、概念 是抗原刺激是抗原刺激B淋巴细胞淋巴细胞,使之使之增殖分化成浆细胞而产生的能增殖分化成浆细胞而产生的能与抗原发生特异性反应的与抗原发生特异性反应的免疫免疫球蛋白球蛋白(Immunoglobulin,Ig)第15页/共101页抗体（抗体（Antibody)一、概念一、概念二、免疫球蛋白的基本结构二、免疫球蛋白的基本结构免疫球蛋白：在人和动物血液、免疫球蛋白：在人和动物血液、组织液及其他分泌液中的一类组织液及其他分泌液中的一类结构相似的球蛋白。结构相似的球蛋白。1.由由4 条肽链组成：条肽链组成：2 条重链，条重链，2 条轻链条轻链2.一个抗体单分子：一个抗体单分子：2 个抗原个抗原结合位点结合位点第16页/共101页抗体（抗体（抗体（抗体（Antibody)Antibody)第17页/共101页抗体（抗体（抗体（抗体（AntibodyAntibody，Ab)Ab)n n免疫球蛋白的双重性免疫球蛋白的双重性 免疫球蛋白是一种蛋白质，免疫球蛋白是一种蛋白质，是抗体是抗体(Ab1)；同时又可引起机；同时又可引起机体产生抗体（抗抗体体产生抗体（抗抗体,Ab2），），所以既是所以既是抗体又是抗原抗体又是抗原。Ag Ab1 Ab2 第18页/共101页第19页/共101页抗体（抗体（抗体（抗体（AntibodyAntibody，Ab)Ab)n n免疫球蛋白的双重性免疫球蛋白的双重性n n免疫球蛋白的功能免疫球蛋白的功能 1.与抗原结合与抗原结合 2.激活补体激活补体 3.组织结合组织结合 4.调理作用调理作用 5.抗体依赖细胞介导的细胞毒作抗体依赖细胞介导的细胞毒作用用(ADCCADCC）第20页/共101页免疫球蛋白的功能免疫球蛋白的功能免疫球蛋白的功能免疫球蛋白的功能第21页/共101页抗体（Antibody)的产生与功能第22页/共101页抗体产生的主要过程抗体产生的主要过程抗体产生的主要过程抗体产生的主要过程抗体抗体第23页/共101页第24页/共101页注射注射抗原抗原（如类毒素）（如类毒素）血清血清抗体？抗体？抗原？抗原？抗体的制备第25页/共101页抗体的制备抗体的制备抗体的制备抗体的制备n n抗血清：指抗原人工免疫实验动物，获得含抗血清：指抗原人工免疫实验动物，获得含抗血清：指抗原人工免疫实验动物，获得含抗血清：指抗原人工免疫实验动物，获得含 特异性抗体的血清。特异性抗体的血清。特异性抗体的血清。特异性抗体的血清。n n多克隆抗体多克隆抗体多克隆抗体多克隆抗体 (PAbPAbPAbPAb)：多个抗原决定簇免疫机体多个抗原决定簇免疫机体多个抗原决定簇免疫机体多个抗原决定簇免疫机体 所产生的多种抗体的混合物。所产生的多种抗体的混合物。所产生的多种抗体的混合物。所产生的多种抗体的混合物。n n单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体（monoclonal antibodymonoclonal antibodymonoclonal antibodymonoclonal antibody，MAbMAbMAbMAb）：只针对某一特定的抗原决定簇，纯度高的抗体。只针对某一特定的抗原决定簇，纯度高的抗体。只针对某一特定的抗原决定簇，纯度高的抗体。只针对某一特定的抗原决定簇，纯度高的抗体。第26页/共101页多克隆抗体多克隆抗体与与单克隆抗单克隆抗体体第27页/共101页多克隆抗体多克隆抗体与与单克隆抗单克隆抗体体的制备的制备第28页/共101页单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 骨髓瘤细胞 脾脏淋巴细胞 （HGPRT-TK-)（HGPRT+TK+）在HAT中不能生长 体外培养过程中死亡 PEG 杂交瘤细胞 (HGPRT+、TK+)在HAT中大量长期繁殖 克隆化 产生单抗 第29页/共101页第一节第一节 免疫学检测技术原理免疫学检测技术原理n n抗原或抗体检测原理：抗原抗体的结合具有高度专一性抗原抗体的结合具有高度专一性抗原抗体的结合具有高度专一性抗原抗体的结合具有高度专一性 借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对标本中的抗原或抗体进行定性或定量现象，对标本中的抗原或抗体进行定性或定量的检测。的检测。第30页/共101页对抗原或抗体进行定性或定量的检测的原理对抗原或抗体进行定性或定量的检测的原理对抗原或抗体进行定性或定量的检测的原理对抗原或抗体进行定性或定量的检测的原理 Ab excessAg excessEquivalence Lattice formation第31页/共101页对抗原或抗体进行定性或定量检测的原理对抗原或抗体进行定性或定量检测的原理对抗原或抗体进行定性或定量检测的原理对抗原或抗体进行定性或定量检测的原理 根据抗原抗体形成的免疫复合物的浓度进行定量检测。P 312第32页/共101页第一节第一节 免疫学检测技术原理免疫学检测技术原理可作为抗原进行检查的物质：l l 微生物及其大分子产物l l 人和动物细胞l l 人和动物体内的各种大分子l l 各种半抗原第33页/共101页抗原或抗体检测原理第34页/共101页较早的抗原抗体反应检测方法较早的抗原抗体反应检测方法较早的抗原抗体反应检测方法较早的抗原抗体反应检测方法1、凝集反应、凝集反应 （Agglutination)2、沉淀反应、沉淀反应 (Precipitation)3、补体结合试验、补体结合试验 (Complement fixation test)4、中和试验、中和试验 (Neutralization test)第35页/共101页 一、凝聚反应(Agglutination)二、沉淀反应 1、溶液中的沉淀反应 2、凝胶扩散沉淀 3、免疫电泳 血清免疫电泳 火箭电泳 对流免疫电泳 三、补体参与的反应 四、免疫标记的抗原抗体技术 酶联免疫吸附（ELISA）第36页/共101页一、凝集反应一、凝集反应 凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。第37页/共101页一、凝集反应一、凝集反应 凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一定条件下出现凝集。第38页/共101页二、沉淀反应二、沉淀反应 当抗原是可溶性分子时，与抗体结合则形成沉淀。1 1、絮状沉淀反应、絮状沉淀反应 一系列试管中加入等量的抗体和递增量的抗原，在一系列试管中加入等量的抗体和递增量的抗原，在中性条件下中性条件下3737度保温度保温1-2h1-2h，便可见到絮状的蛋白质沉淀。，便可见到絮状的蛋白质沉淀。可用于寻找抗原抗体反应的合适比例，检测抗原抗体可用于寻找抗原抗体反应的合适比例，检测抗原抗体的分子比。的分子比。2 2、环状沉淀反应、环状沉淀反应 在试管中加入抗体后，小心加入相应抗原，使抗原在试管中加入抗体后，小心加入相应抗原，使抗原抗体步混合，抗体步混合，3737度保温度保温10-20min10-20min，在二者界面上出现环，在二者界面上出现环状沉淀。不能用于定量测定。状沉淀。不能用于定量测定。第39页/共101页3、双向扩散：又称琼脂扩散，是利用琼脂凝胶作介质的一种沉淀反应。琼脂是多孔的网状结构，可使大分子物质通过，分子的扩散作用使分别两处的抗原抗体相遇，比例合适时形成沉淀。可观测到沉淀弧。沉淀弧的特征与位置取决于抗原分子的大小、结构、扩散系数和浓度等。当抗原、抗体存在多种体系时，会出现多条沉淀弧。二、沉淀反应二、沉淀反应第40页/共101页双向扩散法的操作：生理盐水配制1%-5%的琼脂，取4mL倒在普通载玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗体用于测定抗体效价，中心孔滴入抗体，外周孔滴入抗原，用于检测抗原的存在和定性抗原。第41页/共101页二、沉淀反应二、沉淀反应 抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不同，沉淀弧的特征不同：抗原抗体为多体系时，出现的沉淀弧有多条，彼此互不干扰。第42页/共101页4、单向免疫扩散：又称单向琼脂扩散，是定量抗原的一种检测方法。与双向扩散不同的是在琼脂中含有一定量的抗体，孔内加入未知量的相应抗原。在37度保温过程中，孔内的抗原向周围扩散，与抗体形成沉淀圈。根据沉淀圈的大小确定抗原的含量二、沉淀反应第43页/共101页二、沉淀反应二、沉淀反应 另外还有其他众多的免疫检测技另外还有其他众多的免疫检测技术和手段，其机理都利用了抗原抗体术和手段，其机理都利用了抗原抗体的沉淀反应。的沉淀反应。例如例如微量免疫电泳、对流免疫电泳、微量免疫电泳、对流免疫电泳、微量免疫电泳、对流免疫电泳、微量免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳火箭电泳火箭电泳火箭电泳等。等。第44页/共101页免疫电泳免疫电泳第45页/共101页二、抗原或抗体检测的现代方法：二、抗原或抗体检测的现代方法：P3121.免疫荧光技术2.酶联免疫分析法3.放射免疫分析法第46页/共101页第一节免疫学检测技术原理第一节免疫学检测技术原理二、抗原或抗体检测的方法：二、抗原或抗体检测的方法：1.1.免疫荧光技术免疫荧光技术 将结合有荧光素的荧光抗体进行抗原抗体反应的技术将结合有荧光素的荧光抗体进行抗原抗体反应的技术将结合有荧光素的荧光抗体进行抗原抗体反应的技术将结合有荧光素的荧光抗体进行抗原抗体反应的技术 常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（fluorescein fluorescein isothiocyanate,isothiocyanate,FITCFITC)和罗丹明（和罗丹明（和罗丹明（和罗丹明（rhodamine rhodamine B200,B200,RB200RB200)等。它们可与抗体球蛋白中赖氨酸等。它们可与抗体球蛋白中赖氨酸等。它们可与抗体球蛋白中赖氨酸等。它们可与抗体球蛋白中赖氨酸的氨基结合，在蓝紫光激发下，可分别出现鲜明的氨基结合，在蓝紫光激发下，可分别出现鲜明的氨基结合，在蓝紫光激发下，可分别出现鲜明的氨基结合，在蓝紫光激发下，可分别出现鲜明的黄绿色及玫瑰红色。的黄绿色及玫瑰红色。的黄绿色及玫瑰红色。的黄绿色及玫瑰红色。第47页/共101页第一节第一节 免疫学检测技术原理免疫学检测技术原理二、抗原或抗体检测的方法：1.1.免疫荧光技术n n直接荧光法n n 间接荧光法 第48页/共101页第一节第一节 免疫学检测技术原理免疫学检测技术原理二、抗原或抗体检测的现代方法：二、抗原或抗体检测的现代方法：P3132.酶联免疫分析法3.放射免疫分析法第49页/共101页第二节第二节 免疫荧光技术在食品检测中免疫荧光技术在食品检测中的应用的应用 一、基本原理：将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术免疫荧光素技术。第50页/共101页第二节第二节 免疫荧光技术在食品检测中免疫荧光技术在食品检测中的应用的应用 一、基本原理：免疫荧光素技免疫荧光素技术术第51页/共101页第二节免疫荧光技术在食品检测中第二节免疫荧光技术在食品检测中的应用的应用二、抗体的荧光标记 P315（一）荧光抗体的制备n n搅拌法n n透析法（二）荧光抗体的鉴定 鉴定指标：效价、荧光素与蛋白质的结合比率第52页/共101页第二节第二节 免疫荧光技术在食品检测中免疫荧光技术在食品检测中的应用的应用三、标本的制作 P316 食品卫生检验中，荧光标记抗体检测标本的制作方法是将样品增菌液涂在载玻片上，涂片应薄而均匀，干燥后用化学方法固定，然后进行荧光染色。第53页/共101页第二节第二节第二节第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应免疫荧光技术在食品检测中的应免疫荧光技术在食品检测中的应免疫荧光技术在食品检测中的应用用用用五、荧光显微镜检查五、荧光显微镜检查 染色当天即作镜检 通风良好的暗室内进行 选择好光源或滤光片第54页/共101页第二节第二节第二节第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应免疫荧光技术在食品检测中的应免疫荧光技术在食品检测中的应免疫荧光技术在食品检测中的应用用用用五、荧光显微镜检查五、荧光显微镜检查 染色当天即作镜检 通风良好的暗室内进行 选择好光源或滤光片第55页/共101页第二节第二节第二节第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应免疫荧光技术在食品检测中的应免疫荧光技术在食品检测中的应免疫荧光技术在食品检测中的应用用用用四、荧光抗体染色方法 直接法 间接法第56页/共101页第二节第二节第二节第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应免疫荧光技术在食品检测中的应免疫荧光技术在食品检测中的应免疫荧光技术在食品检测中的应用用用用四、荧光抗体染色方法四、荧光抗体染色方法 直接法直接法 间接间接法法第57页/共101页 使用了两种抗体：使用了两种抗体：使用了两种抗体：使用了两种抗体：一抗、二抗一抗、二抗一抗、二抗一抗、二抗 二抗如何获得？二抗如何获得？二抗如何获得？二抗如何获得？第58页/共101页第二节第二节第二节第二节 免疫荧光技术在食品检测中免疫荧光技术在食品检测中免疫荧光技术在食品检测中免疫荧光技术在食品检测中的应用的应用的应用的应用六、在食品检验中的应用 P317 免疫荧光检测技术已经广泛应用于医药卫生领域，可检测细菌、病毒、寄生虫等，在食品卫生领域也应用的越来越多。第59页/共101页第三节第三节第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用 一、基本原理 P319 利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。酶联免疫吸附剂测定 enzyme linked immunosorbent assay，ELISA第60页/共101页第三节第三节第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用ELISA 基本原理 使抗原或抗体结合到某种固相载结合到某种固相载体表面体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。第61页/共101页第三节第三节第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应免疫酶技术在食品检测中的应免疫酶技术在食品检测中的应免疫酶技术在食品检测中的应用用用用ELISA 基本原理 在测定时，把受检酶标抗体或抗原和酶标抗原或抗在测定时，把受检酶标抗体或抗原和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用应。用洗涤洗涤洗涤洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶结合在固相载体上的酶结合在固相载体上的酶结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例量与标本中受检物质的量成一定的比例量与标本中受检物质的量成一定的比例量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色可根据颜色可根据颜色可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析反应的深浅刊物定性或定量分析反应的深浅刊物定性或定量分析反应的深浅刊物定性或定量分析。第62页/共101页第三节第三节第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用ELISA ELISA 基本原理基本原理 碱碱性性磷磷酸酸酶酶或或过过氧氧化化物物酶酶第63页/共101页第三节第三节第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用酶联免疫吸附剂测定酶联免疫吸附剂测定 enzyme linked immunosorbent assayenzyme linked immunosorbent assay，ELISA ELISA 二、二、ELISAELISA的种类的种类 P320P320直接法测定抗原直接法测定抗原直接法测定抗原直接法测定抗原间接法测定抗体间接法测定抗体间接法测定抗体间接法测定抗体双抗体夹心法测定抗原双抗体夹心法测定抗原双抗体夹心法测定抗原双抗体夹心法测定抗原双抗原夹心法测定抗原双抗原夹心法测定抗原双抗原夹心法测定抗原双抗原夹心法测定抗原竞争法测定抗原竞争法测定抗原竞争法测定抗原竞争法测定抗原第64页/共101页第三节第三节第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用第65页/共101页第三节第三节第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用二、ELISA的种类双抗原夹心法测定抗原第66页/共101页第三节第三节第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用二、ELISA的种类双抗体夹心法测定抗原第67页/共101页第68页/共101页第69页/共101页 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。（一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法第70页/共101页 ELISA ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。可用于测定抗原，也可用于测定抗体。可设计出各种不同类型的检测方法。可设计出各种不同类型的检测方法。（一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：骤如下：（1 1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2 2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。合的物质。（3 3）加酶标抗体：）加酶标抗体：（4 4）加底物：）加底物：第71页/共101页（一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1 1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：抗体：（2 2）加受检标本：）加受检标本：（3 3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。量正相关。（4 4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。定性或定量。根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。标本中的抗体。第72页/共101页二、ELISA的种类双抗体夹心法测定抗原第73页/共101页三、抗体的酶标记 P321 戊二醛法 过碘酸盐氧化法第三节第三节第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用第74页/共101页第三节第三节第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用四、酶与底物四、酶与底物 酶与抗原、抗体或半抗原在交联剂作用下连接。酶与抗原、抗体或半抗原在交联剂作用下连接。是是ELISAELISA成败的关键试剂成败的关键试剂 。P323 P323 表表表表14-1 14-1 五、固相载体五、固相载体 最常用的是聚苯乙烯最常用的是聚苯乙烯 ELISAELISA载体的形状主要有三种：载体的形状主要有三种：小试管、小试管、小珠、小珠、微量反应板（酶标板）微量反应板（酶标板）第75页/共101页第76页/共101页第三节第三节第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应免疫酶技术在食品检测中的应免疫酶技术在食品检测中的应免疫酶技术在食品检测中的应用用用用六、最适工作浓度的选择 以夹心法测抗原为例，可用棋盘滴定法。P323 表表14-2 第77页/共101页第三节第三节第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应免疫酶技术在食品检测中的应免疫酶技术在食品检测中的应免疫酶技术在食品检测中的应用用用用七、ELISA测定方法 1、加样 2、保温 3、洗涤 4、比色 5、结果判定第78页/共101页第三节第三节第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用n n封闭封闭 P330P330 封闭封闭封闭封闭(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据吸收后固相载体表面尚有未被占据吸收后固相载体表面尚有未被占据吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在些空隙，从而排斥在些空隙，从而排斥在些空隙，从而排斥在ELISAELISA其后的步骤中干扰物其后的步骤中干扰物其后的步骤中干扰物其后的步骤中干扰物质的再吸附质的再吸附质的再吸附质的再吸附。封闭的操作与包被相类似。封闭的操作与包被相类似。最常用的封闭剂是最常用的封闭剂是0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的牛血清白蛋白牛血清白蛋白牛血清白蛋白牛血清白蛋白，也有用也有用10%10%的的小牛血清小牛血清小牛血清小牛血清或或1%1%明胶明胶明胶明胶作为封闭剂的。作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，可以高浓度使脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，可以高浓度使用（用（5%5%）。）。第79页/共101页采用酶标法（ELISA）进行三聚氰胺检测 Thermo MK3型酶标仪第80页/共101页 酶标仪原理与结构 第81页/共101页第三节第三节第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应免疫酶技术在食品检测中的应免疫酶技术在食品检测中的应免疫酶技术在食品检测中的应用用用用八、酶免疫技术在食品检验中的应用 用于细菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生虫的检测。用于蛋白质、激素、其他生理活性物质、药物残留、抗生素等的检测。应用实例：ELISA法检测致泻性大肠埃希氏菌肠毒素。第82页/共101页常规鉴定常规鉴定ELISA法检测致泻性大肠埃希氏菌肠毒素第83页/共101页ELISA法检测肠毒素第84页/共101页 第四节第四节第四节第四节 放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫技术在食品检测中的应用第85页/共101页标记免疫分析技术标记免疫分析技术标记免疫分析技术标记免疫分析技术n n用标记示踪技术观察抗原抗体一级反应的分析方法用标记示踪技术观察抗原抗体一级反应的分析方法用标记示踪技术观察抗原抗体一级反应的分析方法用标记示踪技术观察抗原抗体一级反应的分析方法 特点：特点：特点：特点：敏感性高，反应时间短，可用仪器检测结果敏感性高，反应时间短，可用仪器检测结果敏感性高，反应时间短，可用仪器检测结果敏感性高，反应时间短，可用仪器检测结果n n三大标记免疫分析技术：三大标记免疫分析技术：三大标记免疫分析技术：三大标记免疫分析技术：放射免疫、荧光免疫、酶免疫放射免疫、荧光免疫、酶免疫 检测方法检测方法检测方法检测方法 检测范围检测范围检测范围检测范围n n生化、常规免疫生化、常规免疫生化、常规免疫生化、常规免疫 mgmggg（1010-3-3 1010-6-6 g g）n n荧光免疫、酶免疫荧光免疫、酶免疫荧光免疫、酶免疫荧光免疫、酶免疫 gnggng（1010-6-6 1010-9-9 g g）n n放射免疫放射免疫放射免疫放射免疫、发光免疫、发光免疫、发光免疫、发光免疫 ngpgngpg（1010-9-9 1010-12-12 g g）n nPCR pgfgPCR pgfg（1010-12-12 1010-15-15 g g）第86页/共101页 第四节第四节第四节第四节 放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫分析（放射免疫分析（RIARIA）一、基本原理一、基本原理 放射免疫分析的基本原理是放射免疫分析的基本原理是标记抗原标记抗原标记抗原标记抗原Ag*Ag*和和和和非标非标非标非标记抗原记抗原记抗原记抗原AgAg对特异性抗体对特异性抗体对特异性抗体对特异性抗体AbAb的的的的竞争结合反应竞争结合反应竞争结合反应竞争结合反应。反应式为：反应式为：Ag*Ag*+Ab Ag*Ab+Ab Ag*Ab +Ag Ag AgAb AgAb第87页/共101页标记抗原标记抗原抗体抗体非标记抗原非标记抗原图图 14-6第88页/共101页放射免疫RIA以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。免疫放射IRMA以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。放射受体分析RRA放射配体结合分析RBA其它其它一、基本原理第89页/共101页第四节第四节第四节第四节 放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫技术在食品检测中的应用二、标记物二、标记物 P333P333常用的核素有两大类常用的核素有两大类n n 射线：射线：131131I I、125125I I、5757CrCr和和6060CoCon n 射线：射线：1414C C、3 3H H和和3232P P。使用最广泛的是：使用最广泛的是：125125I I性质活泼、易制备标记物性质活泼、易制备标记物对被标记物的免疫活性影响小对被标记物的免疫活性影响小测量方法简便、已推广测量方法简便、已推广半衰期较长、核素丰度高半衰期较长、核素丰度高第90页/共101页B B、F F分离技术分离技术分离技术分离技术 第二抗体沉淀法第二抗体沉淀法第二抗体沉淀法第二抗体沉淀法 第91页/共101页第四节第四节第四节第四节 放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫技术在食品检测中的应用 测量仪器测量仪器测量仪器测量仪器n n（1）计数仪计数仪n n（2）液闪仪液闪仪第92页/共101页 化学发光化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。过程所产生的光的发射现象。化学发光发光免疫分析技术（Luminescent immunoassay，LIA）第93页/共101页 光照发光光照发光（photoluminescence）是指发光剂是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。射出较长波长的可见光（荧光）。生物发光生物发光（bioluminescence）是指发生在生物体是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用利用ATPATP能能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。的能量以光子的形式释放出来。第94页/共101页 化学发光化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂发光剂)在在化学反应时，化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。化学发光第95页/共101页 一些化学反应能释放足够一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，发到能发射光的电子激发态