重组克隆的筛选与鉴定.pptx

第七章第七章 重组克隆的筛选和鉴定重组克隆的筛选和鉴定n内容提要内容提要n第一节第一节 载体表型选择法载体表型选择法n第二节第二节 DNA电泳检测法电泳检测法n第三节第三节 核酸杂交检测法核酸杂交检测法n第四节第四节 免疫化学检测法免疫化学检测法n第五节第五节 转译筛选法转译筛选法n第六节第六节 真核重组基因的选择方法真核重组基因的选择方法一般克隆与筛选策略一般克隆与筛选策略第一节第一节 载体表型选择法载体表型选择法n根据载体提供的表型进行选择的方法：根据载体提供的表型进行选择的方法：n抗生素抗性基因的插入失活选择法抗生素抗性基因的插入失活选择法n-半乳糖苷酶的显色反应选择法半乳糖苷酶的显色反应选择法一般原理一般原理n一种利用一种利用抗生素抗性基因抗生素抗性基因或或其他基因其他基因的的插入失活，来筛选重组子的方法。插入失活，来筛选重组子的方法。n通常外源通常外源DNA插入的位点设计在特定基插入的位点设计在特定基因上，一旦外源因上，一旦外源DNA插入，该基因就被插入，该基因就被破坏而失去活性。由此来判断载体上是破坏而失去活性。由此来判断载体上是否带有外源否带有外源DNA。一、插入失活法的原理一、插入失活法的原理二、利用抗生素抗性基因：二、利用抗生素抗性基因：pBR322n以以pBR322为例，说明利用抗生素抗性基因的为例，说明利用抗生素抗性基因的插入失活的原理。插入失活的原理。1.原理原理n在在pBR322上有多个单一的限制酶位点，如上有多个单一的限制酶位点，如BamH I位点，恰好在一个四环素抗性基因内。位点，恰好在一个四环素抗性基因内。如果有外源如果有外源DNA插入插入BamH I位点，那么涉及位点，那么涉及四环素抗性的基因就损坏，因此，带有重组四环素抗性的基因就损坏，因此，带有重组pBR322质粒的细胞，仍对氨苄青霉素有抗性，质粒的细胞，仍对氨苄青霉素有抗性，但对四环素的抗性消失（敏感）。但对四环素的抗性消失（敏感）。2.筛选的方法筛选的方法n转化细胞涂布于含有氨苄青霉素的固体培转化细胞涂布于含有氨苄青霉素的固体培养基上，并培养至菌落出现。养基上，并培养至菌落出现。n用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体培养基表面接触一下。培养基表面接触一下。n适温培养，有的克隆生长，有的不生长。适温培养，有的克隆生长，有的不生长。n根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培养基上去找那些原始的克隆。养基上去找那些原始的克隆。n这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就是含有重组是含有重组pBR322质粒的重组子。质粒的重组子。图图 pBR322的结构图的结构图3.抗菌素标记的选择抗菌素标记的选择（1）Ampr 氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因n产生产生-内酰胺酶。酶使氨苄青霉素变为青霉内酰胺酶。酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸。青霉酮酸使蓝灰色的酮酸。青霉酮酸使蓝灰色的碘碘-青霉素指示液青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）褪色褪色。nAmpr有有Pst I、Sca I等多个插入位点。等多个插入位点。（2）四环素）四环素n抑制细菌生长，但不杀死细菌。抑制细菌生长，但不杀死细菌。（3）环丝氨酸）环丝氨酸n杀死生长的细菌，但不杀停止生长的细菌。杀死生长的细菌，但不杀停止生长的细菌。4.选择的过程选择的过程（1）四环素抗性插入失活）四环素抗性插入失活n如果在如果在Tetr上上插入外源插入外源DNA，导致四环，导致四环素抗性基因失活，可用素抗性基因失活，可用四环素四环素 环丝氨环丝氨酸酸的平板，选择重组克隆。的平板，选择重组克隆。nTetr插入失活的细菌，其生长可被四环插入失活的细菌，其生长可被四环素素抑制抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；，不被环丝氨酸杀死，保留下来；nTetr不失活的细菌，能抗四环素，正常不失活的细菌，能抗四环素，正常生长，但可被环丝氨酸杀死。生长，但可被环丝氨酸杀死。无环丝氨酸无环丝氨酸图图 四环素抗性插入失活四环素抗性插入失活重组克隆重组克隆（2）氨苄青霉素抗性插入失活）氨苄青霉素抗性插入失活n氨苄青霉素抗性基因编码产生氨苄青霉素抗性基因编码产生-内酰胺内酰胺酶。酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸。青酶。酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸。青霉酮酸使霉酮酸使蓝灰色蓝灰色的碘的碘-青霉素指示液青霉素指示液褪褪色色。n如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，导致氨苄导致氨苄青霉素抗性基因失活，就不能使碘青霉素抗性基因失活，就不能使碘-青青霉素指示液褪色霉素指示液褪色-呈呈蓝灰色。蓝灰色。据此选据此选择择阳性克隆阳性克隆。图图 氨苄青霉素抗性插入失活氨苄青霉素抗性插入失活三、利用三、利用-半乳糖苷酶显色半乳糖苷酶显色n选择重组子的原理选择重组子的原理1.-半乳糖苷酶与半乳糖苷酶与Lac Z基因基因n由由E.coli lac操纵子上的操纵子上的Lac Z基因编码。基因编码。分解乳糖生成葡萄糖和半乳糖。分解乳糖生成葡萄糖和半乳糖。2.Lac Z 基因基因n突变的突变的Lac Z基因，只编码基因，只编码-半乳糖苷半乳糖苷酶的酶的部分肽段部分肽段（氨基端）（氨基端）。2.培养基中培养基中IPTG、X-gal 的作用的作用（1）IPTG作用作用n异丙基硫代异丙基硫代-D-半乳糖苷是诱导物，可诱导半乳糖苷是诱导物，可诱导lacZ 基因的表达基因的表达-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。（2）X-gal作用作用n5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷。作为半乳糖苷。作为-半半乳糖苷酶水解的底物。乳糖苷酶水解的底物。（3）X-gal的显色反应的显色反应n-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(四聚体四聚体)将将X-gal水解成半乳糖水解成半乳糖苷和苷和蓝色蓝色的吲哚衍生物的吲哚衍生物(靛蓝靛蓝)。在。在4蓝色蓝色加深。加深。n-互补作用是互补作用是pUC质粒质粒载体的特性。载体的特性。npUC载体：载体：含有含有Lac Z 基因，编码基因，编码-半乳糖半乳糖苷酶的部分肽段（苷酶的部分肽段（片段，氨基端）片段，氨基端）。n受体菌：受体菌：基因组中带有基因组中带有突变的突变的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶基因（缺失基因（缺失 片段），可被片段），可被IPTG诱导表达诱导表达（只编码（只编码-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的-肽）。肽）。n载体和受体菌基因组互补：载体和受体菌基因组互补：只有当受体菌吸只有当受体菌吸收了带有收了带有LacZ 基因的基因的 pUC质粒，才能合成质粒，才能合成完整的有活性的完整的有活性的-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。3.-互补作用互补作用n氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因nLac Z 基因：编码基因：编码-半乳糖苷酶的部半乳糖苷酶的部分肽段。分肽段。nLac Z 上有插入外源上有插入外源DNA的的MCS位点。位点。pUC18/19的结构图的结构图n利用蓝白斑法筛选利用蓝白斑法筛选pUC8/9重组子，是一重组子，是一种直接检测种直接检测-半乳糖苷酶活性的方法。半乳糖苷酶活性的方法。n先将转化子涂于含有氨苄青霉素的培先将转化子涂于含有氨苄青霉素的培养基，能合成养基，能合成-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。n然后再通过检测然后再通过检测-半乳糖苷酶的活性，半乳糖苷酶的活性，来选择重组子，如果既能抗氨苄青霉素，来选择重组子，如果既能抗氨苄青霉素，又能合成又能合成-半乳糖苷酶的细胞，就是重半乳糖苷酶的细胞，就是重组子细胞。组子细胞。4.筛选的方法：蓝白斑法筛选的方法：蓝白斑法n-半乳糖苷酶分解半乳糖苷酶分解X-gal的显色反应的显色反应很灵敏。当在含有氨卡青霉素、很灵敏。当在含有氨卡青霉素、X-gal、IPDG的培养基中，那些能合成完整的的培养基中，那些能合成完整的-半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它能分解能分解X-gal而变成蓝色；而变成蓝色；而重组子而重组子克隆因克隆因Lac Z 基因被破坏，不能合成基因被破坏，不能合成完整的完整的-半乳糖苷酶，故不能分解半乳糖苷酶，故不能分解X-gal而呈白色。而呈白色。5.选择培养的原理选择培养的原理n在含有在含有X-gal 和和IPTG 的选择培养基上，的选择培养基上，载体上载体上没有没有插入片段的转化子为插入片段的转化子为蓝色蓝色菌菌落，而落，而携带携带插入片段的重组质粒转化子插入片段的重组质粒转化子为为白色白色菌落。菌落。n平板平板37培养后，放于冰箱培养后，放于冰箱3-4 小时，小时，可使显色反应充分，菌落为蓝色。可使显色反应充分，菌落为蓝色。图图 -半乳糖苷酶显色反应半乳糖苷酶显色反应*-半乳半乳糖苷酶糖苷酶 乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖X-gal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝+蓝色蓝色图图 LacZ 插入外源插入外源DNA图图 白色菌落与蓝色菌落的挑选白色菌落与蓝色菌落的挑选四、四、pBS重组质粒的筛选实验重组质粒的筛选实验n使用的载体为使用的载体为pBS质粒。质粒。n转化受体菌为转化受体菌为E.coli DH5菌株。菌株。n由于由于pBS上带有上带有Ampr 和和lacZ 基因，故基因，故重组子的筛选采用重组子的筛选采用Amp 抗性筛选与抗性筛选与-互互补现象筛选补现象筛选相结合的方法。相结合的方法。载体载体n-供体供体为羧基末端缺失的为羧基末端缺失的-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。如如pUC、pGEM系列载体。系列载体。菌株菌株n-受体受体为氨末端缺失的为氨末端缺失的-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。如如DH5(LacZM15)、JM101110(LacZM15)等。等。1.抗性筛选抗性筛选n因因pBS质粒带有质粒带有Ampr 基因，而外源基因，而外源DNA片段上不带该基因，故转化受体菌片段上不带该基因，故转化受体菌后，只有带有后，只有带有pBS DNA 的转化子，才的转化子，才能在含有能在含有Amp 的的LB 平板上存活下来；平板上存活下来；而只带有自身环化的外源而只带有自身环化的外源DNA片段的转片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。2.lacZ 基因的插入失活基因的插入失活npBS质粒上带有质粒上带有-半乳糖苷酶基因的半乳糖苷酶基因的调调控序列和控序列和-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N 端端146 个氨基个氨基酸的编码序列酸的编码序列。该编码区有一个多克隆。该编码区有一个多克隆位点，但并不破坏位点，但并不破坏lacZ 的阅读框架，不的阅读框架，不影响其正常功能。影响其正常功能。3.DH5菌株菌株nE.coli DH5菌株带有菌株带有-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的C端的部分编码序列。端的部分编码序列。n在各自独立的情况下，在各自独立的情况下，pBS 和和DH5编编码的码的-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在但在pBS 和和DH5融为一体时，可形成融为一体时，可形成具有具有-半乳糖苷酶活性的蛋白质。半乳糖苷酶活性的蛋白质。4.-互补现象互补现象nlacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的体与带有完整的近操纵基因区段的-半半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现象。象。n由由-互补产生的互补产生的Lac+细菌较易识别，它细菌较易识别，它在生色底物在生色底物X-gal 存在下，被存在下，被IPTG 诱导，诱导，形成形成蓝色菌落蓝色菌落。n当外源当外源DNA片段插入到片段插入到pBS 质粒的多克质粒的多克隆位点后，导致读码框架改变，表达蛋隆位点后，导致读码框架改变，表达蛋白失活，产生的肽段失去白失活，产生的肽段失去-互补能力。互补能力。因此，在同样条件下，含重组质粒的转因此，在同样条件下，含重组质粒的转化子，在生色诱导培养基上，只能形成化子，在生色诱导培养基上，只能形成白色菌落白色菌落。互补作用互补作用/现象现象n当当pUC质粒转化质粒转化LacZ基因的氨基未端编基因的氨基未端编码序列缺失的码序列缺失的Lac-指示菌株时，能恢复指示菌株时，能恢复-半乳糖苷酶活性，从而在含半乳糖苷酶活性，从而在含IPTG和和X-gal的平板上，分解的平板上，分解X-gal成成5-溴溴-4-氯氯靛蓝，出现靛蓝，出现蓝色菌落蓝色菌落的现象。的现象。n当外源当外源DNA插入插入pUC的的MCS时，时，-互补互补作用被破坏，在作用被破坏，在IPTG和和X-gal平板上则平板上则不显蓝色而出现不显蓝色而出现白色菌落白色菌落。第三节第三节 DNA电泳检测法电泳检测法 PFGEn从转化后的克隆（转化子）中快速抽提从转化后的克隆（转化子）中快速抽提重组质粒，琼脂糖凝胶电泳比较其分子重组质粒，琼脂糖凝胶电泳比较其分子量大小。量大小。n插入外源插入外源DNA的重组质粒分子量大，没的重组质粒分子量大，没有插入外源有插入外源DNA的质粒分子量小。的质粒分子量小。n比较不同质粒在凝胶中的迁移率，迁移比较不同质粒在凝胶中的迁移率，迁移快慢不同，即可选出重组子。快慢不同，即可选出重组子。一、直接电泳检测法一、直接电泳检测法Marker载体载体重组重组图图 琼脂糖凝胶电泳图谱的比较琼脂糖凝胶电泳图谱的比较已知已知未知未知二、酶切产物电泳筛选法二、酶切产物电泳筛选法n1.原理原理n根据已知的外源根据已知的外源DNA序列的限制性酶切序列的限制性酶切图谱，选择图谱，选择12种内切酶切割质粒，电种内切酶切割质粒，电泳后泳后比较比较DNA带数和长度。带数和长度。n或用一种内切酶切下插入片段，再用另或用一种内切酶切下插入片段，再用另一种酶酶切这个片段，电泳后一种酶酶切这个片段，电泳后比较两者比较两者是否符合预计的结果是否符合预计的结果。图图 酶切产物的电泳筛选酶切产物的电泳筛选图图 限制性内切酶酶切图谱限制性内切酶酶切图谱图图 表型筛选加酶切筛选表型筛选加酶切筛选nAATTAATT三、三、PCR扩增检测法扩增检测法1.原理原理n在模板序列上扩增出预期在模板序列上扩增出预期DNA片断。片断。2.过程过程（1）从重组克隆中提取质粒（或）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。）。（2）用插入的）用插入的DNA片段的引物作片段的引物作PCR。（3）PCR产物电泳检查。产物电泳检查。（4）PCR产物的长度是否与外源基因一致。产物的长度是否与外源基因一致。第四节第四节 核酸的分子杂交核酸的分子杂交n核酸杂交技术由核酸杂交技术由Hall、Nygaard等于等于70年代建立，应用年代建立，应用DNA或或RNA探针，与探针，与靶序列在溶液中杂交，检测固定在硝酸靶序列在溶液中杂交，检测固定在硝酸纤维素（纤维素（NC）膜上的核酸序列的技术。）膜上的核酸序列的技术。n核酸杂交法利用标记的核酸探针，与转核酸杂交法利用标记的核酸探针，与转化细胞的化细胞的DNA进行杂交，可以直接筛选进行杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。和鉴定目的序列克隆。n常用的方法：将转化后生长的菌落，复常用的方法：将转化后生长的菌落，复印到硝酸纤维膜上，再用碱裂细菌菌落，印到硝酸纤维膜上，再用碱裂细菌菌落，释放的释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的就吸附在膜上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的序列的菌落含有目的序列的菌落DNA上。上。n该技术已广泛应用于基因的表达、基因该技术已广泛应用于基因的表达、基因定位、克隆基因的筛选、酶切图谱的制定位、克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列检测、遗传作、基因组中特定基因序列检测、遗传病疾病的诊断及生物分类等方面。病疾病的诊断及生物分类等方面。一、核酸分子杂交的基础一、核酸分子杂交的基础1.变性与退火变性与退火nDNA以双链形式存在，在进行分子杂交以双链形式存在，在进行分子杂交时，先将双链时，先将双链DNA分子解聚为单链，这分子解聚为单链，这一过程称为一过程称为变性变性。n两条单链通过碱基互补，聚合成稳定的两条单链通过碱基互补，聚合成稳定的双链区的过程称为双链区的过程称为退火或复性退火或复性。2.同源序列同源序列n不同来源的核酸单链只要彼此之间有一不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序，即某种程度的同源定程度的互补顺序，即某种程度的同源性，就可形成杂交双链。性，就可形成杂交双链。n分子杂交可在分子杂交可在DNA与与DNA（Southern blot）、）、RNA与与DNA（Northern blot）或或RNA与与RNA（In situ）的二条单链之）的二条单链之间进行。间进行。3.分子杂交法分子杂交法n分子杂交是通过一定方法，将核酸分子分子杂交是通过一定方法，将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标固定在固相支持物上，然后用放射性标记的记的探针探针与被固定的核酸分子杂交，经与被固定的核酸分子杂交，经显影后，显示出目的显影后，显示出目的DNA或或RNA所处所处的位置。的位置。n分子杂交就是将一种核酸单链用同位素分子杂交就是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行杂交。核酸单链进行杂交。4.探针探针n经过同位素或非同位素标记的已知序列经过同位素或非同位素标记的已知序列的寡核苷酸。的寡核苷酸。n单一的已知序列的寡核苷酸探针，能与单一的已知序列的寡核苷酸探针，能与它们的目的序列配对，可以准确地设计它们的目的序列配对，可以准确地设计杂交条件，以保证探针只与目的序列杂杂交条件，以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交，对于一些未知序列的目的片段则无交，对于一些未知序列的目的片段则无效。效。5.杂交的灵敏度和特异性杂交的灵敏度和特异性n核酸分子杂交具有高度的灵敏度和特异核酸分子杂交具有高度的灵敏度和特异性。性。n可以根据所使用的探针的已知序列，进可以根据所使用的探针的已知序列，进行特异性的靶序列检测。行特异性的靶序列检测。二、探针的类型二、探针的类型n根据核酸的性质，可分为：根据核酸的性质，可分为：nDNA探针、探针、RNA探针、探针、cDNA探针和寡核酸探针和寡核酸探针。探针。n根据是否使用放射性标记物，可分为：根据是否使用放射性标记物，可分为：n放射性标记探针和非放射性标记探针。放射性标记探针和非放射性标记探针。n根据是否存在互补链，可分为：根据是否存在互补链，可分为：n单链和双链探针。单链和双链探针。n根据放射性标记物掺入情况，可分为：根据放射性标记物掺入情况，可分为：n均匀标记和末端标记探针。均匀标记和末端标记探针。1.双链双链DNA探针探针n双链双链DNA探针的合成方法探针的合成方法n主要有两种：主要有两种：n切口平移法。切口平移法。n随机引物合成法。随机引物合成法。2.单链单链DNA探针探针n单链单链DNA探针主要有两种合成方法探针主要有两种合成方法:n以以M13载体衍生序列为模板，用载体衍生序列为模板，用Klenow片段合成单链探针。片段合成单链探针。n以以RNA为模板，用反转录酶合成单链为模板，用反转录酶合成单链cDNA探针。探针。3.末端标记末端标记DNA探针探针n以以Klenow片段标记片段标记3末端为例说明末端末端为例说明末端标记的方法。标记的方法。4.寡核苷酸探针寡核苷酸探针n利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。个核苷酸的点突变。n常用的寡核苷酸探针主要有两种常用的寡核苷酸探针主要有两种:n单一已知序列的寡核苷酸探针单一已知序列的寡核苷酸探针n许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库。酸探针库。三、探针的标记方法与选择三、探针的标记方法与选择1.探针标记的方法探针标记的方法n缺口平移法缺口平移法nDNA快速末端标记快速末端标记nT4多核苷酸激酶标记多核苷酸激酶标记DNA 5末端法末端法n随机引物延伸法随机引物延伸法n聚合酶链反应法。聚合酶链反应法。2.标记方法的选择标记方法的选择n根据实验的要求如灵敏度和显示方法等，选根据实验的要求如灵敏度和显示方法等，选择合适的标记方法。择合适的标记方法。n一般放射性探针比非放射性探针的灵敏度一般放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。高。n在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。率高、显示灵敏的探针标记方法。n在对灵敏度要求不高时，可采用保存时间在对灵敏度要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术，或比较稳定的碱性磷长的生物素探针技术，或比较稳定的碱性磷酸酶显示系统或过氧化物酶系统。酸酶显示系统或过氧化物酶系统。四、分子杂交四、分子杂交1.1.常用的核酸杂交方法常用的核酸杂交方法n Southern印迹杂交（印迹杂交（Southern blot）n Northern印迹杂交（印迹杂交（Northern blot）n菌落原位杂交（菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）n组织原位杂交（组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）等。）等。n点杂交（点杂交（Dot blot）2.分子杂交的分类分子杂交的分类n根据被测定的对象不同，可分为根据被测定的对象不同，可分为2大类大类:(1)Southern杂交杂交n被检对象为被检对象为DNA，探针为，探针为DNA或或RNA。DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。(2)Northern杂交杂交nRNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维滤膜（维滤膜（NC）上，然后用探针杂交。被检对）上，然后用探针杂交。被检对象为象为RNA，探针为，探针为DNA或或RNA。五、五、Southern blot1.Southern杂交或杂交或DNA印迹印迹n1975年由年由Southern创建，称为创建，称为Southern印迹印迹技术。用技术。用DNA或或RNA探针检测样品探针检测样品DNA。2.特点特点nSouthern杂交用以检测经限制性内切酶切割杂交用以检测经限制性内切酶切割后的后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列。片段中是否存在与探针同源的序列。n从宿主细胞中提取基因组从宿主细胞中提取基因组DNA或质粒载体，或质粒载体，再用探针杂交。只有插入目的片段的重组体，再用探针杂交。只有插入目的片段的重组体，才能与探针杂交，并在才能与探针杂交，并在X光底片上曝光显示印光底片上曝光显示印迹。迹。3.杂交的方法杂交的方法转膜：转膜：n将将DNA样本用限制性内切酶消化后，经琼脂样本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳，分离各酶解片段，然后经碱变糖凝胶电泳，分离各酶解片段，然后经碱变性、性、Tris缓冲液中和、高盐下通过毛吸作用，缓冲液中和、高盐下通过毛吸作用，将将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素（从凝胶中转印至硝酸纤维素（NC）滤）滤膜上，烘干固定后，即可用于杂交。膜上，烘干固定后，即可用于杂交。杂交：杂交：n在一定条件下，探针与同源在一定条件下，探针与同源DNA片段杂交，片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。通过自然后漂洗除去非特异性结合的探针。通过自显影检查目的显影检查目的DNA所在位置。所在位置。4.杂交的步骤或程序杂交的步骤或程序n(1)酶切待测目的酶切待测目的DNA，凝胶电泳分离各酶，凝胶电泳分离各酶切片段，并使切片段，并使DNA原位变性为单链。原位变性为单链。n(2)将单链将单链DNA片段转移到硝酸纤维素片段转移到硝酸纤维素（NC）滤膜或尼龙膜上。）滤膜或尼龙膜上。n(3)预杂交滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点。预杂交滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点。n(4)让单链的探针与同源让单链的探针与同源DNA片段杂交，漂片段杂交，漂洗除去非特异性结合的探针。洗除去非特异性结合的探针。n(5)通过自显影检测目的通过自显影检测目的DNA所在位置。所在位置。Southern杂交杂交(Southern印迹法印迹法)n将混合在一起的限制性酶切将混合在一起的限制性酶切DNA片段，片段，用琼脂糖电泳分开，并变性为单链用琼脂糖电泳分开，并变性为单链DNA，再转移到一张硝酸纤维素膜上。在膜，再转移到一张硝酸纤维素膜上。在膜上的单链上的单链DNA可用可用32p标记的单链标记的单链DNA探针杂交。再用放射自显影方法，显示探针杂交。再用放射自显影方法，显示出与探针顺序互补的限制性酶切出与探针顺序互补的限制性酶切DNA片片段的位置。段的位置。n这个方法能将上万个片段中的某一个特这个方法能将上万个片段中的某一个特殊的目的片段鉴定出来。殊的目的片段鉴定出来。图图 Southern blot图图 Southern blot凝胶电泳凝胶电泳底片显示杂交印迹底片显示杂交印迹图图 Southern印迹印迹六、六、Northern blot1.Northern印迹杂交印迹杂交n对被检测的对被检测的RNA进行变性凝胶电泳，以进行变性凝胶电泳，以除去除去RNA中的二级结构，使大小不同的中的二级结构，使大小不同的RNA完全分离。完全分离。n将变性后将变性后RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，然后与探针杂交。酸纤维素膜上，然后与探针杂交。2.特点特点n用用DNA或或RNA探针检测探针检测RNA样品。样品。n从宿主细胞中提取从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。，再用探针杂交。主要检测插入片段是否被转录。主要检测插入片段是否被转录。n用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛变性用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛变性RNA，变性后的，变性后的RNA有利于在转印过程中与有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，以及保持其单链状硝酸纤维素膜结合，以及保持其单链状态。用态。用NaOH会水解会水解RNA。七、七、DNA-RNA杂交杂交nDNA-RNA杂交采用杂交采用R-环检测法环检测法。n选择过程选择过程n用用mRNA与重组载体杂交。与重组载体杂交。n在在70%甲酰胺中，甲酰胺中，DNA双链变性，复双链变性，复性时，性时，DNA-RNA杂交分子比杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。双链更稳定。n电镜下可见到电镜下可见到R-环形结构。环形结构。图图 DNA-RNA杂交（杂交（R-环）环）八、菌落原位杂交八、菌落原位杂交n Colony in situ hybridization1.杂交的方法杂交的方法n将细菌从平板转移到硝酸纤维素滤膜上。将细菌从平板转移到硝酸纤维素滤膜上。n将滤膜上的菌落原位裂解，以释出将滤膜上的菌落原位裂解，以释出DNA。n烘干，将烘干，将DNA固定于膜上。固定于膜上。n与与32P标记的探针杂交。标记的探针杂交。n平板置于平板置于4，放射自显影，检测菌落杂交，放射自显影，检测菌落杂交信号（结果），并与平板上的菌落对应。信号（结果），并与平板上的菌落对应。2.特点特点n对应的菌斑对应的菌斑(或噬菌斑或噬菌斑)位置不变，可以位置不变，可以直接找出阳性菌落。直接找出阳性菌落。n对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落(200)进行克隆筛选时可采用本法。进行克隆筛选时可采用本法。n将分散在若干个琼脂平板上的少数菌落将分散在若干个琼脂平板上的少数菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素膜上。个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。解。图图 菌落原位杂交菌落原位杂交Colony in situ hybridization九、组织原位杂交九、组织原位杂交nTissue in situ hybridization，简称原位，简称原位杂交杂交1.方法方法n组织或细胞经适当处理后，使细胞通透组织或细胞经适当处理后，使细胞通透性增加，探针直接进入细胞内与性增加，探针直接进入细胞内与DNA或或RNA杂交。杂交。2.特点特点n组织的原位杂交与菌落的原位杂交不同，组织的原位杂交与菌落的原位杂交不同，可以确定可以确定探针的互补序列探针的互补序列在细胞内的空在细胞内的空间位置。间位置。n例如，通过与细胞例如，通过与细胞RNA的杂交，可分析的杂交，可分析一种一种RNA在细胞组织中的分布、显示细在细胞组织中的分布、显示细胞及病原微生物的存在方式和部位等。胞及病原微生物的存在方式和部位等。十、斑点杂交十、斑点杂交n斑点杂交是指将斑点杂交是指将DNA或或RNA样品直接点在硝样品直接点在硝酸纤维素滤膜上酸纤维素滤膜上,然后与核酸探针分子杂交然后与核酸探针分子杂交,以显示样品中是否存在特异的以显示样品中是否存在特异的DNA或或RNA。同一种样品经不同倍数的稀释同一种样品经不同倍数的稀释,还可以得到半还可以得到半定量的结果。所以它是一种简便、快速、经定量的结果。所以它是一种简便、快速、经济的分析济的分析DNA或或RNA的方法的方法,在基因分析和在基因分析和基因诊断中经常用到基因诊断中经常用到,是研究基因表达的有力是研究基因表达的有力工具。但由于目的序列未与非目的序列分离工具。但由于目的序列未与非目的序列分离,不能了解目的序列的长度。尤其在本底干扰不能了解目的序列的长度。尤其在本底干扰较高时较高时,难以区分目的序列信号和干扰信号。难以区分目的序列信号和干扰信号。点杂交法（点杂交法（Dot blot）n将被检测标本点到膜上，烘烤固定。将被检测标本点到膜上，烘烤固定。n这种方法耗时短，可做半定量分析，一这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。张膜上可同时检测多个样品。n为使点样准确方便，有多种多管吸印仪为使点样准确方便，有多种多管吸印仪如如Bio-Dot(BioRad)，它们有许多孔，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。这时的膜就可以进行杂交。n凝胶中凝胶中DNA片段的相对位置在片段的相对位置在DNA片段片段转移到滤膜的过程中继续保持着。转移到滤膜的过程中继续保持着。n附着在滤膜上的附着在滤膜上的DNA与与32P标记的探针标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条的每条DNA带的位置，从而可以确定在带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。片段的位置和大小。1.核酸杂交核酸杂交n重组克隆与探针杂交。重组克隆与探针杂交。2.检测用的探针检测用的探针n与外源与外源DNA插入片段互补的序列。插入片段互补的序列。3.识别标记识别标记n（1）放射性同位素：）放射性同位素：32P 或或 125I。n（2）非放射性标记：荧光素）非放射性标记：荧光素一、原理一、原理酶切前酶切前酶切后酶切后插入片段插入片段载体载体载体载体 载体载体重组体重组体重组体重组体第五节第五节 免疫化学检测法免疫化学检测法 n对表达产物的检测。对表达产物的检测。n蛋白蛋白蛋白蛋白“杂交杂交”n利用抗体作为利用抗体作为“探针探针”，检测转入受体，检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。一、放射性抗体检测法一、放射性抗体检测法n1.抗体与产物的结合方式抗体与产物的结合方式n根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：抗）的性质可分为几种作用方式：待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 标记的二标记的二 抗结合蛋白抗结合蛋白固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗125I标记的二抗标记的二抗固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗固相支固相支持滤膜持滤膜固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗 二抗二抗125I 标记的二抗标记的二抗 结合蛋白结合蛋白125I标记的二抗标记的二抗2.放射性抗体检测法过程放射性抗体检测法过程3.Broome-Gilbert双位点检测法双位点检测法n检测融合蛋白检测融合蛋白n既检测外源基因产物又检测载体基因产既检测外源基因产物又检测载体基因产物物质粒基因质粒基因A插入基因插入基因B表达表达质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B融合蛋白融合蛋白固相支固相支 持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体125I标记的标记的 抗抗B抗体抗体质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B质粒蛋白质粒蛋白A外源蛋白外源蛋白B固相支固相支 持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体发光，底片曝光发光，底片曝光二、免疫沉淀检测法二、免疫沉淀检测法n1.原理原理n利用抗原利用抗原抗体凝集反应。抗体凝集反应。n用于检测分泌型产物。用于检测分泌型产物。n2.方法方法n把非放射性抗体加到平板培养基中，当把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈沉淀圈”。n对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。诱发）。三、酶联免疫吸附测（三、酶联免疫吸附测（ELISA）nEnzyme-linked immunosorbant assayn1.原理原理n一抗（一抗（primary antibody）与目标分子的特异结合与目标分子的特异结合 n二抗（二抗（secondary antibody）与一抗的特异性结合与一抗的特异性结合 n酶连（酶连（enzyme-linke）n 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。从而推测目标分子的含量。待测基因产物蛋白待测基因产物蛋白一抗一抗二抗二抗酶酶 待测基因产物蛋白待测基因产物蛋白 一抗一抗二抗二抗无色的底物无色的底物有色的产物有色的产物比色观察酶酶 2.ELISA检测的一般步骤检测的一般步骤n（1）固定样品）固定样品n将待测样品加入将待测样品加入96孔微量滴定板孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就）的孔中，干燥后就被固定在孔底。被固定在孔底。孔底孔底（2）一抗结合）一抗结合n加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体一抗一抗（3）二抗结合）二抗结合n加入二抗，与一抗结合后再将未结合的加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。n二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。化物酶、脲酶等）。二抗二抗（4）显色反应）显色反应n加入无色的底物，被二抗上所带的酶催加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。化反应转变成有色物质（或发光）。图图 ELISA assay（5）比色）比色n在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。打印出结果。图图 Safire多功能扫描型酶标仪多功能扫描型酶标仪3.ELISA的局限性的局限性n有效，但准确性稍差（主要取决于一抗有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。的特异性）。n必须与其他方法一起综合考虑。必须与其他方法一起综合考虑。n最好用单克隆抗体（最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）临床检验常用的单抗临床检验常用的单抗四、免疫印迹法（四、免疫印迹法（western blotting）n在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜