高中生物竞赛课件：蛋白质的性质与分离、分析技术.pptx

蛋白质是由氨基酸组成的高分子有机化合物，因此其性质必定有一部分与氨基酸相同或相关，例如两性解离及等电点、紫外吸收性质、呈色反应等等。但是，蛋白质作为高分子化合物，它又表现出与低分子化合物有根本区别的大分子特性，如胶体性、变性和免疫学特性等。蛋白质的性质与分离、分析技术一、蛋白质的分子量二、蛋白质的两性电离与等电点三、蛋白质的变性四、蛋白质的胶体性质五、蛋白质的沉淀反应六、蛋白质的颜色反应 七、蛋白质的含量测定（1）蛋白质的分子量蛋白质的性质与分离、分析技术蛋白质是一类高分子化合物，在溶液中的形状根据不对称常数分为球形、椭圆形、纤维状等。分子量一般为104106道尔顿或更高，通常将分子量低于1万者称为多肽，高于1万者称为蛋白质。当然这种界限并不是很严格的，如胰岛素的分子量为5437，但习惯上称作蛋白质，有时亦称多肽。高分子特性是蛋白质的重要性质，也是蛋白质胶体性、变性和免疫学性质的基础。因此，测定蛋白质分子的大小是蛋白质化学的重要内容。测定蛋白质分子量有超速离心法、凝胶过滤法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、生物质谱法等。1、蛋白质的性质（1）蛋白质的分子量蛋白质的性质与分离、分析技术凝胶过滤法：也称分子排阻/分子筛层析蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子的质量，而是斯托克半径。如果某种蛋白质与一理想的非水化球体具有相同的过柱速度即相同的洗脱体积，则认为这种蛋白质具有与此球体相同的半径，称斯托克半径测定方法：先测几种相对分子质量已知的蛋白质标准物的过柱体积Ve，做Mr的对数与Ve标准曲线图，然后测出待测蛋白质样品的Ve，从标准曲线图中确定样品的Mr1、蛋白质的性质（1）蛋白质的分子量蛋白质的性质与分离、分析技术凝胶过滤法：也称分子排阻/分子筛层析p大分子沿着凝胶颗粒之间的空隙移动，先洗脱出来p小分子进入凝胶颗粒内部，后洗脱出来p常用的填充材料是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶1、蛋白质的性质（1）蛋白质的分子量蛋白质的性质与分离、分析技术SDS-聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳电泳法：聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)p依据：不同蛋白质所带电荷(电荷效应)和大小差异(分子筛效应)pSDS-PAGE：加入十二烷基硫酸钠(SDS)，消除电荷的差异1、蛋白质的性质测出的是亚基的Mr，若待测蛋白质是多亚基的，则需配合使用凝胶过滤法确定整个分子的Mr（2）蛋白质的两性电离与等电点蛋白质的性质与分离、分析技术蛋白质由氨基酸组成。AA分子含有氨基和羧基，既可接受质子，又可释放质子，因此AA是两性电解质。蛋白质分子中除两末端有自由的-NH2和-COOH外，许多AA残基的侧链上有不少可解离基团，如-NH2、-COOH、-OH等，故蛋白质也是两性物质蛋白质与氨基酸一样在纯水溶液和结晶状态中都以两性离子的形式存在，即同一分子中可带有正负两种电荷，羧基带负电而氨基带正电。1、蛋白质的性质（2）蛋白质的两性电离与等电点蛋白质的性质与分离、分析技术蛋白质在溶液中的带电情况主要取决于溶液的pH。使蛋白质所带正负电荷相等，净电荷为零时溶液的pH，称为蛋白质的等电点(isoelectricpoint，pI)。各种蛋白质具有特定的等电点，这与其所含的AA种类和数目有关，即其中酸性和碱性AA的比例及可解离基团的解离度。蛋白质的等电聚焦1、蛋白质的性质（2）蛋白质的两性电离与等电点蛋白质的性质与分离、分析技术一般地说，含酸性AA较多的酸性蛋白，等电点偏酸；含碱性AA较多的碱性蛋白，等电点偏碱。当溶液的pHpI时，蛋白质带负电荷；pH双缩脲法（7）蛋白质含量的测定蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质凯氏定氮法：N在蛋白中的平均含量16%，测可溶性和不溶性蛋白的总蛋白含量蛋白质含量=(总氮含量-无机氮含量)6.25p不能区分蛋白氮和非蛋白氮，计算出的蛋白含量称作粗蛋白含量p系数6.25对某些蛋白质不合适，需要用校正后的系数紫外吸收法：蛋白质（Tyr、Trp和Phe）在280nm左右有强烈的光吸收，测定蛋白质溶液的A280nm和A260nm（准确度不高）蛋白质质量浓度（mg/mL）=1.45A280nm-0.47A260nm（7）蛋白质含量的测定蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质考马斯亮蓝染色法：室温，反应迅速（2min），生成物稳定，测定蛋白质含量的灵敏度较高（ug）（7）蛋白质含量的测定蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质福林-酚试剂法(Lowry法)：测定蛋白质浓度应用最广泛的一种方法。p原理：碱性条件下蛋白质与Cu2+生成复合物，还原磷钼酸-磷钨酸试剂生成蓝色化合物，可用比色法测定。p优点：操作简便、灵敏度高、蛋白质浓度范围25-250g/mLp缺点：此法实际上是蛋白质中酪氨酸和色氨酸与试剂的反应，因此它受蛋白质的氨基酸组成的影响，即不同蛋白质中此两种氨基酸量不同使显色强度有所差异；此外，酚类等一些物质的存在可干扰此法的测定，导致分析的误差。（7）蛋白质含量的测定蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质双缩脲法：在碱性条件下，蛋白质分子中的肽键与Cu2+可生成紫红色的络合物，可用比色法定量。此法简便，受蛋白质氨基酸组成影响小；但灵敏度不高、样品用量大，蛋白质浓度范围为0.5-10mg/mLBCA比色法：在碱性溶液中，蛋白质将Cu2+还原为Cu+再与BCA试剂(4，4-二羧酸-2，2-二喹啉钠)生成紫色复合物，于562nm有最大吸收，强度与蛋白质浓度成正比。优点：单一试剂、终产物稳定，与Lowry法相比几乎没有干扰物质的影响。尤其在TritonX-100、SDS等表面活性剂中也可测定。其灵敏度范围一般在10-1200g/mL免疫学方法(抗原-抗体特异结合)与荧光标记技术相结合，用于研究特异蛋白抗原在细胞内的含量和分布X直接免疫荧光技术(A)：荧光分子与抗体偶联后直接用于免疫标记X间接免疫荧光技术(B)：先将抗体(一抗)与抗原反应，然后加入与荧光分子相偶联的抗第一抗体的抗体(二抗)（7）蛋白质含量的测定蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位分类：免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术、免疫胶体金技术A.免疫胶体金标记技术原理的示意图：细菌蛋白A可与胶体金结合，也可以与抗体(如IgG)的Fc端特异结合。B.免疫胶体金标记膀胱上皮细胞膜蛋白的分布（箭头所指）（7）蛋白质含量的测定蛋白质的性质与分离、分析技术1、蛋白质的性质蛋白质的性质与分离、分析技术2、蛋白质的分离和分析技术1根据蛋白质溶解度不同进行分离2根据蛋白质分子大小进行分离3根据蛋白质带电性质进行分离4根据配体特异性进行分离（1）根据蛋白质溶解度不同进行分离蛋白质的性质与分离、分析技术2、蛋白质的分离和分析技术 利用蛋白质溶解度的差异是分离蛋白质的常用方法之一。影响蛋白质溶解度的主要因素有溶液的pH、离子强度、溶剂的介电常数和温度等。在一定条件下，蛋白质溶解度的差异主要取决于它们的分子结构；如氨基酸组成、极性基团和非极性基团的多少等。因此，恰当地改变这些影响因素，可选择性地造成其溶解度的不同而分离。盐析：中性盐(硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠)p硫酸铵分段盐析效果较优，不易引起蛋白质变性p沉淀分离后需除盐a、透析法：蛋白质溶液装入透析袋内(玻璃纸)，用缓冲液进行透析，不断更换缓冲液(时间长，低温进行)b、柱层析：葡聚糖凝胶G-25或G-50（1）根据蛋白质溶解度不同进行分离蛋白质的性质与分离、分析技术2、蛋白质的分离和分析技术等电点沉淀法：等电点状态时颗粒之间的静电斥力最小，溶解度最小，各蛋白质等电点不同，调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀（1）根据蛋白质溶解度不同进行分离蛋白质的性质与分离、分析技术2、蛋白质的分离和分析技术低温有机溶剂沉淀法：乙醇或丙酮去除蛋白质的水膜，同时，将pH调到蛋白质的等电点使之沉淀，蛋白质较易变性(分离较稳定的蛋白质，低温进行)（2）根据蛋白质分子大小进行分离蛋白质的性质与分离、分析技术2、蛋白质的分离和分析技术透析与超滤法p透析：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质(无机盐、单糖和氨基酸)分开p超滤法：利用高压力或离心力，迫使水和其他小的溶质分子通过半透膜，蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的滤膜截留不同Mr的蛋白质（2）根据蛋白质分子大小进行分离蛋白质的性质与分离、分析技术2、蛋白质的分离和分析技术凝胶过滤法：也称分子排阻/分子筛层析p大分子沿着凝胶颗粒之间的空隙移动，先洗脱出来p小分子进入凝胶颗粒内部后洗脱出来p常用的填充材料是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶（3）根据蛋白质带电性质进行分离蛋白质的性质与分离、分析技术2、蛋白质的分离和分析技术电泳法：聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)p依据：不同蛋白质所带电荷(电荷效应)和大小差异(分子筛效应)（3）根据蛋白质带电性质进行分离蛋白质的性质与分离、分析技术2、蛋白质的分离和分析技术电泳法：聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)p等 电 聚 焦 电 泳：在PAGE中加入一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，蛋白到达各自等电点的pH位置停止（3）根据蛋白质带电性质进行分离蛋白质的性质与分离、分析技术2、蛋白质的分离和分析技术电 泳 法：聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳(PAGE)p双向电泳：先等电聚焦电泳，再将凝胶条或微型凝胶柱置于垂直凝胶板的上方，进行SDS-PAGE电泳（3）根据蛋白质带电性质进行分离蛋白质的性质与分离、分析技术2、蛋白质的分离和分析技术离子交换层析法p阳离子交换剂：羧甲基纤维素(CM-纤维素)p阴离子交换剂：二乙氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素)（4）根据配体特异性进行分离蛋白质的性质与分离、分析技术2、蛋白质的分离和分析技术亲和层析法：将配体共价结合在层析柱中的固体材料上，蛋白质混合物流经层析柱时，目标蛋白与配体结合被层析柱中的固体材料截留，非目标蛋白则不能与层析柱中的固体材料结合。先洗脱除去杂蛋白，再用含游离配体的洗脱剂将目标蛋白替换下来