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中药的含量测定1第1页，此课件共92页哦第一节第一节 含量测定的目的与意义含量测定的目的与意义 中药的含量测定与化药有很大区别中药的含量测定与化药有很大区别中药组成复杂，产生疗效的不是某单一成分，中药组成复杂，产生疗效的不是某单一成分，检测任何检测任何一种活性成分均不能反映中药的整体疗效一种活性成分均不能反映中药的整体疗效。但是借鉴化药质量控制模式，测定某一味药味的有效成但是借鉴化药质量控制模式，测定某一味药味的有效成分、活性成分、指标性成分的含量的方法，对于分、活性成分、指标性成分的含量的方法，对于控制中控制中药质量起着不可替代的重要作用药质量起着不可替代的重要作用。通过测定中药中有效成分、毒性成分或某些指标性成分的通过测定中药中有效成分、毒性成分或某些指标性成分的含量来含量来衡量其制剂工艺的稳定性和中药材的质量优劣衡量其制剂工艺的稳定性和中药材的质量优劣，以保证中药的质量，达到临床用药安全、有效的目的。以保证中药的质量，达到临床用药安全、有效的目的。2第2页，此课件共92页哦第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 样品处理的主要作用有：样品处理的主要作用有：将被测成分有效地从样品中释放出来，并制成便于分将被测成分有效地从样品中释放出来，并制成便于分析测定的稳定试样。析测定的稳定试样。除去杂质、纯化样品，以提高分析方法的重现性和准确除去杂质、纯化样品，以提高分析方法的重现性和准确度。度。富集浓缩或进行衍生化，以测定低含量被测成分。衍生富集浓缩或进行衍生化，以测定低含量被测成分。衍生化不仅可提高检测器的灵敏度，还可以提高方法的选择性。化不仅可提高检测器的灵敏度，还可以提高方法的选择性。使试样的形式及所用溶剂符合分析测定的要求。使试样的形式及所用溶剂符合分析测定的要求。3第3页，此课件共92页哦第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 一、样品的粉碎一、样品的粉碎 1.1.目的目的：是保证含量测定所取样品均匀而有代表性，提高测定结果的精是保证含量测定所取样品均匀而有代表性，提高测定结果的精密度和准确度；密度和准确度；是使样品中的被测组分能更快地完全提取出来。是使样品中的被测组分能更快地完全提取出来。2.2.粉碎时粉碎时注意事项注意事项：不要粉碎得过细。样品粉碎得过细，在样品提取时，会造成过滤困难，不要粉碎得过细。样品粉碎得过细，在样品提取时，会造成过滤困难，因此可视实际情况进行粉碎过筛。因此可视实际情况进行粉碎过筛。避免污染样品。在粉碎样品时，要尽量避免由于设备的磨损或不干净等原避免污染样品。在粉碎样品时，要尽量避免由于设备的磨损或不干净等原因而玷污样品，因而玷污样品，防止粉尘飞散或挥发性成分的损失。防止粉尘飞散或挥发性成分的损失。过筛时，通不过筛孔的部分颗粒决不能丢弃，必须反复粉碎或碾磨，让其过筛时，通不过筛孔的部分颗粒决不能丢弃，必须反复粉碎或碾磨，让其全部通过筛孔。全部通过筛孔。4第4页，此课件共92页哦第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 二、样品的提取二、样品的提取 对于中药材和固体制剂样品，在粉碎后，取粉末适量精密称定，对于中药材和固体制剂样品，在粉碎后，取粉末适量精密称定，首先用溶剂进行提取，使被测组分和某些共存组分从中溶解出来首先用溶剂进行提取，使被测组分和某些共存组分从中溶解出来（前者必须完全溶出），与滤渣分离后，再对被测组分进行含量测（前者必须完全溶出），与滤渣分离后，再对被测组分进行含量测定。定。常见的提取方法常见的提取方法：Y 冷浸法冷浸法 Y 回流提取法回流提取法 Y 连续回流提取法连续回流提取法 Y 超声提取法超声提取法 Y 超临界流体提取法超临界流体提取法5第5页，此课件共92页哦第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 三、样品的分离净化三、样品的分离净化 （一）沉淀法（一）沉淀法（二）蒸馏法（二）蒸馏法 （三）液一液萃取法（三）液一液萃取法（LLELLE）（四）色谱法（四）色谱法 6第6页，此课件共92页哦第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理（四）色谱法（四）色谱法 吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱皆可作为中药制剂分析中的吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱皆可作为中药制剂分析中的净化分离方法，其操作方式有柱色谱，薄层色谱和纸色谱。净化分离方法，其操作方式有柱色谱，薄层色谱和纸色谱。其中经典微柱色谱，也称固相萃取或液其中经典微柱色谱，也称固相萃取或液固萃取（固萃取（LSELSE）具有设备简）具有设备简单，使用方便，快速，净化效率较高而最常用，将在此做一简介。单，使用方便，快速，净化效率较高而最常用，将在此做一简介。LSE LSE通常是指样品溶液加到装有合适固定相（净化剂）的长通常是指样品溶液加到装有合适固定相（净化剂）的长5515cm15cm，内径，内径0.50.51cm1cm的色谱柱中，将被测成分保留于柱上，洗去杂质的色谱柱中，将被测成分保留于柱上，洗去杂质后，再洗脱被测成分进行测定，或者是使杂质强烈保留于柱上，直接后，再洗脱被测成分进行测定，或者是使杂质强烈保留于柱上，直接洗脱被测成分进行测定。用这种选择性好而柱效较低的方法进行样品洗脱被测成分进行测定。用这种选择性好而柱效较低的方法进行样品的净化分离，尤其适用于一类总成分的含量测定，也可将色谱柱流出的净化分离，尤其适用于一类总成分的含量测定，也可将色谱柱流出的样品进一步用的样品进一步用GCGC、HPLCHPLC、TCLTCL分离后测定。分离后测定。LSE LSE的常用净化剂（填料）有氧化铝、氧化镁、硅藻土、硅胶、的常用净化剂（填料）有氧化铝、氧化镁、硅藻土、硅胶、活性炭、大孔树脂离子交换树脂、键合相硅胶活性炭、大孔树脂离子交换树脂、键合相硅胶C8C8、C18C18、聚酰胺等。、聚酰胺等。视其性质可分为亲脂型、亲水型和离子交换型填料。视其性质可分为亲脂型、亲水型和离子交换型填料。7第7页，此课件共92页哦第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 硅胶、氧化铝等：硅胶、氧化铝等：它们是传统的吸附剂，多以它们是传统的吸附剂，多以0.070.070.15mm0.15mm(200(200100100目目)的颗粒的颗粒1 15g5g用于样品的净化处理，其作用机制为溶质在吸附剂表面的极用于样品的净化处理，其作用机制为溶质在吸附剂表面的极性吸附作用。通常是当性吸附作用。通常是当溶于有机溶剂的样品溶于有机溶剂的样品加到柱上时非极性或加到柱上时非极性或低低极性的杂质先被洗出极性的杂质先被洗出色谱柱，再用适当极性的溶剂洗脱被测成分，色谱柱，再用适当极性的溶剂洗脱被测成分，而强极性的杂质仍保留在柱上。而强极性的杂质仍保留在柱上。氧化铝能将黄酮类吸附在柱上，用于生物碱、苷类等的测定。例如氧化铝能将黄酮类吸附在柱上，用于生物碱、苷类等的测定。例如用法（吸收系数法）用法（吸收系数法）硅胶适合于分离中性或酸性化合物，强烈保留碱性化合物。若把样品提硅胶适合于分离中性或酸性化合物，强烈保留碱性化合物。若把样品提取液加到柱上，依次用极性由小到大的溶剂洗脱，则可以将杂质和被测成分取液加到柱上，依次用极性由小到大的溶剂洗脱，则可以将杂质和被测成分分离。分离。8第8页，此课件共92页哦键合相硅胶：键合相硅胶：十八烷基键合相硅胶（简称十八烷基键合相硅胶（简称C18C18或或ODSODS）是常用的固体萃取剂，其次有烷基、）是常用的固体萃取剂，其次有烷基、苯基、氰基键合相硅胶，可用来分开脂溶性和水溶性杂质或成分。也常用于苯基、氰基键合相硅胶，可用来分开脂溶性和水溶性杂质或成分。也常用于萃取，纯化水基质体液中憎水性药物。该类萃取，纯化水基质体液中憎水性药物。该类LSELSE的一般操作程序为：的一般操作程序为：1)1)柱的活化。用柱的活化。用2ml2ml甲醇冲洗以润湿键合相和除去杂质，再用甲醇冲洗以润湿键合相和除去杂质，再用0.50.5毫升水洗去毫升水洗去柱中的甲醇。柱中的甲醇。2)2)上样。上样。3)3)清洗。用清洗。用2 25ml5ml的的水水清洗以清洗以除去弱保留的亲水成分除去弱保留的亲水成分，如无机盐、氨基酸、，如无机盐、氨基酸、亲水的蛋白质、糖以及中等保留成分的极性化合物、低肽等。亲水的蛋白质、糖以及中等保留成分的极性化合物、低肽等。4)4)洗脱。用洗脱。用2 25ml5ml甲醇或甲醇甲醇或甲醇-水洗脱水洗脱大分子的肽、甾体、较亲脂的药物等强大分子的肽、甾体、较亲脂的药物等强保留的待测组分。保留的待测组分。第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 9第9页，此课件共92页哦大孔树脂：它可分为极性和非极性型大孔树脂：它可分为极性和非极性型 极性极性 丙烯酰胺聚合物丙烯酰胺聚合物;非极性非极性 苯乙烯和二乙烯苯的共聚物苯乙烯和二乙烯苯的共聚物.其吸附性质与烷基键合相硅胶相似，通过疏水作用对非极性其吸附性质与烷基键合相硅胶相似，通过疏水作用对非极性水溶性成份有吸附力。例如在测定复方归芪剂中的黄芪甲苷时，水溶性成份有吸附力。例如在测定复方归芪剂中的黄芪甲苷时，用大孔树脂除去水溶性的多糖杂质，再用用大孔树脂除去水溶性的多糖杂质，再用30%30%乙醇洗脱黄芪甲苷。乙醇洗脱黄芪甲苷。大孔树脂的主要特点是表面积极大，传质速率较高和具有不同的大孔树脂的主要特点是表面积极大，传质速率较高和具有不同的极性及适于吸附较大分子。极性及适于吸附较大分子。树脂在使用前需要前处理：用甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂树脂在使用前需要前处理：用甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂除去杂质，有时还需用酸、碱清洗。该填料用量常为除去杂质，有时还需用酸、碱清洗。该填料用量常为1 12g2g，有，有时也用时也用100100150mg150mg来萃取血、尿中药物，操作程序类似来萃取血、尿中药物，操作程序类似ODSODS填料。填料。第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 10第10页，此课件共92页哦第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 聚酰胺：聚酰胺：它是常用的有机吸附剂，主要通过与溶质形成它是常用的有机吸附剂，主要通过与溶质形成氢键而产生吸附作用。氢键而产生吸附作用。常用于含酚、酸、醌类药物样品液的净化常用于含酚、酸、醌类药物样品液的净化分离，分离，如测定黄酮时，用样品的乙醇提取液上柱，水如测定黄酮时，用样品的乙醇提取液上柱，水洗去部分杂质，以洗去部分杂质，以95%95%乙醇洗脱总黄酮后测定。乙醇洗脱总黄酮后测定。11第11页，此课件共92页哦第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 硅藻土、纤维素：硅藻土、纤维素：它它们们为为常常用用的的亲亲水水型型填填料料，其其原原理理为为分分配配作作用用。填填料料作作为为支支持持剂剂，多多以以水水基基质质液液作作为为固固定定相相，与与水水不不混混溶溶的的有有机机溶溶剂剂为为流流动动相相，较较亲亲脂脂的的成成分分从从固固定定相相转转移移到到流流动动相相，而而被被洗洗脱脱，达达到到萃萃取取的的目目的的。其其萃萃取取率率较较高高（一一般般大大于于80%80%），无无浓浓集集作作用用，萃萃取取液液较较纯纯净净，但但洗洗脱脱剂剂用用量量较较大大（一一般般大大于于5ml5ml）硅硅藻藻土土柱柱则则用用干干柱柱直直接接上上样样，柱柱可可再再生生。常常见见牌牌号号为为ExtretutExtretut。纤纤维维素素柱柱的的使使用用与与硅硅藻藻土土柱柱相相似。似。12第12页，此课件共92页哦离子交换树脂：离子交换树脂：憎水基质的离子交换树脂兼有离子交换憎水基质的离子交换树脂兼有离子交换剂及大孔树脂的一些性质，所以对于在水中剂及大孔树脂的一些性质，所以对于在水中溶解度不大的药物、洗脱剂中需含一定量的溶解度不大的药物、洗脱剂中需含一定量的有机溶剂。有机溶剂。离子交换树脂柱可用于除去样品中的离子，离子交换树脂柱可用于除去样品中的离子，防止组分分解，更常用于萃取样品液中可离解化防止组分分解，更常用于萃取样品液中可离解化合物。合物。第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 13第13页，此课件共92页哦第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 此外，近年来发展起来的固相微萃此外，近年来发展起来的固相微萃取取(Solid-Phase microextraction,(Solid-Phase microextraction,SPME)SPME)和液相微萃取和液相微萃取(Liquid-Phase(Liquid-Phase microextraction,LPME)microextraction,LPME)技术有良好的技术有良好的应用前景。应用前景。SPMESPME是一种无溶剂的萃取技是一种无溶剂的萃取技术，取样方式有直接取样和顶空取样。术，取样方式有直接取样和顶空取样。14第14页，此课件共92页哦（五）消化法五）消化法 对样品进行有机破坏，常用于中药制剂中重金属的检查。对样品进行有机破坏，常用于中药制剂中重金属的检查。常用的破坏方法有湿法消化和干法消化法。常用的破坏方法有湿法消化和干法消化法。湿法消化：根据所用试剂不同，下面介绍三种常见的消化方法。湿法消化：根据所用试剂不同，下面介绍三种常见的消化方法。（1 1）硝酸）硝酸高氯酸法高氯酸法 该法破坏能力强，反应较激烈，故进行破坏时，该法破坏能力强，反应较激烈，故进行破坏时，必须严密注意切勿将容器中的溶液蒸干，以免发生爆炸。本法适用于血，必须严密注意切勿将容器中的溶液蒸干，以免发生爆炸。本法适用于血，尿、组织等生物样品和含动植物药制剂的破坏，经破坏后所得无机金属尿、组织等生物样品和含动植物药制剂的破坏，经破坏后所得无机金属离子均为高价态，本法对含氮杂环类有机物破坏不够完全。离子均为高价态，本法对含氮杂环类有机物破坏不够完全。（2 2）硝酸）硝酸硫酸法硫酸法 该法适用于大多数有机物质的破坏，无机该法适用于大多数有机物质的破坏，无机金属离子均氧化成高价态，与硫酸形成不溶性硫酸盐的金属离子金属离子均氧化成高价态，与硫酸形成不溶性硫酸盐的金属离子的测定，不宜采有此法。的测定，不宜采有此法。第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 15第15页，此课件共92页哦第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理（3 3）硫酸）硫酸硫酸盐法硫酸盐法 本法所用硫酸盐为硫酸钾或无水硫酸纳，加入硫酸本法所用硫酸盐为硫酸钾或无水硫酸纳，加入硫酸盐的目的是为了提高硫酸的沸点，以使样品破坏加速完盐的目的是为了提高硫酸的沸点，以使样品破坏加速完全。同时防止硫酸在加热过程中过早地分解为全。同时防止硫酸在加热过程中过早地分解为SO3SO3而损而损失。经本法破坏所得金属离子，多为低价态。本法常用失。经本法破坏所得金属离子，多为低价态。本法常用于含砷或锑的有机样品的破坏，破坏后得到三价砷或锑。于含砷或锑的有机样品的破坏，破坏后得到三价砷或锑。湿法消化所用的仪器，一般为硅玻璃或硼玻璃制成的湿法消化所用的仪器，一般为硅玻璃或硼玻璃制成的凯氏瓶（直火加热）或聚四氟乙烯消化罐（烘箱中加热）。凯氏瓶（直火加热）或聚四氟乙烯消化罐（烘箱中加热）。所用试剂应为优级纯，水应为去离子水或高纯水，同时必所用试剂应为优级纯，水应为去离子水或高纯水，同时必须按相同条件进行空白实验校正。操作时应在通风橱内进须按相同条件进行空白实验校正。操作时应在通风橱内进行。行。16第16页，此课件共92页哦第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 干法消化干法消化 本法是将有机物灼烧灰化以达分解的目的，将适量样品置于瓷本法是将有机物灼烧灰化以达分解的目的，将适量样品置于瓷坩锅、镍坩锅或铂坩埚中，常加无水坩锅、镍坩锅或铂坩埚中，常加无水Na2CO3Na2CO3或轻质或轻质MgOMgO等以助灰化，等以助灰化，混匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高温炉中灼烧，混匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高温炉中灼烧，使其灰化完全即可。本法不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等，）使其灰化完全即可。本法不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等，）有机样品的破坏。有机样品的破坏。应用本法时要注意以下几个问题：应用本法时要注意以下几个问题：1 1）加热灼烧时，控制温度在）加热灼烧时，控制温度在420420以下，以免某些被测金属化合以下，以免某些被测金属化合物的挥发。物的挥发。2 2）灰化完全与否，直接影响测定结果的准确度。如欲检查灰化是否）灰化完全与否，直接影响测定结果的准确度。如欲检查灰化是否完全，可将灰分放冷后，加入稍过量的稀完全，可将灰分放冷后，加入稍过量的稀HCl-HCl-水（水（1:31:3）或硝酸）或硝酸-水水（1:31:3）溶液，振摇。若呈色或有不溶有机物，可于水浴上将溶液蒸干，）溶液，振摇。若呈色或有不溶有机物，可于水浴上将溶液蒸干，并用小火炭化后，再行灼烧。并用小火炭化后，再行灼烧。3 3）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但此时切勿弃去。）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但此时切勿弃去。17第17页，此课件共92页哦第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法|分类重量分析和滴定分析。分类重量分析和滴定分析。|化学分析法所用仪器简单，结果准确。化学分析法所用仪器简单，结果准确。|主要用于测定制剂中含量较高的一些成分及含主要用于测定制剂中含量较高的一些成分及含矿物药制剂中的无机成分，如总生物碱类、总酸类、矿物药制剂中的无机成分，如总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药制剂等。总皂苷及矿物药制剂等。|化学分析法有一定的局限性，其灵敏度低，操作繁化学分析法有一定的局限性，其灵敏度低，操作繁琐、耗时长，专属性不高，对于微量成分准确性不理琐、耗时长，专属性不高，对于微量成分准确性不理想。想。18第18页，此课件共92页哦第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（一）重量分析法（一）重量分析法 重量法可分为挥发法、萃取法和沉淀法。重量法可分为挥发法、萃取法和沉淀法。1 1、挥发法可测定具有挥发性或能定量转化为挥发性物质的组分含量。如：、挥发法可测定具有挥发性或能定量转化为挥发性物质的组分含量。如：供试品的干燥失重测定；供试品的干燥失重测定；水分测定均属挥发法；水分测定均属挥发法；中药制剂分析中灰分中药制剂分析中灰分及炽灼残渣的测定等。及炽灼残渣的测定等。2 2、萃取法是根据被测组分在互不相溶的两相中溶解度的不同，达到、萃取法是根据被测组分在互不相溶的两相中溶解度的不同，达到分离的目的。如分离的目的。如冰硼散中冰片的含量测定；冰硼散中冰片的含量测定；地奥心血康胶囊中甾体地奥心血康胶囊中甾体总皂苷含量测定；总皂苷含量测定；昆明山海棠片中总生物碱的含量测定；昆明山海棠片中总生物碱的含量测定；甘草浸膏甘草浸膏中甘草酸的含量测定即采用萃取法。中甘草酸的含量测定即采用萃取法。3 3、沉淀法是将被测组分定量转化为难溶化合物，测定其含量、沉淀法是将被测组分定量转化为难溶化合物，测定其含量的方法，适用于制剂中纯度较高的成分。如的方法，适用于制剂中纯度较高的成分。如西瓜霜润喉片中西西瓜霜润喉片中西瓜霜的含量测定；瓜霜的含量测定；苦参片中苦参总碱的含量测定；苦参片中苦参总碱的含量测定；复方元胡复方元胡注射液总碱的测定。注射液总碱的测定。19第19页，此课件共92页哦第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（二）滴定分析法二）滴定分析法 滴定分析法分为酸碱滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法和氧化还原滴定分析法分为酸碱滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法和氧化还原滴定法。滴定法。1 1、酸碱滴定法、酸碱滴定法 适用于测定中药制剂中所含有的生物碱、有机酸、内酯类等酸、适用于测定中药制剂中所含有的生物碱、有机酸、内酯类等酸、碱组分的含量。碱组分的含量。直接滴定：对于直接滴定：对于K KC10C10-8-8的酸、碱组分，可在水溶液中直的酸、碱组分，可在水溶液中直接滴定。如：止喘灵注射液中总生物碱的含量测定、颠茄酊中生接滴定。如：止喘灵注射液中总生物碱的含量测定、颠茄酊中生物碱的含量测定。物碱的含量测定。间接滴定或非水滴定法：如大山楂丸中总酸性物质的含量测定、间接滴定或非水滴定法：如大山楂丸中总酸性物质的含量测定、草乌注射液中生物碱的含量测定等。草乌注射液中生物碱的含量测定等。2 2、沉淀滴定法、沉淀滴定法 主要用于生物碱、生物碱的氢卤酸盐及含卤素的其他有机成分的含量测主要用于生物碱、生物碱的氢卤酸盐及含卤素的其他有机成分的含量测定。定。20第20页，此课件共92页哦第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法3 3、配位滴定法、配位滴定法 包括包括EDTAEDTA法和硫氰酸铵法，在中药制剂分析中，用以测法和硫氰酸铵法，在中药制剂分析中，用以测定鞣质、生物碱及含定鞣质、生物碱及含Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+、Fe3+Fe3+、Hg2+Hg2+等矿物类制剂等矿物类制剂的含量。如的含量。如万氏牛黄清心丸等的含量测定就采用硫氰酸铵万氏牛黄清心丸等的含量测定就采用硫氰酸铵法；法；牛黄解毒片中石膏的含量测定。牛黄解毒片中石膏的含量测定。4 4、氧化还原滴定法、氧化还原滴定法 适用于测定具有氧化还原性的物质，如含酚类、糖类及适用于测定具有氧化还原性的物质，如含酚类、糖类及矿物药矿物药FeFe、AsAs等成分的中药制剂。如等成分的中药制剂。如磁朱丸中全铁的含量磁朱丸中全铁的含量测定采用铈量法；测定采用铈量法；牛黄解毒片中雄黄的含量测定；牛黄解毒片中雄黄的含量测定；丹皮丹皮酚注射液中丹皮酚的含量测。酚注射液中丹皮酚的含量测。21第21页，此课件共92页哦第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法二、可见一紫外分光光度法二、可见一紫外分光光度法 该法是中药及其制剂含量测定的一种常该法是中药及其制剂含量测定的一种常用方法用方法,具有灵敏度高，精度好和操作简便等具有灵敏度高，精度好和操作简便等优点。优点。该法要求被测成分本身或其显色产物对可见该法要求被测成分本身或其显色产物对可见紫外光具有选择性吸收。按测定波长数目不同分为紫外光具有选择性吸收。按测定波长数目不同分为单波长光谱法和多波长光谱法。单波长光谱法和多波长光谱法。22第22页，此课件共92页哦第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（一）单波长光谱法（一）单波长光谱法分类分类方法方法特点特点吸收系数法吸收系数法测定所配供试品溶液在规定波长的吸测定所配供试品溶液在规定波长的吸收度，根据被测成分的吸收系数收度，根据被测成分的吸收系数（E E1%1%1cm1cm）计算其含量）计算其含量对仪器要求高，使用该法时，对仪器要求高，使用该法时，应注意仪器波长、空白吸收的校应注意仪器波长、空白吸收的校正，吸收度准确度的检定和杂散正，吸收度准确度的检定和杂散光的检查光的检查无需对照品，方法简便无需对照品，方法简便对照品比较法对照品比较法在同样条件下配制对照品溶液和供试在同样条件下配制对照品溶液和供试溶液，且使前者中所含被测成分的量溶液，且使前者中所含被测成分的量应为后者中被测成分的量的应为后者中被测成分的量的100%100%10%10%，用规定波测定二者的吸收度，则可，用规定波测定二者的吸收度，则可计算出供试品中被测成分的浓度或含计算出供试品中被测成分的浓度或含量量对仪器要求较高对仪器要求较高标准曲线法标准曲线法配制一系列不同浓度的对照品溶液配制一系列不同浓度的对照品溶液（常为（常为5 5个），在相同条件下分别测定个），在相同条件下分别测定吸收度，绘制吸收度，绘制A-CA-C曲线，或求出其回归曲线，或求出其回归直线方程（相关系数直线方程（相关系数r0.999r0.999），即），即得标准曲线。在相同条件下，测定供得标准曲线。在相同条件下，测定供试品溶液的吸收度，就可求得供试品试品溶液的吸收度，就可求得供试品中被测成分的浓度或含量。中被测成分的浓度或含量。本法对仪器的精度要求不高，本法对仪器的精度要求不高，有时标准曲线不通过原点，只要有时标准曲线不通过原点，只要重现性好也可使用重现性好也可使用该法在比色法中最常用该法在比色法中最常用23第23页，此课件共92页哦第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（二）多波长光谱法（计算分光光度法）（二）多波长光谱法（计算分光光度法）供试品溶液中若有多种（两种或两种以上）组分共供试品溶液中若有多种（两种或两种以上）组分共存，其紫外光谱彼此发生不同程度的重叠时，则可通过存，其紫外光谱彼此发生不同程度的重叠时，则可通过测定多种波长处的吸收度，根据吸收度的加和性，采用测定多种波长处的吸收度，根据吸收度的加和性，采用适当的数学处理方式进行多组分的同时测定，或者用其适当的数学处理方式进行多组分的同时测定，或者用其排除共存组分干扰，测定其中的某个组分。这就属于多排除共存组分干扰，测定其中的某个组分。这就属于多波长光谱法的范畴。波长光谱法的范畴。下面简要介绍用多波长法测定存在光谱干扰的多下面简要介绍用多波长法测定存在光谱干扰的多组分样品中某个组分的一些技术：组分样品中某个组分的一些技术：双波长法（包括等双波长法（包括等吸收点法和系数倍率法）、三波长法、导数光谱法吸收点法和系数倍率法）、三波长法、导数光谱法和差示光谱法等。和差示光谱法等。24第24页，此课件共92页哦第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法优点是可省去或简化样品预处理步骤，测定组成已知的复杂优点是可省去或简化样品预处理步骤，测定组成已知的复杂样品，但是使用该法应慎重。样品，但是使用该法应慎重。首先因为中药及其制剂的供试品溶液往往组成复杂，甚首先因为中药及其制剂的供试品溶液往往组成复杂，甚至干扰组分或阴性空白样品的变动性大，因此，使得其方法至干扰组分或阴性空白样品的变动性大，因此，使得其方法的适应性差，而只适应于同批样品或内控应用，目前很少在的适应性差，而只适应于同批样品或内控应用，目前很少在药典和新药报批中使用多波长法作为中药制剂含量测定方法。药典和新药报批中使用多波长法作为中药制剂含量测定方法。再者，当测定的吸收度处在吸收曲线的陡峭部位时，波长的再者，当测定的吸收度处在吸收曲线的陡峭部位时，波长的微小变动可能对测定结果造成显著的偶然误差。微小变动可能对测定结果造成显著的偶然误差。还有在实际工作中，由于测试条件的变化，仪器精度与还有在实际工作中，由于测试条件的变化，仪器精度与性能的限制，多波长法不用吸收系数法，而采用标准品对比性能的限制，多波长法不用吸收系数法，而采用标准品对比的方法（常用标准曲线法）来进行样品的测定。的方法（常用标准曲线法）来进行样品的测定。25第25页，此课件共92页哦第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法三、薄层扫描法三、薄层扫描法 薄层扫描法是以薄层色谱法为基础发展起来的薄层扫描法是以薄层色谱法为基础发展起来的薄层色谱组分原位分析方法及薄层色谱的记录方法，薄层色谱组分原位分析方法及薄层色谱的记录方法，又称薄层色谱扫描法（又称薄层色谱扫描法（TLCS），相应仪器称为薄层扫），相应仪器称为薄层扫描仪（描仪（Thin Layer Chromatogram Scanner）。）。薄层扫描法是用一定波长的光照射在薄层板上，薄层扫描法是用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中吸收紫外光或可见光的斑点，或经激对薄层色谱中吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、杂质检查或含量图谱及积分数据用于药品的鉴别、杂质检查或含量测定。测定。26第26页，此课件共92页哦第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（一）基本原理（一）基本原理 薄层扫描法是指薄层色谱斑点的色谱扫描，薄薄层扫描法是指薄层色谱斑点的色谱扫描，薄层色谱扫描是指固定波长，斑点移动，测定层色谱扫描是指固定波长，斑点移动，测定A-lA-l或或F-F-l l曲线。根据薄层扫描的测定方式分为曲线。根据薄层扫描的测定方式分为薄层吸收扫薄层吸收扫描法描法和和薄层荧光扫描法薄层荧光扫描法二种方法。二种方法。27第27页，此课件共92页哦第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法1 1、薄层吸收扫描法、薄层吸收扫描法 基本原理：基本原理：Kubelka-MunkKubelka-Munk理论及曲线。由于薄层板存在明理论及曲线。由于薄层板存在明显的散射现象，斑点中物质的浓度与吸光度的关系需用显的散射现象，斑点中物质的浓度与吸光度的关系需用Kubelka-MunkKubelka-Munk理论及曲线来描述。理论及曲线来描述。Kubelka-MunkKubelka-Munk理论以斑点的理论以斑点的相对相对反射率反射率和相对透光率计算薄层色谱斑点的吸光度，说明了固和相对透光率计算薄层色谱斑点的吸光度，说明了固定相的散射参数定相的散射参数SXSX对斑点中物质的浓度与吸光度间关系的影响，对斑点中物质的浓度与吸光度间关系的影响，获得不同散射参数获得不同散射参数SXSX时斑点的时斑点的A-KXA-KX理论曲线，即理论曲线，即Kubelka-MunkKubelka-Munk曲线。曲线。光源：钨灯和氘灯；光源：钨灯和氘灯；灵敏度：在灵敏度：在200-800nm200-800nm波长范围内选择合适波长进行测定，其灵敏波长范围内选择合适波长进行测定，其灵敏度可达度可达ngng级；级；适用范围：适用于在可见、紫外区有吸收的物质，及通过色谱适用范围：适用于在可见、紫外区有吸收的物质，及通过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分。前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分。28第28页，此课件共92页哦2 2、薄层荧光扫描法、薄层荧光扫描法 基本原理：基本原理：F=2.3KF=2.3KI I。ECLECL或或F=KCF=KC 光源：氙灯或汞灯。光源：氙灯或汞灯。灵敏度：最低可测到灵敏度：最低可测到10-50pg10-50pg。适用范围：适合于本身具有荧光或经过适当处理后可适用范围：适合于本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的物质的测定。产生荧光的物质的测定。Kubelka-Munk Kubelka-Munk理论不适用于薄层荧光扫描，无需进行曲线理论不适用于薄层荧光扫描，无需进行曲线校直。用薄层荧光扫描进行定量分析时，用斑点荧光强度的积分校直。用薄层荧光扫描进行定量分析时，用斑点荧光强度的积分值（色谱峰峰面积）与斑点中组分的含量代替上式中值（色谱峰峰面积）与斑点中组分的含量代替上式中F F与与C C 进行进行运算。运算。第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法29第29页，此课件共92页哦（二）薄层色谱的规范化操作（二）薄层色谱的规范化操作1 1、仪器与材料、仪器与材料薄层板；薄层板；涂布器；涂布器；点样器材；点样器材；展开箱展开箱（层析缸）（层析缸）显色与检测仪器显色与检测仪器2 2、操作方法、操作方法薄层板的制备；薄层板的制备；点样；点样；展开；展开；检测；检测；第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法30第30页，此课件共92页哦第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（三）定量分析方法（三）定量分析方法1 1、方法学考察、方法学考察 新建薄层扫描定量方法必须进行方法考察，新建薄层扫描定量方法必须进行方法考察，以说明新建方法的可靠性，考察的内容有工作以说明新建方法的可靠性，考察的内容有工作曲线、定量结果的精密度及准确度、统计检验曲线、定量结果的精密度及准确度、统计检验等内容。等内容。31第31页，此课件共92页哦（1 1）工作曲线）工作曲线 检查所选择的散射参数检查所选择的散射参数SXSX值是否适宜。值是否适宜。SXSX值适宜则工作曲值适宜则工作曲线被校直为直线，否则，调整线被校直为直线，否则，调整SXSX值再校正，直至在一定点样量范围值再校正，直至在一定点样量范围内工作曲线成直线为止。内工作曲线成直线为止。考察工作曲线是否过原点，以便确定采用一点法或二点法定量。考察工作曲线是否过原点，以便确定采用一点法或二点法定量。确定点样量的线性范围。既使采用曲线校直，也只是在确定点样量的线性范围。既使采用曲线校直，也只是在一定点样量范围内工作曲线为直线，因此需确定点样量的上、一定点样量范围内工作曲线为直线，因此需确定点样量的上、下限。下限。为降低定量误差，最好调整点样量，使供试品与对照品的峰面积相接为降低定量误差，最好调整点样量，使供试品与对照品的峰面积相接近。近。为了克服薄层板间差异，外标法及内标法均应采用随行标准法，为了克服薄层板间差异，外标法及内标法均应采用随行标准法，即标准溶液与供试品溶液交叉点在同一块薄层板上。即标准溶液与供试品溶液交叉点在同一块薄层板上。第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法32第32页，此课件共92页哦第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（2 2）精密度考察）精密度考察 取同一供试品溶液，在同一块薄层板上以相同取同一供试品溶液，在同一块薄层板上以相同点样量平行点点样量平行点5 5点以上，展开后测定其峰面积，求算点以上，展开后测定其峰面积，求算相对标准差（相对标准差（RSDRSD），作为衡量定量分析结果精密度），作为衡量定量分析结果精密度的指标。的指标。RSDRSD应小于应小于4%4%。式中：为式中：为n n次测量的平均值，次测量的平均值，S S为标准差。为标准差。33第33页，此课件共92页哦第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（3 3）准确度考察）准确度考察 回收率是衡量定量方法准确度的指标，常用加回收率是衡量定量方法准确度的指标，常用加样回收率（样回收率（R R）来衡量，其值应在）来衡量，其值应在95-105%95-105%之间，测之间，测量数据一般为量数据一般为5-65-6个。个。将加入纯品的试样溶液、供试品溶液及标准溶将加入纯品的试样溶液、供试品溶液及标准溶液点于同一块薄层板上，展开后进行薄层扫描，测液点于同一块薄层板上，展开后进行薄层扫描，测定各斑点的峰面积，计算各溶液中组分的量，计算定各斑点的峰面积，计算各溶液中组分的量，计算回收率（回收率（R R）。）。34第34页，此课件共92页哦（4 4）统计检验）统计检验 统计检验是检验两种方法、两台仪器或两个人测量的两组实统计检验是检验两种方法、两台仪器或两个人测量的两组实验数据的精密度或准确度（偶然误差或系统误差）间是否存在显验数据的精密度或准确度（偶然误差或系统误差）间是否存在显著性差异，说明新建定量方法可否代替旧方法或优于旧方法。著性差异，说明新建定量方法可否代替旧方法或优于旧方法。统计检验包括统计检验包括F F检验与检验与t t检验。检验。F F检验检验即精密度差别检验，用以检验两组数据的精密度或偶即精密度差别检验，用以检验两组数据的精密度或偶然误差是否存在显著性差异，一般为单侧检验。然误差是否存在显著性差异，一般为单侧检验。t t检验检验即准确度差别检验，用以检验两组测量数据的平均即准确度差别检验，用以检验两组测量数据的平均值或系统误差是否存在显著性差异。若值或系统误差是否存在显著性差异。若t t检验证明两种方法测得检验证明两种方法测得的均值不存在显著性差异时，则新方法可以代替旧方法，的均值不存在显著性差异时，则新方法可以代替旧方法，t t检验检验一般为双侧检验。一般为双侧检验。t t检验与检验与F F检验的具体方法参见分析化学的有关论著，此从略。检验的具体方法参见分析化学的有关论著，此从略。第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法35第35页，此课件共92页哦第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法2 2、定量方法、定量方法 常用的定量方法有常用的定量方法有外标法外标法、内标法内标法、追加法追加法（叠加法）（叠加法）及及回归曲线回归曲线定量法。定量法。（1 1）外标法）外标法 外标法是薄层色谱扫描最常用的定量方法，方法简便，外标法是薄层色谱扫描最常用的定量方法，方法简便，但点样必须准确。但点样必须准确。外标一点法外标一点法 工作曲线通过原点（截距为零）时可用外标一点法工作曲线通过原点（截距为零）时可用外标一点法定量。只需点一种浓度的标准品溶液，与供试液同板展定量。只需点一种浓度的标准品溶液，