蛋白质结合相互作用以及研究方法PPT课件.ppt

关于蛋白质结合相互作用及研究方法第一张，PPT共一百页，创作于2022年6月 *DNA *RNA *ProteinCell assembly and function/Cell assembly and function/细胞组装与功能细胞组装与功能MessengerHeadquarterExecutor Stable,DNA mutationStable/Versatile,rRNA,tRNA,mRNAVersatile,Protein modificationProtein-Protein interactionProtein-Other component interaction 第二张，PPT共一百页，创作于2022年6月 已有超过已有超过10001000个物种的基因组完成测序，大量的个物种的基因组完成测序，大量的新基因不断被发现，然而单纯的基因组新基因不断被发现，然而单纯的基因组DNADNA序列尚不能序列尚不能解答许多生命问题。解答许多生命问题。基因基因是是相对静态相对静态的，而基因编码的的，而基因编码的产物产物蛋白质蛋白质则是动态的，具有则是动态的，具有时空性和调节性时空性和调节性，是生物，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。式以及相互作用等直接与生物功能相关。第三张，PPT共一百页，创作于2022年6月蛋白质序列特点和结构蛋白质序列特点和结构蛋白质进化过程和保守序列蛋白质进化过程和保守序列蛋白在细胞内的定位及其相关联的细胞器蛋白在细胞内的定位及其相关联的细胞器蛋白质表达谱蛋白质表达谱蛋白质翻译后修饰情况蛋白质翻译后修饰情况了解与其相关联的其他细胞蛋白质了解与其相关联的其他细胞蛋白质蛋白质信息的不同层次蛋白质信息的不同层次蛋白质之间的相互作用蛋白质之间的相互作用是细胞进行一切活动的是细胞进行一切活动的基础基础。第四张，PPT共一百页，创作于2022年6月蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括几乎所有的重要生命活动，包括DNADNA的复制与转录、的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。开蛋白质之间的相互作用。蛋白质间相互作用研究的重要性蛋白质间相互作用研究的重要性第五张，PPT共一百页，创作于2022年6月Human protein-protein interaction(PPI)networkHuman protein-protein interaction(PPI)networkTowards a proteome-scale map of the human proteinprotein interaction networkRual,Vidal et al.Nature 437,1173-1178(2005)第六张，PPT共一百页，创作于2022年6月 错误的蛋白质相互作用可能导致疾病错误的蛋白质相互作用可能导致疾病 如如 Alzheimers disease,beta-Alzheimers disease,beta-淀粉样结构的堆积淀粉样结构的堆积（alpha-synucleinalpha-synuclein与与synphilin-1synphilin-1结合）；结合）；Synphilin-1 associates with alpha-synuclein and promotes the formation Synphilin-1 associates with alpha-synuclein and promotes the formation of cytosolic inclusions.of cytosolic inclusions.Nat Genet.1999;22(1):110-4Nat Genet.1999;22(1):110-4 如尤文氏肉瘤融合蛋白（如尤文氏肉瘤融合蛋白（EWS-FLI1EWS-FLI1）可黏附于另一个）可黏附于另一个RNARNA解解旋旋A A蛋白（蛋白（RHARHA）控制基因转录。）控制基因转录。A small molecule blocking oncogenic protein EWS-FLI1 interaction with RNA A small molecule blocking oncogenic protein EWS-FLI1 interaction with RNA helicase A inhibits growth of Ewings sarcoma.helicase A inhibits growth of Ewings sarcoma.Nat Med.2009;15(7):750-6.Nat Med.2009;15(7):750-6.第七张，PPT共一百页，创作于2022年6月蛋白质相互作用分析研究思路蛋白质相互作用分析研究思路一、鉴定与某个感兴趣的蛋白质相互作用的所有可能的蛋白质。一、鉴定与某个感兴趣的蛋白质相互作用的所有可能的蛋白质。（暂不考虑生理功能暂不考虑生理功能）二、详细描述鉴定出蛋白的生物功能及相互作用对其功能二、详细描述鉴定出蛋白的生物功能及相互作用对其功能的影响。（的影响。（研究尽可能接近胞内条件研究尽可能接近胞内条件）三、运用高通量方法鉴定调节这种作用的关键因子。三、运用高通量方法鉴定调节这种作用的关键因子。第八张，PPT共一百页，创作于2022年6月等等离离子子表表面面共共振振技技术术S SP PR R免免疫疫共共沉沉淀淀C Co o-P PI IF Fa ar r W We es st te er rn n b bl lo ot t 串串联联亲亲和和层层析析T TA AP P融融合合蛋蛋白白沉沉降降技技术术G GS ST T-P Pu ul ll l d do ow wn nIn vitro酵酵母母双双杂杂交交Y Ye ea as st t T Tw wo o-h hy yb br ri id d噬噬菌菌体体展展示示P Ph ha ag ge e d di is sp pl la ay yIn vivo荧荧光光共共振振能能量量转转移移F FR RE ET T蛋白质蛋白质-蛋白质相互作用研究方法蛋白质相互作用研究方法蛋蛋白白芯芯片片P Pr ro ot te ei in n C Ch hi ip p 细细胞胞内内共共定定位位C Ce el ll lu ul la ar r c co ol lo oc ca al li iz za at ti io on n第九张，PPT共一百页，创作于2022年6月Two-hybrid system Two-hybrid system 是是9090年代初发展起来的新方法年代初发展起来的新方法。在。在真核模式生物酵真核模式生物酵母母中进行的，研究中进行的，研究活细胞内活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间微弱的、瞬间的作用的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。Saccharomyces cerevisiae一、酵母双杂交系统一、酵母双杂交系统 1989 Stanley Fields lab published the 1989 Stanley Fields lab published the first report on Yeast Two-Hybrid assay.first report on Yeast Two-Hybrid assay.Fields S,Song O.A novel genetic system to detect protein-protein Fields S,Song O.A novel genetic system to detect protein-protein interactions.Nature,1989,340(6230):245-246 interactions.Nature,1989,340(6230):245-246 http:/depts.washington.edu/sfields/yp_interactions/index.html第十张，PPT共一百页，创作于2022年6月 酵母激活因子酵母激活因子GAL4GAL4：N N端：端：147147个氨基酸组成的个氨基酸组成的DNADNA结合域结合域(DNA binding domain,BD)(DNA binding domain,BD)C C端：端：113113个氨基酸组成的转录激活域个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)(transcription activation domain,AD)DNADNA结合域可以和上游激活序列结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence(upstream activating sequence，UAS)UAS)结结合，而转录激活域则能激活合，而转录激活域则能激活UASUAS下游的基因进行转录下游的基因进行转录 。当两者单独存在时，不能。当两者单独存在时，不能激活转录；当两者在空间上充分接近时，可以启动下游基因的转录。激活转录；当两者在空间上充分接近时，可以启动下游基因的转录。1985 MarK Patshnes lab demonstrated modularity of DNA binding 1985 MarK Patshnes lab demonstrated modularity of DNA binding transcription activators.transcription activators.第十一张，PPT共一百页，创作于2022年6月酵母双杂交系统的原理酵母双杂交系统的原理ADYADYXDNA-BDGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS)reporter genetranscriptionGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS)reporter geneGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS)reporter geneXDNA-BD第十二张，PPT共一百页，创作于2022年6月诱饵蛋白（诱饵蛋白（baitbait）BD-XBD-X与BD融合的蛋白表达载体，其表达的蛋白 靶蛋白（靶蛋白（preyprey）AD-YAD-Y与AD融合的蛋白表达载体，其表达的蛋白 宿主菌株宿主菌株经改造的、含一个或多个报告基因的重组质粒的宿主细胞。Components of the system载体中加入进行营养型筛选的基因载体中加入进行营养型筛选的基因第十三张，PPT共一百页，创作于2022年6月 基因组中基因组中GAL4GAL4基因基因是缺失型的是缺失型的 基因组也不能合成基因组也不能合成ADEADE、HIS HIS、LEULEU、TRP TRP （因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长）改造后的酵母细胞的特点：改造后的酵母细胞的特点：第十四张，PPT共一百页，创作于2022年6月常见报告基因常见报告基因通过通过功能互补和显色反应功能互补和显色反应筛选到阳性菌落筛选到阳性菌落第十五张，PPT共一百页，创作于2022年6月培养基类型培养基类型pGADT7 Amp+-LeupGBKT7 Kan+-Trp单缺单缺双缺双缺四缺四缺第十六张，PPT共一百页，创作于2022年6月酵母双杂交实验过程酵母双杂交实验过程第十七张，PPT共一百页，创作于2022年6月第十八张，PPT共一百页，创作于2022年6月第十九张，PPT共一百页，创作于2022年6月第二十张，PPT共一百页，创作于2022年6月第二十一张，PPT共一百页，创作于2022年6月 用已知功能蛋白质筛选双杂交用已知功能蛋白质筛选双杂交cDNAcDNA文库，研究蛋白质之间相互作用文库，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。的传递途径，发现新基因。绘制蛋白质相互作用系统图谱绘制蛋白质相互作用系统图谱 (PPI)(PPI)在药物设计中的应用在药物设计中的应用酵母双杂交系统的应用现状酵母双杂交系统的应用现状第二十二张，PPT共一百页，创作于2022年6月1 1）发现新的蛋白质与蛋白质的新功能）发现新的蛋白质与蛋白质的新功能 将已知基因作为将已知基因作为诱饵诱饵，在选定的，在选定的cDNAcDNA文库中筛选与诱饵蛋文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到到AD-AD-文库载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的文库载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNAcDNA片段，并对该片段的编码序列在片段，并对该片段的编码序列在GENEBANKGENEBANK中进行比较，研究与已中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。知基因在生物学功能上的联系。第二十三张，PPT共一百页，创作于2022年6月2 2）构建基因组蛋白连锁图）构建基因组蛋白连锁图（Genome Protein-protein Interaction MapGenome Protein-protein Interaction Map，PPIPPI）基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和ESTEST序序列。列。利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和ESTEST序列为序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。第二十四张，PPT共一百页，创作于2022年6月Genome protein-protein Interaction map第二十五张，PPT共一百页，创作于2022年6月第二十六张，PPT共一百页，创作于2022年6月第二十七张，PPT共一百页，创作于2022年6月3 3）筛选药物的作用位点以及药物对）筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响蛋白质之间相互作用的影响 对于能够引发疾病反应的蛋白相互作用可采取对于能够引发疾病反应的蛋白相互作用可采取药物干扰药物干扰的的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。第二十八张，PPT共一百页，创作于2022年6月酵母双杂交系统的优点酵母双杂交系统的优点1.1.高敏感性高敏感性 采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白过量采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白过量表达；表达；激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物，之激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物，之后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定；合更趋于稳定；检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。第二十九张，PPT共一百页，创作于2022年6月酵母双杂交系统的优点酵母双杂交系统的优点1.1.高敏感性。高敏感性。2.2.真实性真实性-检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。一定程度上代表细胞内的真实情况。3.3.简洁性简洁性-融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤。质的繁琐步骤。4.4.广泛性广泛性-采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建建cDNAcDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质。文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质。第三十张，PPT共一百页，创作于2022年6月酵母双杂交系统中常见问题酵母双杂交系统中常见问题（一）（一）假阳性较多假阳性较多（二）（二）转化效率偏低转化效率偏低（三）（三）阴性干扰阴性干扰第三十一张，PPT共一百页，创作于2022年6月假阳性定义假阳性定义 在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因仍被激活的情况下，报告基因仍被激活。（一）（一）假阳性较多假阳性较多 BDBD融合诱饵蛋白的单独激活作用融合诱饵蛋白的单独激活作用(自激活现象自激活现象）ADAD融合靶蛋白有融合靶蛋白有DNADNA的特异性结合，则可单独激活报告基因的的特异性结合，则可单独激活报告基因的表达。表达。ADAD融合蛋白直接与转录因子相互作用激活报告基因；融合蛋白直接与转录因子相互作用激活报告基因；蛋白过表达导致非生理情况下的结合蛋白过表达导致非生理情况下的结合原因：原因：第三十二张，PPT共一百页，创作于2022年6月排除假阳性的措施排除假阳性的措施 作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。因的鉴定。-如存在自激活，双杂交前删除该片段，但应保留相互作如存在自激活，双杂交前删除该片段，但应保留相互作用的结构域用的结构域 采用多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不采用多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同。相同。-目前多数载体已采用。目前多数载体已采用。进一步分析：进一步分析：这种相互作用是否会在细胞内自然发生。这种相互作用是否会在细胞内自然发生。有些蛋白依赖于泛素的蛋白酶降解途径成员，它们具有有些蛋白依赖于泛素的蛋白酶降解途径成员，它们具有普遍的蛋白间的相互作用。普遍的蛋白间的相互作用。一些实际没有相互作用的蛋白但有相同的模体蛋白也可发生相一些实际没有相互作用的蛋白但有相同的模体蛋白也可发生相互作用。互作用。第三十三张，PPT共一百页，创作于2022年6月酵母转化效率较细菌酵母转化效率较细菌低低4 4个数量级个数量级，转化成为双杂交技术，转化成为双杂交技术的的瓶颈瓶颈。办法办法：引进酵母接合型引进酵母接合型 a a接合型和接合型和 接合型（两者之间可，但自身不能形接合型（两者之间可，但自身不能形成二倍体）成二倍体）（二）（二）转化效率偏低转化效率偏低第三十四张，PPT共一百页，创作于2022年6月菌落筛选菌落筛选蓝白斑蓝白斑筛选筛选第三十五张，PPT共一百页，创作于2022年6月（三）阴性干扰（三）阴性干扰融合蛋白的表达融合蛋白的表达对细胞有毒性对细胞有毒性，该怎么办？该怎么办？应选择应选择敏感性较低敏感性较低的菌株或拷贝数低的载体的菌株或拷贝数低的载体蛋白间的蛋白间的相互作用较弱相互作用较弱，应选择高敏感的菌株或多拷贝载体。应选择高敏感的菌株或多拷贝载体。蛋白在酵母中蛋白在酵母中不能稳定地表达不能稳定地表达，或者，或者不能正确地折叠不能正确地折叠，或杂交蛋，或杂交蛋白白不能转入胞核不能转入胞核。在细胞表面发生的相互作用可采用噬菌体显示系统。在细胞表面发生的相互作用可采用噬菌体显示系统。两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。甚低以至于检测不出来。原因：原因：第三十六张，PPT共一百页，创作于2022年6月 酵母双杂交系统是分析蛋白酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用蛋白间相互作用的有效和快速的方法，的有效和快速的方法，有多方面的应用，有多方面的应用，但仍存但仍存在一些局限性在一些局限性。双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它的实验手段来验证。的实验手段来验证。酵母双杂交系统使用注意事项酵母双杂交系统使用注意事项第三十七张，PPT共一百页，创作于2022年6月 在酵母双杂交的基础上，又发展：在酵母双杂交的基础上，又发展：酵母单杂交酵母单杂交分析分析DNADNA和文库蛋白之间的作用和文库蛋白之间的作用酵母三杂交酵母三杂交-分析蛋白和分析蛋白和RNARNA间的相互作用间的相互作用酵母的反向杂交酵母的反向杂交-两种蛋白相互作用的结构和位点。两种蛋白相互作用的结构和位点。酵母双杂交相关技术酵母双杂交相关技术第三十八张，PPT共一百页，创作于2022年6月酵母单杂交系统酵母单杂交系统在酵母单杂交系统中，用特异的在酵母单杂交系统中，用特异的DNADNA序列取代序列取代DNA Gal4DNA Gal4结合位点。结合位点。该该DNADNA序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位点。序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位点。靶靶DNADNA序列特异的结合蛋白序列特异的结合蛋白(BDPX)(BDPX)与与Gal4 PGal4 P的激活结构域作用可的激活结构域作用可激活作为表型选择性报告基因的表达。激活作为表型选择性报告基因的表达。第三十九张，PPT共一百页，创作于2022年6月酵母单杂交系统应用酵母单杂交系统应用 确定已知确定已知DNA-DNA-蛋白质之间是否存在相互作用。蛋白质之间是否存在相互作用。分离编码结合于目的顺式调控元件或其他短分离编码结合于目的顺式调控元件或其他短DNADNA结合位点蛋白的新基因。结合位点蛋白的新基因。定位已经证实的具有相互作用的定位已经证实的具有相互作用的DNADNA结合蛋白的结合蛋白的DNADNA结合结构域。结合结构域。-研究研究DNA-DNA-蛋白质相互作用蛋白质相互作用第四十张，PPT共一百页，创作于2022年6月酵母三杂交系统酵母三杂交系统在酵母三杂交系统中，除在酵母三杂交系统中，除RNARNA结合蛋白结合蛋白-BD-BD和待选的和待选的RNARNA结合蛋白结合蛋白-AD-AD，还需构建一杂合，还需构建一杂合RNARNA，含有二个不同的蛋白结合位点。当，含有二个不同的蛋白结合位点。当RNARNA与二个与二个RNARNA结合蛋白的结合位点相互作用时可激活报道基因的转结合蛋白的结合位点相互作用时可激活报道基因的转录和表达。录和表达。三杂交系统提供了快速、多用的体内检测三杂交系统提供了快速、多用的体内检测RNA-RNA-蛋白间相互作用的蛋白间相互作用的新方法。新方法。RNA第四十一张，PPT共一百页，创作于2022年6月 反向酵母双杂交系统反向酵母双杂交系统（reverse yeast two-hybrid system reverse yeast two-hybrid system）该系统是一项鉴定该系统是一项鉴定阻断阻断蛋白间相互作用的技术，核心在于构建蛋白间相互作用的技术，核心在于构建一种反向筛选的报告基因。一种反向筛选的报告基因。在这系统中，野生型在这系统中，野生型BD-X/AD-YBD-X/AD-Y间的相互作用激活一种间的相互作用激活一种URA3URA3报告基报告基因，使酵母宿主因，使酵母宿主-URA-URA（uraura缺失）培养基上生长；但缺失）培养基上生长；但URA3URA3编码的酶编码的酶类可以使类可以使5-FOA5-FOA变成对细胞有毒性的物质，使酵母细胞在含变成对细胞有毒性的物质，使酵母细胞在含5-FOA5-FOA的培的培养基上不能生长。在此情况下养基上不能生长。在此情况下BD-X/AD-YBD-X/AD-Y作用的解离作用的解离赋予酵母一种选赋予酵母一种选择生长优势。择生长优势。利用这种方法能方便地鉴定利用这种方法能方便地鉴定作用缺陷等位基因作用缺陷等位基因、解离肽或相关解离肽或相关的小分子物质的小分子物质。第四十二张，PPT共一百页，创作于2022年6月-Ura5-FOA这个改造的酵母菌株在缺乏尿这个改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上只有当嘧啶的选择性培养基上只有当“诱饵诱饵”和和“猎物猎物”相互作用激活相互作用激活URA3URA3基因的表达才能生长。基因的表达才能生长。在含有在含有5-FOA5-FOA的完全培养基的完全培养基上上“饵饵”和和“猎物猎物”的相互作的相互作用则抑制细胞的生长。用则抑制细胞的生长。有相互作用有相互作用无相互作用无相互作用+-反向酵母双杂交系统反向酵母双杂交系统（reverse yeast two-hybrid system）Vidal M,Brachmann RK,Fattaey A,Harlow E,Boeke JD.Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(19):10315-10320.第四十三张，PPT共一百页，创作于2022年6月反向酵母双杂交系统的应用反向酵母双杂交系统的应用研究蛋白间作用的研究蛋白间作用的关键位点关键位点或起决定作用的个别氨基酸，或起决定作用的个别氨基酸，进进而分析蛋白结构和功能的关系。而分析蛋白结构和功能的关系。筛选能筛选能阻止某些蛋白间相互作用的肽阻止某些蛋白间相互作用的肽或小分子物质用作临或小分子物质用作临床治疗制剂。床治疗制剂。利用反向双杂交系统对文库进行预清除，则可能大大减轻利用反向双杂交系统对文库进行预清除，则可能大大减轻以后的假阳性鉴定工作。反向双杂交系统作为正向双杂交系以后的假阳性鉴定工作。反向双杂交系统作为正向双杂交系统的补充，提出了创建整个有机体蛋白质连锁图谱的设想。统的补充，提出了创建整个有机体蛋白质连锁图谱的设想。第四十四张，PPT共一百页，创作于2022年6月细菌双杂交：细菌双杂交：操作简单，周期短操作简单，周期短2-32-3天天可研究膜蛋白或跨膜蛋白相互作用可研究膜蛋白或跨膜蛋白相互作用哺乳细胞双杂交：哺乳细胞双杂交：蛋白有翻译后修饰，可正确地折叠蛋白有翻译后修饰，可正确地折叠报告基因：荧光素酶，碱性磷酸酶和报告基因：荧光素酶，碱性磷酸酶和-半乳糖苷酶半乳糖苷酶酵母双杂交相关技术酵母双杂交相关技术第四十五张，PPT共一百页，创作于2022年6月Figure.Schema of the high-throughput yeast two-hybrid pipeline.Nature.2005 Oct 20;437(7062):1173-8.Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.Example第四十六张，PPT共一百页，创作于2022年6月the leader in enzyme technology二、噬菌体展示技术是一项筛选技术，将目标蛋白的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面。被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物学活性。Smith在1985年首次证实外源DNA可以插入丝状噬菌体基因III中，并与pIII蛋白融合展示。Smith GP.Science 1985;228:1315-7http:/www.biosci.missouri.edu/smithgp/PhageDisplayWebsite/PhageDisplayWebsiteIndex.html第四十七张，PPT共一百页，创作于2022年6月展示系统展示系统不同不同分为：分为：M13M13噬菌体展示系统、噬菌体展示系统、T7T7噬菌体、噬菌体、T4T4噬菌体与噬菌体与-噬菌体展示系统噬菌体展示系统噬菌体展示系统的分类：噬菌体展示系统的分类：丝丝状状噬噬菌菌体体蝌蝌蚪蚪形形噬噬菌菌体体噬菌体、噬菌体、T4T4噬菌体、噬菌体、T7T7噬菌体噬菌体M13M13噬菌体噬菌体第四十八张，PPT共一百页，创作于2022年6月展示内容展示内容 （文库）不同（文库）不同包括：包括：随机肽段随机肽段文库文库、天然肽段天然肽段文库文库、cDNAcDNA文库文库、抗体抗体文库文库（抗体片段）（抗体片段）、蛋白质文库蛋白质文库等等噬菌体展示系统的分类：噬菌体展示系统的分类：第四十九张，PPT共一百页，创作于2022年6月the leader in enzyme technologyLife Cycle of M13以dsDNA为模版合成所有的病毒蛋白，且通过滚环复制合成组装病毒所需的ssDNA。基因组编码11种蛋白质，其中5种为结构蛋白质。与展示密切相关的有两种结构蛋白质（主要衣壳蛋白 pVIII和次要衣壳蛋白 pIII）。感染宿主后通常不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，第一代噬菌体在感染10分钟后出现在培养液中（37oC）。感染后1小时内平均每个细胞分泌1000个噬菌体。第五十张，PPT共一百页，创作于2022年6月the leader in enzyme technology主要衣壳蛋白主要衣壳蛋白 pVIII pVIII和次要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白 pIII pIIIPIIIPVIII展示多肽300aa10aa展示数量低价（约5个拷贝）高价（高达2700个拷贝）配体结合力亲和力非常低高亲和力插入部位N 端、近N 端或N 端与C 端的柔性连接区融合N 端或近N 端融合衣壳蛋白衣壳蛋白第五十一张，PPT共一百页，创作于2022年6月General selection scheme for cDNA expression-products displayed on phagesurface.Konthur et al 2003 TARGETS Vol.2,No.6 261-270.噬菌体展示操作流程噬菌体展示操作流程第五十二张，PPT共一百页，创作于2022年6月噬菌体展示技术的优点噬菌体展示技术的优点 非展示系统非展示系统 展示系统展示系统第五十三张，PPT共一百页，创作于2022年6月噬菌体展示技术的优点噬菌体展示技术的优点特定分子的基因型和其表型统一在同一个噬菌体颗粒内，将特定分子的基因型和其表型统一在同一个噬菌体颗粒内，将重组重组蛋白质筛选与基因筛选合二为一蛋白质筛选与基因筛选合二为一。被展示的多肽或蛋白可以被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活保持相对独立的空间结构和生物活性性，以利于靶分子的识别和结合。，以利于靶分子的识别和结合。淘选的高效率使阳性克隆在微量存在的情况下，通过感染得淘选的高效率使阳性克隆在微量存在的情况下，通过感染得到到扩增富集扩增富集。操作操作简单易行简单易行，在几周内即可筛选，在几周内即可筛选10106 610108 8克隆克隆噬菌体随机肽库具有噬菌体随机肽库具有容量大、体积小、筛选简便、制备成本低、容量大、体积小、筛选简便、制备成本低、可多次扩增可多次扩增等突出优点。等突出优点。第五十四张，PPT共一百页，创作于2022年6月噬菌体展示技术的局限性噬菌体展示技术的局限性所建库的容量所建库的容量（109）和分子多样性受到限制；和分子多样性受到限制；噬菌体展示文库一旦建成，很噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和难再进行有效的体外突变和重组重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。，进而限制了文库中分子遗传的多样性。由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。效表达和展示。少数多肽由于疏水性，或由于影响外膜蛋白的折叠而不能少数多肽由于疏水性，或由于影响外膜蛋白的折叠而不能展示在噬菌体表面。展示在噬菌体表面。第五十五张，PPT共一百页，创作于2022年6月噬菌体展示的应用噬菌体展示的应用抗原表位分析抗原表位分析蛋白质相互作用位点的确定蛋白质相互作用位点的确定人工抗体和疫苗的制备人工抗体和疫苗的制备酶抑制剂的研究开发酶抑制剂的研究开发多肽药物的研制多肽药物的研制第五十六张，PPT共一百页，创作于2022年6月Targeting Plasmodium ligands on mosquito salivary glands and midgut with a phage display peptide libraryProc Natl Acad Sci U S A.2001;98(23):1327813281.Figure1.Schematic illustration of the selection protocol for phages that bind either to salivary glands(a)or to the luminal side of the midgut epithelium(b).Example第五十七张，PPT共一百页，创作于2022年6月三、荧光共振能量转移三、荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)当供体荧光分子的发射光谱与受体当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在个分子的距离在10nm10nm范围以内时，范围以内时，就会发生一种就会发生一种非放射性的能量转非放射性的能量转移移，即，即FRETFRET现象，使得供体的荧光现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。大增强（敏化荧光）。FRET FRET技术是目前技术是目前唯一唯一能对能对固定细胞中固定细胞中的蛋白质间相互作用或存在于的蛋白质间相互作用或存在于活细胞活细胞蛋白蛋白质间相互作用，提供质间相互作用，提供定位和定量定位和定量信息的技术。信息的技术。第五十八张，PPT共一百页，创作于2022年6月FRETFRET荧光能量转移荧光能量转移第五十九张，PPT共一百页，创作于2022年6月FRETFRET荧光能量转移有三个基本条件：荧光能量转移有三个基本条件：给体与受体在合适的距离（给体与受体在合适的距离（1 110 nm10 nm）；）；给体的发射光谱与受体的给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠吸收光谱有一定的重叠（这是能量匹配的（这是能量匹配的条件）；条件）；给体与受体的偶极具有给体与受体的偶极具有一定的空间取向一定的空间取向（这是偶极（这是偶极-偶极耦合作偶极耦合作用的条件）。用的条件）。第六十张，PPT共一百页，创作于2022年6月1)1)荧光蛋白荧光蛋白:一类能发射荧光的天然蛋白及其突变体。一类能发射荧光的天然蛋白及其突变体。BFP/GFP,CFP/YFP.BFP/GFP,CFP/YFP.常用的探针常用的探针Color defining GFP Blue(BFP)Green(GFP)Cyan(CFP)Yellowish(YFP)Red(D.s.RFP)Excitation(max)382 nm434 nm488 nm514 nm558 nmEmission(max)446 nm476 nm509 nm527 nm583 nmSensitivity to photobleachingHighLowLowModerateLow第六十一张，PPT共一百页，创作于2022年6月2)2)传统有机