生物分离与纯化技术生化工艺 预处理及固液分离.pptx

一.生化分离工程的工艺流程：第1节 发酵液预处理第1页/共59页二.常见的预处理方法悬浮液的基本特性悬浮液的基本特性细胞的相对密度与培养液相似细胞的相对密度与培养液相似可压缩性，粘稠，非牛顿流体，流可压缩性，粘稠，非牛顿流体，流变行为复杂变行为复杂悬浮状态稳定悬浮状态稳定第2页/共59页改善发酵液的物理性质：改善发酵液的物理性质：流变性质、颗粒粒度流变性质、颗粒粒度预处理预处理的目的的目的去除部分杂质：杂蛋白、去除部分杂质：杂蛋白、多糖、高价无机离子等多糖、高价无机离子等二.常见的预处理方法第3页/共59页物理性物理性质的改善质的改善杂质杂质的去除的去除预处理预处理的方法的方法加热（降低黏度、加热（降低黏度、去除杂蛋白）去除杂蛋白）凝聚与絮凝（增大凝聚与絮凝（增大粒度）粒度）加助滤剂（改善过加助滤剂（改善过滤）滤）去杂蛋白（等电点、变去杂蛋白（等电点、变性剂、吸附）性剂、吸附）去多糖（酶解）去多糖（酶解）去离子（沉淀）去离子（沉淀）二.常见的预处理方法第4页/共59页 凝凝聚聚是在高高价价无无机机盐盐作作用用下，由于经经典典排排斥斥力力的的降低降低，而使胶体体系不稳定胶体体系不稳定的现象。絮絮凝凝是指在某些高高分分子子絮絮凝凝剂剂存存在在下下，基于架架桥桥作作用用，使胶粒形成粗大的絮絮凝凝团团的过程，是一种以物物理的集合为主理的集合为主的过程。凝聚和絮凝技术凝聚和絮凝技术第5页/共59页胶体粒子的电荷一旦被中和，其排斥力消失，胶体粒子就会在分子间吸引力作用下聚集沉淀。胶粒能保保持持分分散散状状态态的的原原因因主要是带有相同电荷，一旦由于布朗运动使粒子间距离缩小即产生排斥力使两个粒子分开，从而阻止了粒子的聚集阻止了粒子的聚集。第6页/共59页常用的凝聚剂Al2(SO4)3.18H2O，AlCl3.6H2O，FeCl3，ZnSO4，MgCl2阳离子对负电荷的胶粒凝聚能力次序为：Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+第7页/共59页絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如-COOH）或阳离子（如-NH2）基团以及不带电荷的非离子型基团。它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架连接时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。絮凝第8页/共59页絮凝原理第9页/共59页l 絮凝剂用量:絮凝效果呈钟形变化。l 溶液的pH：pH主要影响离子型絮凝剂中功能团的电离度，从而影响了分子链的伸展状态，改变了架桥能力。l 搅拌速度和时间：l 助滤剂：添加助滤剂能增加絮凝效果。絮凝作用的影响因素：第10页/共59页1.1.聚丙烯酰胺（PolyacrylamidePolyacrylamide）衍生物：非离子型、阴离子型（含-COOH）、阳离子型（含-NH2）由于聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用量少，一般以ppm计量，絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度快以及种类多等优点，所以适用范围广。2.2.天然有机高分子絮凝剂 明胶、海藻酸钠在食品工业上应用较多壳聚糖在生物产品分离中用得最多常用絮凝剂的种类：第11页/共59页二、杂蛋白的去除等电点沉淀蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。胶体粒子的稳定性和其所带电荷有关。蛋白质在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。因为羧基的电离度比氨基大，故蛋白质的酸性性质通常强于碱性，因而很多蛋白质的等电点都在酸性范围内（pH 4.05.5）。第12页/共59页二、杂蛋白的去除变性沉淀蛋白质从有规则排列变为不规则结构的过程称为变性。加热：在链霉素生产中，在pH3.0时，加热至7075，维持30min，黏度降为1/6，过滤速度提高3倍。加有机溶剂、表面活性剂、酸碱等。第13页/共59页二、杂蛋白的去除在酸性溶液中，蛋白质能与一些阴离子如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；在碱性溶液中，能与一些阳离子，如Ag，Cu2，Zn2，Fe2和Pb2等形成沉淀。变性蛋白质溶解度较小。最常用的使蛋白质变性的方法是加热。加热还能使液体粘度降低，加快过滤速度。该法只适用于对热较稳定的生化物质。第14页/共59页二、杂蛋白的去除吸附在发酵液中加入一些反应剂，相互反应后生成的沉淀物可吸附蛋白质而使其沉淀。如在四环素发酵液中加入黄血盐和硫酸锌，两者反应生成K2Zn3Fe(CN)62在枯草杆菌的碱性蛋白酶发酵液中加入氯化钙和磷酸盐等第15页/共59页三、不溶性多糖的去除当发酵液中含有较多不溶性多糖时，黏度增大，固液分离困难，可用酶将其转化为单糖。第16页/共59页三、高价无机离子的去除除去Ca2草酸钠Mg2 草酸根（草酸镁溶解度稍大）或磷酸盐Fe2 黄血盐（生成普鲁士兰沉淀）第17页/共59页第2节 细胞破碎细菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自于肽聚糖的网状结构。细胞壁的组成第18页/共59页第19页/共59页酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，主要阻力来自于壁结构交联的紧密程度和厚度。第20页/共59页丝状真菌：多糖，蛋白质，脂类，葡聚糖，几丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。第21页/共59页微生物细胞的破碎技术 第22页/共59页高压匀浆法高压匀浆器采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用方法，利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂第23页/共59页高压匀浆器第24页/共59页高压匀浆法特点破碎率较高适合大规模细胞破碎碎片细小，胞内物质释放完全适合格兰氏阴性菌和酵母的破碎，不适合霉菌和格兰氏阳性菌第25页/共59页影响因素操作压力（5070MPa）细胞浓度（20）温度循环次数(25)第26页/共59页第27页/共59页 珠磨法 珠磨法是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。第28页/共59页珠磨法特点破碎率较高适合大规模细胞破碎碎片较小，胞内物质释放完全温度容易急剧上升，需要良好的降温配套设备相对与酵母和细菌，珠磨法更适合真菌菌丝和藻类第29页/共59页影响细胞破碎的因素搅拌速度（7001450r/min）料液的循环速度（50500L/h）细胞浓度（0.30.5g/mL）珠粒大小和填充量（0.451mm；7090)第30页/共59页细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果极差。该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。超声波法第31页/共59页电声超声波发生器第32页/共59页 采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂酸碱调节pH，改变蛋白质的电荷，使其与其他物质作用力下降有机溶剂能大量渗透进入细胞，造成细胞膨胀破碎有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等，常用于无色杆菌、芽孢杆菌、梭菌、假单胞杆菌破碎表面活性剂能使脂溶性成分溶解而是胞内物质渗漏出来化学法第33页/共59页优点：细胞外形较完整，碎片少，核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离、不需要专门设备，对产物的释出选择性好等优点，故使用较多。缺点：易导致活性物质破坏、化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难 化学法第34页/共59页利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。优点：专一性强，发生酶解的条件温和。缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于小规模的实验室研究。溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的-1，4糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。酶解法第35页/共59页渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液)，入达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。第36页/共59页冻结-融化法将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。第37页/共59页机械破碎法与非机械法比较 第38页/共59页破碎方法的选择破碎目标待破碎细胞的机械强度破碎条件目标产物对破碎条件的敏感性细胞的量第39页/共59页破碎率的测定 1.直接测定法：细胞计数2.测定释放的蛋白质量或酶的活力或相对电导率第40页/共59页第3节 发酵液的固液分离固液分离的目的：收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相，或者是收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物，如细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等。第41页/共59页过滤影响过滤的因素：影响过滤的因素：n发酵液的性质：黏度、粒度、颗粒含量、滤饼的性质n过滤装置：过滤面积、料液分布效果n过滤操作条件：压力、过滤方式第42页/共59页过滤改善过滤的方法 (一）预处理：改善发酵液性质（二）助滤剂：能改善过滤操作的质地坚硬不可压缩性固体机理：表面吸附胶体及不可压缩型格子结构助滤剂选择：粒度与悬浮颗粒适当使用方法：a a 预先制成滤饼：滤液澄清度高b b 助滤剂混入悬浮液中一起过滤：容易达到滤速最大c c 两种方法混用常用助滤剂：硅藻土，珍珠岩，活性炭（三）优化过滤装置第43页/共59页板框压缩机鼓式真空过滤机过滤的常用设备：第44页/共59页第45页/共59页第46页/共59页第47页/共59页第48页/共59页转鼓真空过滤机第49页/共59页DryWashImmersionKnifeCakeFeedRotaryvacuumfilter转鼓真空过滤机第50页/共59页第51页/共59页离心分离借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离等常用离心分离超速离心技术已成为分离、纯化、鉴别和各种生物大分子的重要手段之一第52页/共59页(1)利用物质的不同密度进行分离(2)离心方式多：离心沉降、离心过滤、差速离心、速率区带离心、密度离心等(3)应用广:a活体生物离心(细胞、微生物、病毒)b细胞器离心(细胞核、细胞膜、线粒体)c生物大分子离心(核酸、蛋白质、酶、多聚物)d小分子聚合物合物等。特点：第53页/共59页差速离心差速沉淀离心(differential centrifugation)系指分步改变离心速度，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分批沉淀分离的方法，它适用于沉降系数差别在一到几个数量级的混合样品的分离，对于差别较小的物质，差速离心难以得到满意的分离效果。第54页/共59页第55页/共59页等密度离心第56页/共59页保证絮凝效果最佳碱化分离实例分离实例乳酸发酵液预处理80保温3min3min发酵液变性去除杂蛋白加适量CaCO3调节pH4.0壳聚糖50mg/m3于30搅拌5min加硅藻土作助滤剂，板框过滤滤液活性炭脱色过滤，取虑液浓缩（蒸发、膜分离）结晶（降温至510）洗涤、酸解、脱色、过滤成品第57页/共59页保证产物稳定稀释分离实例分离实例透明质酸发酵液预处理1/2V10%TCA发酵液变性去除降解酶及杂蛋白0.8V95%乙醇调节pH7.0加硅藻土作助滤剂，板框过滤滤液2V95%乙醇离心粗品第58页/共59页感谢您的观看！第59页/共59页