生物化学氨基酸与蛋白质.pptx

在在二二级级结结构构及及超超二二级级结结构构的的基基础础上上，多多肽肽链链进进一一步步卷卷曲曲折折叠叠，组组装装成成几几个个相相对对独立的、近似球形的三维实体。独立的、近似球形的三维实体。一、结构域domain，motif(模块)第1页/共102页 结构域是球状蛋白的折叠单位结构域是球状蛋白的折叠单位较小的蛋白质分子或亚基往往是单结构域的。较小的蛋白质分子或亚基往往是单结构域的。结构域一般有氨基酸残基。结构域一般有氨基酸残基。结结构构域域之之间间常常常常有有一一段段柔柔性性的的肽肽段段相相连连，形形成成所所谓谓的的铰铰链链区，使结构域之间可以发生相对移动。区，使结构域之间可以发生相对移动。结结构构域域承承担担一一定定的的生生物物学学功功能能，几几个个结结构构域域协协同同作作用用，可可体现出蛋白质的总体功能。体现出蛋白质的总体功能。例例：脱氢酶类的多肽主链有两个结构域，一个为NAD+结合结构域，一个是起催化作用的结构域，两者组合成脱氢酶的脱氢功能区。结结构构域域间间的的裂裂缝缝，常常是是酶酶的的活活性性部部位位，也也是是反反应应物物的的出出入入口口第2页/共102页第3页/共102页EFEF手：钙结合蛋白中，含有手：钙结合蛋白中，含有Helix-Loop-Helix-Loop-LelixLelix结构结构锌指：锌指：DNADNA结合蛋白中，结合蛋白中，2 2个个HisHis、2 2个个CysCys结合一个结合一个ZnZn。亮氨酸拉链：亮氨酸拉链：DNADNA结合蛋白中，由亮氨酸结合蛋白中，由亮氨酸倒链形成的拉链式结构，倒链形成的拉链式结构，第4页/共102页第5页/共102页二、三级结构整个多肽链在二级结构、超二级结构和结构域整个多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上盘旋、折叠，形成的特定的整个空间的基础上盘旋、折叠，形成的特定的整个空间结构。结构。三级结构是多肽链中所有原子的空间排布。三级结构是多肽链中所有原子的空间排布。第6页/共102页 大的球形蛋白大的球形蛋白(200(200氨基酸以上氨基酸以上)，常常含有，常常含有几个结构域。几个结构域。1、三级结构的特点 许多在一级结构上相差很远的氨基酸碱基在许多在一级结构上相差很远的氨基酸碱基在三级结构上相距很近。三级结构上相距很近。球形蛋白的三级结构很密实，大部分的水分子球形蛋白的三级结构很密实，大部分的水分子从球形蛋白的核心中被排出，这使得极性基团间从球形蛋白的核心中被排出，这使得极性基团间以及非极性基团间的相互用成为可能。以及非极性基团间的相互用成为可能。第7页/共102页主要的是二硫键，二硫键不指导多肽链的折叠，三级结构形成后，二硫键可稳定此构象。2、维持三级结构的作用力氢键氢键范德华力范德华力分子间及基团间作用力分子间及基团间作用力定向效应：极性基团间诱导效应：极性与非极性基团间分散效应：非极性基团间疏水相互作用疏水相互作用离子键离子键盐键盐键共价健共价健第8页/共102页第9页/共102页第10页/共102页5、表面常常有空穴，配体结合部位（活性中心）三、球状蛋白质三维结构特征1、含有丰富的二级结构元件2、具有明显的折叠层次3、分子呈现球状或椭球状4、疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在外表第11页/共102页第七节亚基缔合与四级结构第12页/共102页 有些对称的寡聚蛋白是由两个或多个不对称的有些对称的寡聚蛋白是由两个或多个不对称的等同结构成分组成，这种等同的结构成分称为等同结构成分组成，这种等同的结构成分称为原体原体原体原体。如血红蛋白如血红蛋白2222就是由两个原体就是由两个原体组成。组成。有时也把原体称为单体。有时也把原体称为单体。一、有关四级结构的一些概念1 1、亚基与单体、亚基与单体2 2、单体蛋白质、单体蛋白质3 3、原体（、原体（protomer)protomer)四级结构的蛋白质中每一个球状蛋白质称为四级结构的蛋白质中每一个球状蛋白质称为亚基亚基亚基亚基（或（或单体单体单体单体），），亚基一般由一条多肽链组成。亚基一般由一条多肽链组成。只有一个亚基的蛋白质称为只有一个亚基的蛋白质称为单体蛋白质单体蛋白质单体蛋白质单体蛋白质。第13页/共102页二、四级结构缔合的驱动力疏水作用极性基团之间的氢键和离子键二硫桥第14页/共102页亚基间相互作用的表面是不同的，形亚基间相互作用的表面是不同的，形成线形或螺旋形的高聚物，如微管，成线形或螺旋形的高聚物，如微管，病毒外壳。病毒外壳。三、亚基之间的缔合方式1、同多聚与杂多聚（homomultimericandheteromultimeric)2、同种缔合与异种缔合（isologusandheterologus)同种缔合同种缔合亚基间相互作用的表面是相同的，形成的结构是对称的。亚基间相互作用的表面是相同的，形成的结构是对称的。异种缔合异种缔合第15页/共102页1 1、降低比表面积，增加蛋白质的稳定性、降低比表面积，增加蛋白质的稳定性2 2、丰富蛋白质的结构，以行使更复杂的功能。、丰富蛋白质的结构，以行使更复杂的功能。3 3、提高基因编码的效率和经济性。、提高基因编码的效率和经济性。4 4、使酶的催化基团汇集，提高催化效率。、使酶的催化基团汇集，提高催化效率。5 5、形成一定的几何形状，如细菌鞭毛。、形成一定的几何形状，如细菌鞭毛。6 6、适当降低溶液渗透压。、适当降低溶液渗透压。7 7、具协同效应和别构效应，实现对酶活性的调节、具协同效应和别构效应，实现对酶活性的调节四、四级缔合在结构和功能上的优越性第16页/共102页别构蛋白的别构部位与效应物的结合改变了蛋白质的构象，从而对活性部位产生的影响。五、寡聚蛋白与别构效应别构蛋白别构蛋白别构蛋白别构蛋白 除了有活性部位（结合底物）外，还有别构部位（结合调节物）。有时活性部位和别构部位分属不同的亚基（活性亚基和调节亚基），活性部位之间以及活性部位和调节部位之间通过蛋白质构象的变化而相互作用。别构效应别构效应别构效应别构效应第17页/共102页就是别构效应，别构部就是别构效应，别构部位与效应物的结合对活位与效应物的结合对活性部位的影响性部位的影响同促效应同促效应同促效应同促效应（同位效应）（同位效应）（同位效应）（同位效应）一种配体的结合对于其它部位结合后续同种配体一种配体的结合对于其它部位结合后续同种配体一种配体的结合对于其它部位结合后续同种配体一种配体的结合对于其它部位结合后续同种配体的能力的影响，包括（正）协同效应和负协同效应。的能力的影响，包括（正）协同效应和负协同效应。的能力的影响，包括（正）协同效应和负协同效应。的能力的影响，包括（正）协同效应和负协同效应。同位效应一般是指活性部位之间的效应。同位效应一般是指活性部位之间的效应。同位效应是别构效应的基础，别构效应可以看成是对同位效应是别构效应的基础，别构效应可以看成是对同位效应的一种修饰同位效应的一种修饰异促效应异促效应异促效应异促效应（异位效应）（异位效应）（异位效应）（异位效应）第18页/共102页正协同效性正协同效性正协同效性正协同效性一种配基的结合促进后续配一种配基的结合促进后续配基的结合，基的结合，S S型配体结合曲线。型配体结合曲线。负协同效性负协同效性负协同效性负协同效性一种配基的结合抑制促进后续一种配基的结合抑制促进后续配基的结合。配基的结合。正效应物正效应物正效应物正效应物促进活性部位与配基结合的别促进活性部位与配基结合的别构效应物。构效应物。负效应物负效应物负效应物负效应物抑制活性部位与配基结合的别抑制活性部位与配基结合的别构效应物。构效应物。第19页/共102页第七节蛋白质结构与功能的关系第20页/共102页8段直的段直的-螺旋组成，分别命名为螺旋组成，分别命名为A、B、CH，拐弯处是由拐弯处是由18个氨基酸组成的松散肽段（无规卷曲）。个氨基酸组成的松散肽段（无规卷曲）。4个个Pro残基各自处在一个拐弯处，另外残基各自处在一个拐弯处，另外4个是个是Ser、Thr、Asn、Ile。血红素辅基血红素辅基，扁平状，结合在肌红蛋白表面的一个洞穴内。，扁平状，结合在肌红蛋白表面的一个洞穴内。一、肌红蛋白的结构与功能1 1、肌红蛋白的三级结构、肌红蛋白的三级结构肌红蛋白肌红蛋白肌红蛋白肌红蛋白是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质。是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质。由一条多肽链（珠蛋白）和一个血红素辅基组成。由一条多肽链（珠蛋白）和一个血红素辅基组成。球状分子，单结构域。球状分子，单结构域。第21页/共102页第22页/共102页His93His64第23页/共102页p255第24页/共102页2 2、肌红蛋白的氧合曲线、肌红蛋白的氧合曲线第25页/共102页二血红蛋白的结构与功能在血液中结合并转运O2第26页/共102页接接近近于于球球体体，4 4个个亚亚基基分分别别在在四四面面体体的的四四个个角角上，每个亚基上有一个血红素辅基。上，每个亚基上有一个血红素辅基。、链的三级结构与肌红蛋白的很相似。链的三级结构与肌红蛋白的很相似。1 1、血红蛋白的结构、血红蛋白的结构成人：成人：HbAHbA：2 2 2 2 98%98%，HbAHbA2 2：2 2 2 2 2%2%胎儿：胎儿：HbF HbF 2 2 2 2早期胚胎：早期胚胎：2 2 2 2第27页/共102页第28页/共102页第29页/共102页第30页/共102页第31页/共102页2 2、血红蛋白的氧合曲线血红蛋白的氧合曲线四个亚基之间具有正协同效应，因此，它的氧合曲线是四个亚基之间具有正协同效应，因此，它的氧合曲线是四个亚基之间具有正协同效应，因此，它的氧合曲线是四个亚基之间具有正协同效应，因此，它的氧合曲线是S S S S型曲线。型曲线。型曲线。型曲线。第32页/共102页肌红蛋白和血红蛋白的氧合曲线的比较肌红蛋白和血红蛋白的氧合曲线的比较第33页/共102页增加增加COCO2 2的浓度、降低的浓度、降低pHpH能显著提高血红蛋白亚基间的协能显著提高血红蛋白亚基间的协同效应，降低血红蛋白对同效应，降低血红蛋白对O O2 2的亲和力，促进的亲和力，促进O O2 2的释放，的释放，反之，高浓度的反之，高浓度的O O2 2也能促使血红蛋白释放也能促使血红蛋白释放H+H+和和COCO2 2 。3 3、波耳效应及其生理意义、波耳效应及其生理意义血红蛋白上有血红蛋白上有COCO2 2和和BPGBPG结合部位，因此，血红蛋白还能运输结合部位，因此，血红蛋白还能运输COCO2 2 。波耳效应第34页/共102页BPG是血红蛋白的负效应物。BPG（2,3-二磷酸甘油酸）通过与它的两个亚基形成盐键稳定了血红蛋白的脱氧态的构象，因而降低脱氧血红蛋白的氧亲和力。BPG进一步提高了血红蛋白的输氧效率。在肺部，PO2超过100torr，因此，即使没有BPG，血红蛋白也能被饱和，在组织中，PO2低，BPG降低血红蛋白的氧亲和力，加大血红蛋白的卸氧量。（1 1）高山适应和肺气肿的生理补偿变化；BPGBPG升高。（2 2）血库储血时加入肌苷可BPGBPG。4 4、BPGBPG的别构效应的别构效应BPG2,3-二磷酸甘油酸第35页/共102页协同效应、波耳效应、别构效应使血红蛋白的输氧能力达到最高效率第36页/共102页三、免疫球蛋白的结构与功能1 1、抗原与抗体、抗原与抗体抗原抗原抗原是指进入异体机体后，能致敏淋抗原是指进入异体机体后，能致敏淋巴细胞产生特异抗体，并能与抗体发生特巴细胞产生特异抗体，并能与抗体发生特异结合的物质（主要有蛋白质、核酸及其异结合的物质（主要有蛋白质、核酸及其它高分子化合物）。它高分子化合物）。第37页/共102页抗原性由抗原分子表面特殊的化学抗原性由抗原分子表面特殊的化学基团决定（一级结构或空间结构），基团决定（一级结构或空间结构），这种决定或控制抗原性的化学基团。这种决定或控制抗原性的化学基团。抗原性抗原性包括免疫原性和抗原特异性。包括免疫原性和抗原特异性。免疫原性免疫原性是指诱导特异免疫反应的能力。是指诱导特异免疫反应的能力。抗原特异性抗原特异性是指与抗体特异结合的能力。是指与抗体特异结合的能力。抗原决定簇抗原决定簇抗原决定簇的作用抗原决定簇的作用被免疫活性细胞识别，从而激活免疫活性细胞产生抗体。被免疫活性细胞识别，从而激活免疫活性细胞产生抗体。与相应抗体的与相应抗体的FabFab结合。结合。第38页/共102页抗体抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，是在对抗原刺激的免疫应答中，B B淋巴细胞产生的一类淋巴细胞产生的一类糖蛋白，它是能与相应抗原特异性结合、产生免疫反应糖蛋白，它是能与相应抗原特异性结合、产生免疫反应的球蛋白，也称免疫球蛋白。的球蛋白，也称免疫球蛋白。抗体的特点抗体的特点高度特异性高度特异性多样性多样性几乎所有的外源蛋白都能诱导相应的特异性抗体，几乎所有的外源蛋白都能诱导相应的特异性抗体，人体内任一时刻约有人体内任一时刻约有1010，000000种抗体存在。种抗体存在。第39页/共102页第40页/共102页第41页/共102页第42页/共102页抗原抗体反应的条件：抗原抗体反应的条件：抗原决定簇与抗体结合部位构象互补。抗原决定簇与抗体结合部位构象互补。二者各有对应的化学基团，通过作用力使二者二者各有对应的化学基团，通过作用力使二者结合（离子键、氢键结合（离子键、氢键 等）等）2 2、抗原抗体反应、抗原抗体反应抗体是抗体是2 2价的，抗原是多价的。价的，抗原是多价的。抗体极度过剩，抗原分子所有价被抗体的饱和，可溶。抗体极度过剩，抗原分子所有价被抗体的饱和，可溶。抗原一抗体比例适中，形成网状的抗原抗原一抗体比例适中，形成网状的抗原抗体复合物，不可溶。抗体复合物，不可溶。抗原极度过剩，抗体被饱和，可溶。抗原极度过剩，抗体被饱和，可溶。第43页/共102页第44页/共102页基于抗体基于抗体-抗原相互作用的生化分析方法抗原相互作用的生化分析方法酶联免疫吸附测定（酶联免疫吸附测定（ELASAELASA）WesternWestern印迹印迹(Western blot)(Western blot)第45页/共102页第46页/共102页第47页/共102页第八节蛋白质的分离、纯化和表征第48页/共102页一、蛋白质的酸碱性质和等电点等电点等电点对于某一种蛋白质来说，在某一对于某一种蛋白质来说，在某一pHpH，它所带的正电荷与，它所带的正电荷与负电荷恰好相等（即净电荷为零），这一负电荷恰好相等（即净电荷为零），这一pHpH称为蛋白质称为蛋白质的等电点。的等电点。等离子点等离子点中性盐（中性盐（CaCa2+2+、MgMg2+2+、Cl Cl-、HPO4HPO42-2-）影响滴定曲线形）影响滴定曲线形状和等电点。盐离子浓度为状和等电点。盐离子浓度为0 0时的等电点称等离子点。时的等电点称等离子点。等电点测定方法等电点测定方法溶解度法聚焦电泳法第49页/共102页化化学学组组成成法法测测定定最最低低分分子子量量SDS-PAGESDS-PAGE法法凝胶过滤法凝胶过滤法渗透压法渗透压法扩散系数法扩散系数法沉降系数法和沉降平衡法沉降系数法和沉降平衡法二、蛋白质的大小与形状测分子量的方法测分子量的方法第50页/共102页1 1、根据分子组成测定最小分子量、根据分子组成测定最小分子量例如如肌红蛋白肌红蛋白含含0.335%0.335%的铁的铁最低相对分子量最低相对分子量FeFe分子量分子量Fe(%)Fe(%)100%=55.80.335=16,700第51页/共102页22、葡聚糖凝胶过滤法分析蛋白质分子量葡聚糖凝胶过滤法分析蛋白质分子量第52页/共102页3.3.根据渗透压测蛋白质的分子量根据渗透压测蛋白质的分子量 用用一一半半透透膜膜将将蛋蛋白白溶溶液液与与纯纯水水隔隔开开，当当渗渗透透达平衡达平衡时，测定其渗透压，计算分子量：时，测定其渗透压，计算分子量：C C：浓度（克：浓度（克/升）升）R R：气体常数（：气体常数（0.0820.082升升/大气压大气压/克分子克分子/K/K开氏温度）开氏温度）T T：绝对温度（开氏温度）：绝对温度（开氏温度）：以大气压表示的渗透压：以大气压表示的渗透压第53页/共102页4.4.用用 SDSPAGESDSPAGE 测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量SDSSDSPAGEPAGE即十二烷基硫酸钠即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳第54页/共102页质点大小在质点大小在1-100nm1-100nm，可以进行布朗运动，可以进行布朗运动三、蛋白质的胶体性质与选择性沉淀 蛋白质分子直径在蛋白质分子直径在1-100nm1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜）。（布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜）。1 1、稳定蛋白质胶体溶液的主要因素、稳定蛋白质胶体溶液的主要因素蛋白质表面极性基团形成的水化膜蛋白质表面极性基团形成的水化膜非等电状态时，同种电荷的互相排斥。非等电状态时，同种电荷的互相排斥。第55页/共102页2 2、选择性沉淀蛋白质的方法、选择性沉淀蛋白质的方法盐析法盐析法盐析法盐析法大量的中性盐大量的中性盐（NHNH4 4）2 2SOSO4 4、NaNa2 2SOSO4 4、NaclNacl，使蛋白质，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。脱去水化层而聚集沉淀。有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法破坏水化膜，降低介电常数，破坏水化膜，降低介电常数，PEGPEG、丙酮、乙醇等、丙酮、乙醇等重金属盐沉淀重金属盐沉淀重金属盐沉淀重金属盐沉淀pHpHpIpI时带负电荷，与重金属离子（时带负电荷，与重金属离子（HgHg2+2+、PbPb2+2+、CuCu2+2+等）结成不溶性沉淀。等）结成不溶性沉淀。第56页/共102页生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂和某些酸类沉淀法pH小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。加热变性沉淀加热变性沉淀加热变性沉淀加热变性沉淀等电点沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法第57页/共102页 指指指指因因因因理理理理、化化化化因因因因素素素素影影影影响响响响，使使使使蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质生生生生物物物物的的的的活活活活性性性性丧丧丧丧失失失失。四、蛋白质的变性第58页/共102页 强酸和强碱；强酸和强碱；有机溶剂：破坏疏水作用；有机溶剂：破坏疏水作用；去污剂：去污剂都是两亲分子，破坏疏水作用；去污剂：去污剂都是两亲分子，破坏疏水作用；还原性试剂：尿素、还原性试剂：尿素、-硫基乙醇；硫基乙醇；盐浓度：盐析、盐溶；盐浓度：盐析、盐溶；重重金金属属离离子子：HgHg2+2+、pbpb2+2+，能能与与-SH-SH或或带带电电基基团团反反应。应。温度；温度；机械力：如搅拌和研磨中的气泡。机械力：如搅拌和研磨中的气泡。1、变性的因素第59页/共102页制备活性蛋白质时严防蛋白质变性制备活性蛋白质时严防蛋白质变性2、蛋白质变性后出现的现象生物活性丧失生物活性丧失硫水基团外露，分子结构伸展松散，易被蛋白酶水解。硫水基团外露，分子结构伸展松散，易被蛋白酶水解。溶解度降低、沉淀，粘度增加。溶解度降低、沉淀，粘度增加。3、蛋白质变性的实质次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。但变性不涉及一级结构的破坏但变性不涉及一级结构的破坏不可逆变性不可逆变性蛋白质变性蛋白质变性可逆变性可逆变性第60页/共102页前处理粗分级细分级浓缩保存五、蛋白质分离纯化的一般原则纯化的实质纯化的实质增加制品增加制品(preparation)(preparation)的纯度或比活性。的纯度或比活性。纯化的一般程序纯化的一般程序第61页/共102页电电 泳泳 前处理前处理前处理前处理粗分离粗分离粗分离粗分离细分离细分离细分离细分离生物组织生物组织 无细胞提取液无细胞提取液破碎、溶解、差速离心选择性沉淀法选择性沉淀法选择性沉淀法选择性沉淀法亲和亲和层析层析离子交换离子交换层析层析精制后的蛋白质精制后的蛋白质凝胶凝胶过滤过滤疏水层疏水层析析吸附层吸附层析析第62页/共102页1、前处理将组织和细胞破碎将组织和细胞破碎超声波震荡、与砂研磨超声波震荡、与砂研磨高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖）高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖）动物组织和细胞动物组织和细胞电动捣碎机（电动捣碎机（waring blender)waring blender)匀浆器（匀浆器（homogenizer)homogenizer)超声波处理（超声波处理（ultrasonication)ultrasonication)植物组织和细胞植物组织和细胞石英砂石英砂+提取液，研磨提取液，研磨纤维素酶处理纤维素酶处理微生物细胞微生物细胞第63页/共102页差速离心法收集细胞的某一组分差速离心法收集细胞的某一组分如果提取膜蛋白，超声波或去污剂使膜解聚，如果提取膜蛋白，超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取然后用适当的介质提取第64页/共102页（NH4NH4）2 2SOSO4 4分级沉淀法（盐析）分级沉淀法（盐析）等电点选择性沉淀法等电点选择性沉淀法有机溶剂分级沉淀法有机溶剂分级沉淀法热处理选择性沉淀法热处理选择性沉淀法生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法2、粗分级（roughfractionation)一般用选择性沉淀法一般用选择性沉淀法第65页/共102页3、细分级（finefractionation)首先采用透析或首先采用透析或sephdex G-25sephdex G-25凝胶过滤除盐。凝胶过滤除盐。层析法层析法凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相亲和层析、疏水层析（反相HPLCHPLC）电泳法电泳法自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳等）、盘状电泳、等电聚焦、双向电泳等。泳、细丝电泳等）、盘状电泳、等电聚焦、双向电泳等。密度梯度离心密度梯度离心第66页/共102页第67页/共102页4、保存晶体保存晶体保存 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度 的的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。容易结晶。结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、调节调节pHpH、接入晶种。、接入晶种。冻干粉保存冻干粉保存溶液保存溶液保存加入抗冻剂（加入抗冻剂（50%50%甘油）后甘油）后-20-20至至-70-70保存。保存。第68页/共102页根据蛋白质的溶解度分离根据蛋白质的溶解度分离根据电荷差异分离根据电荷差异分离根据分子大小分离根据分子大小分离根据配体特性异性分离（亲和层析）根据配体特性异性分离（亲和层析）选择性吸附分离（物理吸附）选择性吸附分离（物理吸附）根据疏水性的差异根据疏水性的差异 六、分离纯化蛋白质的主要方法第69页/共102页盐析法盐析法PEGPEG沉淀法沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法重金属盐选择性沉淀法重金属盐选择性沉淀法 （pHpI，蛋白质带负电荷）生物碱和酸选择性沉淀法生物碱和酸选择性沉淀法 （pHpI，蛋白质带正电荷）热处理沉淀法（铜锌热处理沉淀法（铜锌SODSOD，6565、1515分钟、稳定分钟、稳定1 1、根据溶解度差异的分离：选择性沉淀法、根据溶解度差异的分离：选择性沉淀法第70页/共102页在pI时，分子电荷为零，蛋白质分子间的静电排斥消失，从而蛋白质出现聚集沉淀。等电点沉淀等电点沉淀在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度最小，粘度最大。度最小，粘度最大。第71页/共102页蛋白质的盐溶与盐析盐溶盐溶盐溶盐溶低盐浓度时，蛋白质溶解度，称盐溶。盐析盐析盐析盐析高盐浓度时，使蛋白质溶解度析出，称盐析。盐析多用溶解度大的中性盐，如盐析多用溶解度大的中性盐，如(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4、NaClNaCl、MgClMgCl2 2、NH4ClNH4Cl、KClKCl等的饱和溶液等的饱和溶液第72页/共102页2 2、根据分子大小和形状的差异、根据分子大小和形状的差异透析透析超滤超滤密度梯度离心密度梯度离心凝胶过滤法凝胶过滤法第73页/共102页交联葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP，）琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-GelA）第74页/共102页第75页/共102页第76页/共102页交联葡聚糖（Sephadex）的分子结构第77页/共102页从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳、盘状电泳从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳、盘状电泳从从装装置置上上分分：圆圆盘盘电电泳泳（柱柱状状）、水水平平板板电电泳泳、垂垂直直板板电泳。电泳。从支持物分：从支持物分：自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、凝胶电泳（凝胶电泳（PAGE PAGE，琼脂糖胶，淀粉胶等），琼脂糖胶，淀粉胶等）3 3、根据电荷性质的差异、根据电荷性质的差异电泳和等电聚焦电泳和等电聚焦普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳第78页/共102页等电聚焦电泳法测定蛋白质pI第79页/共102页第80页/共102页第81页/共102页第82页/共102页第83页/共102页2Dgelinproteomics第84页/共102页离子交换纤维素：离子交换交联葡聚糖：离子交换交联琼脂糖：离子交换层析法离子交换层析法第85页/共102页第86页/共102页第87页/共102页第88页/共102页交联葡聚糖离子交换剂第89页/共102页4 4、根据选择性吸附的差异：吸附层析法、根据选择性吸附的差异：吸附层析法极性吸附材料：硅胶、氧化铝、岩藻土（离子吸引和氢键）极性吸附材料：硅胶、氧化铝、岩藻土（离子吸引和氢键）非极性：活性炭（范德华力、疏水作用）非极性：活性炭（范德华力、疏水作用）结晶磷酸钙结晶磷酸钙CaCa1010（POPO4 4）6 6（OHOH）2 2，可分离蛋白质、核酸，与，可分离蛋白质、核酸，与DNADNA的亲和力最高。的亲和力最高。最广泛最有效的材料：羟基磷灰石（最广泛最有效的材料：羟基磷灰石（hydroxyapatite)hydroxyapatite)第90页/共102页层析介质：苯基琼脂糖（层析介质：苯基琼脂糖（phenyl-sephadex)phenyl-sephadex)辛基琼脂糖辛基琼脂糖(octa-sephadex)(octa-sephadex)洗脱：洗脱：低盐高低盐高PHPH 非离子型去污剂（非离子型去污剂（triton x-100)triton x-100)脂肪醇（丁醇、乙二醇）脂肪醇（丁醇、乙二醇）5 5、根据疏水性的差异：疏水层析和反相、根据疏水性的差异：疏水层析和反相HPLCHPLC疏水层析疏水层析第91页/共102页反相反相HPLC固定相：丁基硅烷、辛基硅烷、固定相：丁基硅烷、辛基硅烷、固定相：丁基硅烷、辛基硅烷、固定相：丁基硅烷、辛基硅烷、C C C C18181818硅烷硅烷硅烷硅烷第92页/共102页6 6、配体亲和力的差异：亲和层析、配体亲和力的差异：亲和层析配基酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素与受酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白，抗原与抗体，生物素与亲和素（抗亲和素蛋白），凝体蛋白，抗原与抗体，生物素与亲和素（抗亲和素蛋白），凝集素。集素。免疫亲和层析免疫亲和层析凝集素亲和层析凝集素亲和层析金属螯和层析金属螯和层析染料配体层析染料配体层析第93页/共102页第94页/共102页第95页/共102页酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性）其它蛋白：抗原抗体反应(western blot)七、蛋白制品的含量分析、纯度鉴定与活性分析1 1、含量分析、含量分析总蛋白含量分析凯氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、双缩脲法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法特定蛋白组分的含量分析第96页/共102页沉降分析溶解度分析结晶分析（能结晶的一般比较纯，具有活性）2 2、纯度（均一性）鉴定、纯度（均一性）鉴定基本手段基本手段电泳分析：单条带。N端测定：n个亚基蛋白有1-n个N端氨基酸。选用手段选用手段第97页/共102页3 3、其它鉴定工作、其它鉴定工作分子量的测定分子量的测定等电点测定等电点测定N-N-末端末端AAAA测定测定C-C-末端末端AAAA的测定（肼解法）的测定（肼解法）分子中糖链的鉴定分子中糖链的鉴定含脂成分的鉴定含脂成分的鉴定光吸收的鉴定光吸收的鉴定第98页/共102页4 4、活性分析、活性分析第99页/共102页Redballs=activeenzymes.Othercolorballs=otherproteins.Thetotalactivityisthesameforthetwocupsbutthespecificactivityishigherfortherightcup.第100页/共102页END第101页/共102页感谢您的观看！第102页/共102页