色谱分析概论.pptx

色谱法概述 色谱过程和术语 色谱法基本理论 基本类型色谱的分离机制 第1页/共67页第一节第一节 色谱法概述色谱法概述一、色谱法（chromatograph）的起源和发展 11906年由俄国植物学家Tsweet创立 植物色素分离植物色素分离见图示 2、1931年胡萝卜素异构体的分离 3、3040年代TLC、PC平板色谱法的出现 4、40年代瑞典科学家Tiselius等在分配液相色谱、吸附色谱和电泳领域取得了成果 5、50年代英国Martin和Synge建立GC色谱 6、60年代GC-MS联用 7、70年代HPLC崛起第2页/共67页图示固定相CaCO3颗粒流动相石油醚 色谱柱玻璃柱植物色素混合物Chroma +to+graph第3页/共67页2现在：一种重要的分离、分析技术 分离混合物各组分并加以分析 固定相固定相除了固体，还可以是液体除了固体，还可以是液体 流动相流动相液体或气体液体或气体 色谱柱色谱柱各种材质和尺寸各种材质和尺寸 被分离组分被分离组分不再仅局限于有色物质不再仅局限于有色物质第4页/共67页色谱学的重要作用色谱学的重要作用应应用用的的科科学学领领域域：生生命命科科学学、材材料料科科学学、环环境境科科学学等等药学：药学：1 1、教材内容多，约占全书的三分之一。、教材内容多，约占全书的三分之一。2 2、药学各个专业都会用到色谱分析法、药学各个专业都会用到色谱分析法 药药典典 20052005年年版版 20002000年年版版 部部 药品药品 19671967种种 16991699种种 HPLCHPLC分析分析 848848种种 567567种种 3 3、考研、考研 大综合包括大综合包括分析分析、有机、生理、生化、有机、生理、生化 其中分析其中分析7575分约近一半是色谱内容分约近一半是色谱内容第5页/共67页二、色谱法定义、分离基础和目的定义：利用各组分物理化学性质的不同，在流动相流 经固定相时，由于各组分在两相间的吸附、分 配或其它亲和力的差异而产生不同速度的移 动，最终达到分离的目的。图例分离基础：差速迁移 (例:赛跑)目的：多组分分离，实现定性定量分析第6页/共67页图示分离机制：各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离吸附解吸再吸附再解吸无数次洗脱分开碳酸钙吸附剂石油醚流动相色素第7页/共67页三、色谱法分类：1按两相的态分：Mobile phase stationary phase Liquid Solid L-S色谱 LC Liquid Liquid L-L色谱 Gas Solid G-S色谱 GC Gas Liquid G-L色谱 第8页/共67页2按固定相的固定方式分：平面色谱平面色谱 纸色谱纸色谱 薄层色谱薄层色谱 高分子薄膜色谱高分子薄膜色谱柱色谱柱色谱 填充柱色谱填充柱色谱 毛细管柱色谱毛细管柱色谱 第9页/共67页吸附色谱：利用物理吸附性能的差异（固定相固体）absorption chromatography L-S（液固吸附法）G-S（气固吸附法）分配色谱：利用分配系数的不同（固定相液体）partition chromatography L-L（液液分配附法）G-L（气液分配附法）离子交换色谱：利用离子交换原理（固定相离子交换树脂）利用离子交换原理（固定相离子交换树脂）ion exchange chromatography 空间排阻色谱空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同（固定相凝胶）：利用排阻作用力的不同（固定相凝胶）size exclusion chromatography3按分离机制分：第10页/共67页色谱法简单分类色色谱谱法法GSC液相色谱法 （LC）柱色谱法柱色谱法平面色谱法平面色谱法毛细管电泳法毛细管电泳法 （CE）LLCLSCIECSEC纸色谱法纸色谱法薄层色谱法薄层色谱法（TLC）LLCLLCLSC气相色谱法气相色谱法（GC）柱色谱法柱色谱法GLC超临界流体色谱法超临界流体色谱法 （SFC）第11页/共67页四、色谱法的特点优点：“三高”、“一快”、“一广”缺点：高选择性高选择性可将性质相似的组分分开可将性质相似的组分分开 高效能高效能反复多次利用组分性质的差异反复多次利用组分性质的差异 产生很好分离效果，产生很好分离效果，n=10n=103 310106 6 高灵敏度高灵敏度1010-11-111010-13-13g g，适于痕量分析，适于痕量分析 分析速度快分析速度快几几 几十分钟完成分离几十分钟完成分离 一次一次 可以测多种样品可以测多种样品 应用范围广应用范围广气体，液体、固体物质气体，液体、固体物质 对未知物分析的定性专属性差对未知物分析的定性专属性差 需要与其他分析方法联用需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS)(GC-MS,LC-MS)第12页/共67页第二节 色谱过程与术语一、色谱过程二、基本术语1、流出曲线和色谱峰2、基线、噪音和漂移3、峰宽柱效参数4、峰高和峰面积定量参数5、保留值定性参数6、分配系数和容量因子相平衡参数7、分离因子和分离度分离参数8、等温线第13页/共67页一、色谱过程色谱过程：指物质分子（被分离组分）在相对运动的 两相（流动相和固定相）中的“分配”平衡过程以吸附色谱为例见图示色谱过程：吸附 解吸再吸附 再解吸 反复多次洗脱被测组分分配系数不同 差速迁移 分离第14页/共67页图示吸附能力弱的组分先流出 吸附能力强的组分后流出组分的结构和性质微小差异 与固定相作用差异 随流动相移动的速度不等 差速迁移 色谱分离。第15页/共67页二、基本术语1流出曲线和色谱峰流出曲线（色谱图 chromagtogram）：电信号强 度随时间变化曲线色谱峰(peak)：流出曲线上突起部分包括：定性参数、定量参数、柱效参数、分离参数等包括：定性参数、定量参数、柱效参数、分离参数等第16页/共67页2基线、噪音和漂移 base line,noise and drift基基线线：仅有流动相通过检测器时产生 的信号曲线。反映检测器噪音 随时间变化的曲线 （稳定平直直线）噪音噪音：仪器本身所固有的，以噪音 带表示（仪器越好，噪音越小）漂移漂移：基线向某个方向稳定移动 （仪器未稳定造成）第17页/共67页3 3峰宽峰宽 peak widthpeak width：色谱柱效参数色谱柱效参数峰宽峰宽W：色谱峰两侧拐点切 线与基线相交的截距标准差标准差：为正态分布曲线两拐点间距离的一半。对应 0.607h处峰宽的一半 注：小，峰窄，柱效高半峰宽半峰宽W1/2：峰高一半处所对应的峰宽 注：除了用于衡量柱效，注：除了用于衡量柱效，还可以计算峰面积还可以计算峰面积第18页/共67页峰高(peak height；h)：组分在柱后出现浓度极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离。峰面积(peak area；A)：色谱曲线与基线间包围的面积。4 4峰高和峰面积：峰高和峰面积：色谱定量参数色谱定量参数第19页/共67页5保留值：色谱定性参数保保留留时时间间 retention time,tR：从进样开始到组分出现浓度极大点时所需时间，即组分通过色谱柱所需要的时间死死时时间间dead time,t0：不被固定相滞留组分的保留时间，相当于流动相到达检测器所需要的时间调调整整保保留留时时间间tR：组分由于和固定相作用，比不作用的组分在柱种多停留的时间，即组分在固定相中滞留的时间。等于组分的保留时间与死时间之差值表示组分在色谱固定相内滞留状态的参数（1）时间表示的保留值第20页/共67页图示第21页/共67页续前保留体积保留体积VR：从进样开始到组分出现浓度极大点时所需要的 流动相的体积。VR与tR和Fc（流动相流速mL/min）的关系 死体积死体积V0：由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间 体积。包括从进样器到色谱柱导管的体积、固定相的孔隙及颗 粒间隙、柱出口导管及检测器内腔体积的总和。（2）用体积表示的保留值第22页/共67页续前调整保留体积调整保留体积VR：保留体积与死体积之差，即组分 停留在固定相时所消耗流动相的体积第23页/共67页V0 和 Vm、t0 和 tm 的区别V0：由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间体积；流定相充满死体积所需的时间为t0。Vm：平衡时流动相在色谱柱中占有的体积，流动相经过色谱柱所需时间用tm 表示。Vm V0，tm t0 的物理意义有区别。在多数情况下，可忽略导管和检测器内腔的容积，Vm 和 V0视为近似相等。第24页/共67页6分配系数和容量因子：相平衡参数1）分配系数）分配系数K（partition coefficient,平衡常数）定义：指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配 平衡后，在固定相与流动相中的浓度比与组分性质、固定相性质、流动相性质及温度有关与组分性质、固定相性质、流动相性质及温度有关实验条件固定，实验条件固定，K K仅与组分性质有关仅与组分性质有关不同分离机理的色谱中，不同分离机理的色谱中，K K名称虽有所不同，但物理意义都名称虽有所不同，但物理意义都 一样，表示平衡状态下两相中浓度之比一样，表示平衡状态下两相中浓度之比分配系数分配系数K K不容易获得，不常用不容易获得，不常用K K为热力学常数为热力学常数第25页/共67页2）容量因子）容量因子（capacity factor,容量比，分配比）k：定义：在平衡状态下，组分在固定相与流动相中的质量比相当于组分被固定相滞留的时间和流动相通过系统所需时间比第26页/共67页分配系数和保留时间是本质与现象关系分配系数和保留时间是本质与现象关系 KK，t tR R ，组分后出柱，组分后出柱分析：分析：K=0K=0，组分不保留，组分不保留 K K，组分完全保留，组分完全保留 组分 吸附力 Cs K tR VR B 强 大 大 长 大 A 弱 小 小 短 小3 3）保留行为和分配系数关系）保留行为和分配系数关系（P442）色谱过程方程：第27页/共67页应选择合适分离条件使得难分离的组分K不等2 2）色谱条件（）色谱条件（s s，mm，T T）一定时，）一定时，K K一定一定 t tR R一定一定 1 1）K K或或k k的影响因素：固定相、流动相和柱温的影响因素：固定相、流动相和柱温 结论：结论：K K 或或k k不等是分离的前提不等是分离的前提例：分离A、B两组分第28页/共67页7.7.分离因子和分离度：分离因子和分离度：分离参数分离参数 描述相邻组分分离状态的指标描述相邻组分分离状态的指标（1）分离因子分离因子（分配系数比或选择性系数）定义：两种物质调整保留值之比分离因子1是色谱分离的必需条件（2）分离度（）分离度（resolution,R）：衡量分离条件优劣的参数 定义：相临两组分间峰顶间距离是峰底宽平均值的几倍第29页/共67页讨论讨论设色谱峰为正常峰，W1W2=4 第30页/共67页8、等温线定义：指一定温度下，组分在两相中分配达平衡时，在两相 中的浓度关系曲线，即cs对cm的关系曲线 图示(1)线性等温线（理想）对称峰(2)非线性等温线凸形拖尾峰（常见）凹形前沿峰固定相表面活性吸附中心未达饱和，K一定，与溶质浓度无关 固定相表面吸附中心活性不均，溶质分子先占据强吸附中心再占据弱吸附中心，K随着溶质浓度的增加而减小 溶质与固定相作用，改变其表面性质，K随着溶质浓度的增加而增加 第31页/共67页斜率斜率=K=K线性：线性：线性：线性：对称峰对称峰对称峰对称峰凹形：凹形：凹形：凹形：前沿峰前沿峰前沿峰前沿峰凸形：凸形：凸形：凸形：拖尾峰拖尾峰拖尾峰拖尾峰低浓度为正常峰第32页/共67页对称因子：（拖尾因子）正常峰（对称）正常峰（对称）非正常峰非正常峰 前沿峰前沿峰 拖尾峰拖尾峰色谱峰色谱峰fs在0.951.05之间fs小于0.95fs大于1.053）对称因子(symmetry factor)衡量色谱峰对称性第33页/共67页第二节 色谱过程与术语一、色谱过程二、基本术语 1、流出曲线和色谱峰 2、基线、噪音和漂移u3、峰宽柱效参数u4、峰高和峰面积定量参数u5、保留值定性参数u6、分配系数和容量因子相平衡参数u7、分离因子和分离度分离参数 8、等温线第34页/共67页第三节 色谱法基本理论 要使R R大，必须：1 1、t tR R大-k k大-热力学2 2、W W小-峰展宽小-动力学分离度：色谱理论包括两方面:热力学理论：研究分配(分离)过程，塔板理论（plate theory）动力学理论：研究各种动力学因素对峰展宽的影响，速率理 论（rate theory）。第35页/共67页一、塔板理论 plate theory 始于马丁（Martin）和辛格（Synge）提出的塔板模型。分馏塔：在塔板上多次气液平衡，按沸点不同而分离。色色谱谱柱柱每每个个H H高高度度内内有有一一块块塔塔板板，共共有有若若干干块块塔塔板板。组组分分在在每每块块塔塔板板两两相相间间分分配配达达平平衡衡，K K小小的的先先出出柱柱。多多次次分分配配平平衡衡，K K有微小差异组分仍可获较好分离有微小差异组分仍可获较好分离假想：第36页/共67页（一）塔板理论的四个基本假设（一）塔板理论的四个基本假设1柱的组成为多个连续、等距塔板，每塔板内组分分配瞬间达 平衡（H理论塔板高度）2流动相间歇式进入色谱柱，每次进一个塔板体积3样品和载气均加在第1号塔板上，沿柱方向纵向扩散忽略4分配系数在各塔板上是常数结果：当塔板数很大时，组分色谱流出曲线为趋于正态分布第37页/共67页（二）理论板数和理论塔板高度（二）理论板数和理论塔板高度L：柱长色谱柱效参数 有效理论塔板数和有效理论塔板高度 理论塔板数和理论塔板高度第38页/共67页塔板理论的贡献：从热力学角度解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大点的位置提出了评价柱效高低的n和H的计算式 须在给定条件，指定组分测定时才有意义缺点：1.柱效不能表示被分离组分的实际分离效果。2.塔板理论无法解释同一色谱柱在不同流动相流速下柱效不同的 结果，无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。第39页/共67页练习例：GC法，柱长为2m，固定相5%的OV-17、柱温为1250C，记录纸速度为2.0cm/min的色谱条件下，测定萘的保留时间为2.35min，半峰宽为0.20cm，求理论塔板数和板高。若用甲烷测得死时间为0.20min，求有效理论塔板数和板高。（见书上P444例）解：第40页/共67页二、速率理论 rate theoryrate theory塔板理论成功处塔板理论成功处：解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大值对应的tR 评价柱效（n，）塔板理论存在问题塔板理论存在问题:1）做出了四个与实际不相符的假设 忽略了组分在两相中传质和扩散的动力学过程2）只定性给出塔板高度的概念，却无法解释板高的 影响因素3）排除了一个重要参数流动相的线速度u，因而无法解释柱效与流速关系 更无法提出降低板高的途径第41页/共67页速率理论影响柱效因素19561956年，荷兰学者范第姆特(Van Deemter)(Van Deemter)提出了色谱过程动力学理论速率理论。塔板高度涡流扩散项纵向扩散项传质阻抗项H =A +B/u +Cu吸收了塔板理论的有效成果H，并从动力学角度较好地解释了影响柱效的因素u载气线速度，cm/s第42页/共67页流速与柱效的关系流速与柱效的关系流速与柱效的关系流速与柱效的关系H =A +B/u +Cu第43页/共67页1.1.涡流扩散项（多径扩散项）：涡流扩散项（多径扩散项）：A A产产生生原原因因：载气携样品进柱，遇到来自固定相颗粒的阻力路径不同涡流扩散注：颗粒太小，柱压过高且不易填充均匀 空心毛细管柱（0.10.5mm），A=0，n理较高：填充不规则因子，填充技术和填料颗粒形状决定。d dp p：填料 (固定相)颗粒的平均直径 dp小，A小；但dp太小，和柱阻大。第44页/共67页2.2.纵向扩散项纵向扩散项（分子扩散项）：（分子扩散项）：B/uB/u产生原因：产生原因：峰在固定相中被流动相推动向前、展开两边浓度差第45页/共67页注：为降低纵向扩散，宜控制较高线速度，选用分子 量较大的载气和较低的柱温选择载气原则选择载气原则：兼顾分析时间和减小纵向扩散 u 较小时，选M较大的N2气（粘度大）u 较大时，选M较小的H2气，He气（粘度小）B B的影响因素的影响因素：B/uB/u的影响：的影响：的影响：的影响：第46页/共67页3.3.传质阻抗项：传质阻抗项：CuCu产生原因：产生原因：样品在气液两相分配，样品未及溶解就被带走，从而造成峰扩张影响因素：影响因素：传质：溶解、扩散、转移的过程传质阻抗：影响传质过程的阻力第47页/共67页讨论：讨论：注：注：固定液应完全覆盖载体表面，不可以太薄，否则柱子 寿命短，k太小；T不可以超过固定液最佳使用温度小结：小结：范氏方程说明了在色谱分离条件的选择中，填充均匀程范氏方程说明了在色谱分离条件的选择中，填充均匀程 度、填充物的粒度、流动相的种类及流速、固定相的液度、填充物的粒度、流动相的种类及流速、固定相的液 膜厚度等对柱效和峰展宽的影响膜厚度等对柱效和峰展宽的影响C C的影响因素的影响因素：第48页/共67页2分离度计算式前提定义式基础上，相邻两组分的n一致（假设）柱效项柱选择项柱容量项三三 影响分离度的因素影响分离度的因素1分离度定义式 3分离度补充公式第49页/共67页（1 1 1 1）柱效项及其影响因素：）柱效项及其影响因素：主要取决于色谱柱性能及载气流速注：柱长过长，柱阻增大影响色谱峰的宽窄第50页/共67页例：两组分在1m长柱子上的R=0.75，问多长柱子可以使它们完全分离？解：讨论：v 增加柱效是提高分离度的一个直接有效手段v 提高柱效、改善分离的途径：增加柱长；降低板高v 根据速率理论，降低板高、提高柱效的方法是：1）采用粒度较小、均匀填充的固定相（A项）2）分配色谱应控制固定液液膜厚度（C项）3）适宜的操作条件：载气的性质和流速，柱温等（B项）选用分子量较大、线速度较小的载气N2气，控制较低的柱温第51页/共67页（2 2）柱选择项及其影响因素：）柱选择项及其影响因素：主要受固定相和载气性质，以及柱温影响影响峰的间距第52页/共67页续前讨论：v 增大柱选择性是改善分离度的最有力手段v 气相色谱中，柱选择性取决于固定相性质和柱温 选择合适的固定相使与不同组分的作用产生差别 才能实现分离 一般说，降低柱温可以增大柱的选择性第53页/共67页（3 3）柱容量项及其影响因）柱容量项及其影响因素：素：影响峰位主要受固定相种类和用量、载气，以及柱温影响第54页/共67页讨论：综合考虑分离度、分离时间和峰检测几项因素 控制k的最佳范围 25GC中，增加固定液用量和降低柱温可以增加 kk k 影响峰位影响峰位n n 影响峰宽窄影响峰宽窄 影响两峰间距影响两峰间距第55页/共67页练习如何根据具体情况改进分离度？太小，两组分未分开太小，两组分未分开应改变固定相极性，降低柱温应改变固定相极性，降低柱温k k 太小，太小，n n 也太小，也太小，应增大固定液用量，降低柱温应增大固定液用量，降低柱温n n 太小，许多组分未分开太小，许多组分未分开应设法降低板高，提高柱效应设法降低板高，提高柱效第56页/共67页第四节 基本类型色谱法的分离机制（一）吸附色谱法（二）分配色谱法（三）离子交换色谱法（四）空间排阻色谱法对于不同的分离机理，K的含义不同。吸附色谱 吸附系数 分配色谱 分配系数 离子交换色谱 离子交换系数 统称K 分子排阻色谱 分子排阻系数第57页/共67页（一）吸附色谱法要求要求：固定相吸附剂（硅胶或AL2O3）具表面活性吸附中心分离机制分离机制：见图示吸附系数吸附系数注：注：注：注：K Ka a与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的性质与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的性质 及温度有关及温度有关 nextnext吸附平衡吸附平衡 X Xmm+nY+nYa aXXa a+nY+nYmm 第58页/共67页图示分离机制：各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离吸附解吸再吸附再解吸无数次洗脱分开 back第59页/共67页（二）分配色谱法（一）要求（一）要求：固定相机械吸附在惰性载体上的液体 流动相必须与固定相不为互溶 载体惰性，性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应（二）分离机制：（二）分离机制：利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离 狭义分配系数狭义分配系数注：注：K K与组分、流动相、固定相的性质以及柱温有关与组分、流动相、固定相的性质以及柱温有关第60页/共67页（三）分类 正相色谱正相色谱 反相色谱反相色谱固定相极性 大 小 如水 如硅油、液体石腊流动相极性 小 大 如极性小的有机溶剂 如水液或醇类流出顺序 极性小的先流出 极性大的先流出第61页/共67页（三）离子交换柱色谱法Ion exchange chromatography 固定相：离子交换树脂 流动相：水溶液 分离对象：离子型化合物离子交换树脂：具有网状结构的高分子聚合物 苯乙烯+二乙烯苯骨架 骨架：酸性基团（-SO3H,-COOH）阳离子交换树脂 碱性基团（-N+R3，-NH3+，-NH2）阴离子交换树脂第62页/共67页（四）空间排阻色谱法要求要求：固定相多孔性凝胶 流动相水凝胶过滤色谱 流动相有机溶剂凝胶渗透色谱 分离机制分离机制见图示见图示渗透系数渗透系数 注：注：K Kp p仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径大小，仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径大小，与流动相的性质无关与流动相的性质无关 nextnext第63页/共67页图示分离机制分离机制：利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性 渗透实现分离 back第64页/共67页主要内容：色谱过程和分离原理基本概念和计算公式：保留值、分配系数K K、容量因子k k、n n、H H、R R（见P454P454）色谱基本理论：塔板理论、速率理论基本类型色谱机制第65页/共67页练习：P456，思考题1，2，4、6、8、9、10P456，习题1，2，3，4第66页/共67页感谢您的观看！第67页/共67页