生化试验实验九：聚合酶链式反应课件.ppt

目目 录录聚合酶链式反应聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）实验九实验九核核聚聚变变 Nanjing medical university Department of biochemistry and molecular biology目目 录录实实 验验 目目 的的掌握掌握PCR实验的基本原理与操作方法实验的基本原理与操作方法理解理解PCR在分子生物实验技术中的重要性在分子生物实验技术中的重要性了解引物设计的一般要求了解引物设计的一般要求目目 录录实实 验验 原原 理理基本原理：体外模拟体内的基本原理：体外模拟体内的DNA复制复制PCR体系体系模板模板DNA(template)寡核苷酸引物寡核苷酸引物(primer)DNA聚合酶聚合酶(polymerase)合适的缓冲液合适的缓冲液(buffer)系统系统Mg2+目的基因或目的基因或DNA片段在体外片段在体外高效、快速、特异高效、快速、特异地扩增。地扩增。单脱氧核苷酸单脱氧核苷酸(dNTP)目目 录录PCR过程过程DNA变性变性(denaturation)DNA双链解链变为单链双链解链变为单链退火退火(annealing)DNA复性，引物与模板结合复性，引物与模板结合延伸延伸(extension)引物沿引物沿53端延伸合成新链端延伸合成新链1个循环个循环(cycle)目目 录录目目 录录变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C目目 录录PCRPCR的产物数目的产物数目的产物数目的产物数目以指数级方式增长以指数级方式增长以指数级方式增长以指数级方式增长DNADNA片段片段片段片段Cycle 1Cycle 1Cycle 2Cycle 2Cycle 3Cycle 3Cycle NCycle N理论上可达理论上可达理论上可达理论上可达2 2n n个拷贝个拷贝个拷贝个拷贝原料原料原料原料（pgpg）产物产物产物产物(ugug)目的基因或目的基因或DNA片段在体外片段在体外高效、快速、特异高效、快速、特异地扩增地扩增g mg u ug ng pg ng pg目目 录录Plateau Effect in PCR AmplificationPCR扩增的平台期扩增的平台期目目 录录目目 录录 2、PCR反应预变性预变性 94 5min94 5min变性变性 94 30s94 30s退火退火 54 45s54 45s延伸延伸 72 45s72 45s末次延伸末次延伸 72 3min72 3min20-30cycles目目 录录3、琼脂糖电泳观察结果10l PCR反应产物，加反应产物，加2l上样缓冲液上样缓冲液；2%琼脂糖凝胶，琼脂糖凝胶，90120mA，电泳，电泳20 40min；紫外分析仪观察结果。紫外分析仪观察结果。目目 录录目目 录录注意事项注意事项1、各种试剂的用量均非常微小，注意微量移液器的、各种试剂的用量均非常微小，注意微量移液器的 使用，避免不当操作造成的误差；使用，避免不当操作造成的误差；2、不要在管壁上做标记，以免影响、不要在管壁上做标记，以免影响PCR仪的导热性；仪的导热性；3、注意琼脂糖凝胶电泳中、注意琼脂糖凝胶电泳中EB的污染的污染4、所用的、所用的PCR扩增管、枪头都要灭菌。扩增管、枪头都要灭菌。5、每次实验都要设置阴性和阳性对照。、每次实验都要设置阴性和阳性对照。6、根据引物的融解温度设定退火温度，防止出现、根据引物的融解温度设定退火温度，防止出现 非特异性扩增产物。非特异性扩增产物。目目 录录目目 录录目目 录录l美国黄石国家公园温泉美国黄石国家公园温泉lMW:94KDl扩增最长序列：扩增最长序列：10kbTaq 酶的发现酶的发现目目 录录