液相色谱基础知识幻灯片.ppt

液相色液相色谱谱基基础础知知识识第1页，共53页，编辑于2022年，星期日一、色谱起源一、色谱起源石油石油醚醚碳酸碳酸钙颗钙颗粒粒色素色素色色谱谱组组分分第2页，共53页，编辑于2022年，星期日HPLCHPLCHPLCHPLC的分离的分离的分离的分离类类类类型型型型l l正相色谱正相色谱(NP-HPLC)(NP-HPLC)l l反相色谱反相色谱(RP-HPLC)(RP-HPLC)l l反相离子对色谱反相离子对色谱(RPIC)(RPIC)l l离子交换色谱离子交换色谱(IEC)(IEC)l l空间排阻色谱空间排阻色谱(SEC)(SEC)l l手性化合物分离模式手性化合物分离模式(Chiral separation(Chiral separation mode)mode)第3页，共53页，编辑于2022年，星期日液相色谱按两相极性不同分为液相色谱按两相极性不同分为:正相色谱正相色谱反相色谱反相色谱 化合物保留时间随流动相配比的变化化合物保留时间随流动相配比的变化 不同极性的化合物出峰顺序不同极性的化合物出峰顺序第4页，共53页，编辑于2022年，星期日正相正相HPLCHPLC色色谱谱柱柱 硅胶型硅胶型 氰基型氰基型 氨基型氨基型 糖类分析糖类分析 二醇基型二醇基型 蛋白质分析蛋白质分析Silica gelSiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)Modified Si第5页，共53页，编辑于2022年，星期日反反 相相 HPLCHPLC色色 谱谱 柱柱C18(ODS)type C18(ODS)type C8(octyl)typeC8(octyl)typeC4(butyl)typeC4(butyl)typePhenyl type Phenyl type TMS typeTMS typeCyano typeCyano type-Si-C18H37SiNon-polar property第6页，共53页，编辑于2022年，星期日色谱柱色谱柱:非极性非极性溶剂溶剂:极性极性水水 /甲醇甲醇 /乙腈乙腈反反 相相 色色 谱谱第7页，共53页，编辑于2022年，星期日保留保留时间时间和疏水性和疏水性OHOHC18(ODS)StrongWeak第8页，共53页，编辑于2022年，星期日固固 定定 相相 作作 用用C18(ODS)StrongC8samplesamplesampleC4MediumWeak第9页，共53页，编辑于2022年，星期日液相色谱流程图输输液液泵泵进样进样器器色色谱谱柱柱柱温箱柱温箱检测检测器器溶溶剂剂数据数据处处理理第10页，共53页，编辑于2022年，星期日流动相流动相选择注意事项：流动相选择注意事项：纯度：采用纯度：采用“HPLC”级溶剂级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂剂对试样有适宜的溶解度对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小溶剂粘度要小与检测器相匹配与检测器相匹配流动相配制时的顺序流动相配制时的顺序第11页，共53页，编辑于2022年，星期日溶溶 剂剂 等等 级级水的等级水的等级水的等级水的等级纯化水纯化水纯化水纯化水蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水去离子水去离子水去离子水去离子水波长波长(nm)纯化水纯化水去离子水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物纯化水中去除了无机和有机的污染物吸吸吸吸光光光光率率率率第12页，共53页，编辑于2022年，星期日水水/MeOH梯度梯度ODS 柱柱鬼峰鬼峰Gradient Curve1 ml/min,0-100%MeOHover 10 mins and hold for15 mins.溶溶 剂剂 等等 级级鬼峰的出现鬼峰的出现鬼峰的出现鬼峰的出现第13页，共53页，编辑于2022年，星期日溶溶 剂剂 等等 级级溶剂的等级溶剂的等级溶剂的等级溶剂的等级HPLCHPLCHPLCHPLC级级级级优级纯优级纯优级纯优级纯分析纯分析纯分析纯分析纯都经过蒸馏和都经过蒸馏和0.45u的过滤的过滤(除纤维毛除纤维毛,未溶解的机械颗粒未溶解的机械颗粒优级纯的纯度比分析纯大优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过级经过0.2u的过滤的过滤,且除去有紫外吸收的杂质且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱微量分析、梯度洗脱微量分析、梯度洗脱微量分析、梯度洗脱第14页，共53页，编辑于2022年，星期日甲醇甲醇 乙睛乙睛 正己烷正己烷分析纯级和HPLC级溶剂的吸光度比较图溶溶 剂剂 等等 级级第15页，共53页，编辑于2022年，星期日溶剂前处理 过滤：过滤：0.45um0.45um或更小孔径滤膜或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。过滤膜种类过滤膜种类 水系过滤膜水系过滤膜 有机系过滤膜有机系过滤膜第16页，共53页，编辑于2022年，星期日溶剂前处理 脱气脱气脱气脱气 目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡泡 一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能容纳的空气总量要小溶剂所能容纳的空气总量要小 气泡对测定的影响：气泡对测定的影响：1 1）柱压波动，流量偏小）柱压波动，流量偏小 2 2）基线波动）基线波动 返回第17页，共53页，编辑于2022年，星期日流路中形成气泡引起的问题流路中形成气泡引起的问题改变保留时间和峰面积改变保留时间和峰面积流动相中形成气泡对液流的不良影响流动相中形成气泡对液流的不良影响流动相中形成气泡对液流的不良影响流动相中形成气泡对液流的不良影响泵中形成气泡使液流波动泵中形成气泡使液流波动泵中形成气泡使液流波动泵中形成气泡使液流波动峰变形峰变形柱中气泡形成和累积使流动相绕流柱中气泡形成和累积使流动相绕流柱中气泡形成和累积使流动相绕流柱中气泡形成和累积使流动相绕流尖峰或锯齿状噪声尖峰或锯齿状噪声检测池中气泡形成和累积产生基线噪声检测池中气泡形成和累积产生基线噪声检测池中气泡形成和累积产生基线噪声检测池中气泡形成和累积产生基线噪声第18页，共53页，编辑于2022年，星期日输液泵 输液泵控制方式：输液泵控制方式：恒流控制恒流控制恒流控制恒流控制 恒压控制恒压控制恒压控制恒压控制输液泵类型：输液泵类型：输液泵类型：输液泵类型：注射泵注射泵 柱塞往复泵柱塞往复泵柱塞往复泵柱塞往复泵 隔膜泵隔膜泵隔膜泵隔膜泵第19页，共53页，编辑于2022年，星期日柱塞往复泵柱塞往复泵单单向向阀阀马马达和凸达和凸轮轮柱塞杆柱塞杆柱塞杆密封圈柱塞杆密封圈泵头泵头10-100uL第20页，共53页，编辑于2022年，星期日柱塞往复泵柱塞往复泵优点优点压力脉动小压力脉动小易于更换溶剂易于更换溶剂缺点缺点需要更换柱塞杆密封圈需要更换柱塞杆密封圈第21页，共53页，编辑于2022年，星期日等度洗脱等度洗脱输输液液泵泵进样进样器器色色谱谱柱柱柱温箱柱温箱检测检测器器单单一或混合溶一或混合溶剂剂第22页，共53页，编辑于2022年，星期日梯度洗脱梯度洗脱 A 泵泵进样进样器器色色谱谱柱柱柱温箱柱温箱检测检测器器 B泵泵AB时间时间B 浓浓度度第23页，共53页，编辑于2022年，星期日分析分析时间长时间长分离度差分离度差 MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(column:ODS type)等度洗脱等度洗脱第24页，共53页，编辑于2022年，星期日95%30%MeOH 浓浓度度梯度洗脱梯度洗脱第25页，共53页，编辑于2022年，星期日梯度洗脱：梯度洗脱：优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度注意事项：注意事项：v溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差v梯度混合的溶剂互溶性要好v梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）第26页，共53页，编辑于2022年，星期日混合器混合器低低压压梯度比例梯度比例阀阀 高高压压梯度梯度低低压压梯度梯度脱气机脱气机高压高压/低压梯度系统低压梯度系统第27页，共53页，编辑于2022年，星期日返回高压梯度系统高压梯度系统梯度准确度好梯度准确度好梯度准确度好梯度准确度好系统复杂系统复杂系统复杂系统复杂(需两台或三台泵需两台或三台泵需两台或三台泵需两台或三台泵)低压梯度系统低压梯度系统系统简单系统简单系统简单系统简单需在线脱气机需在线脱气机需在线脱气机需在线脱气机存在时间滞后效应存在时间滞后效应存在时间滞后效应存在时间滞后效应高压高压/低压梯度系统低压梯度系统第28页，共53页，编辑于2022年，星期日进样器 自动进样器自动进样器 手动进样器手动进样器 原理：（原理：（六通阀六通阀）注入方式：注入方式：1 1 1 1）全量注入全量注入全量注入全量注入 2 2 2 2）部分注入）部分注入）部分注入）部分注入返回第29页，共53页，编辑于2022年，星期日手动进样器的原理图手动进样器的原理图 装填状态装填状态进样状态进样状态返回第30页，共53页，编辑于2022年，星期日进样进样体体积积 检检测测器器响响应应值值定量管体定量管体积积的一半的一半3倍定量管体倍定量管体积积全量注入全量注入部分注入部分注入进样体积与响应值关系进样体积与响应值关系返回第31页，共53页，编辑于2022年，星期日柱温箱分析结果重现性好分析结果重现性好提高柱效提高柱效降低柱压降低柱压保证检测稳定性保证检测稳定性 柱温控制的优点：柱温控制的优点：第32页，共53页，编辑于2022年，星期日色谱柱1 1）柱压低于）柱压低于150kgf/cm2（15cm色谱柱）色谱柱）2 2）柱温在柱温在40左右，最高使用温度为左右，最高使用温度为503 3）流动相）流动相PH使用范围为使用范围为27.5返回ODS柱的使用注意点：柱的使用注意点：第33页，共53页，编辑于2022年，星期日流动相注意点流动相注意点离子对试剂的使用离子对试剂的使用具有缓冲盐流动相的使用具有缓冲盐流动相的使用 分析结束及开始分析结束及开始流动相平衡流动相平衡 加快平衡时间加快平衡时间异丙醇的使用异丙醇的使用第34页，共53页，编辑于2022年，星期日LC检测器检测器 紫外可见检测器紫外可见检测器（UV/VIS）二极管阵列检测器二极管阵列检测器（PDA）示差检测器示差检测器（RID）电导检测器电导检测器（CDD）荧光检测器荧光检测器（RF）电化学检测器电化学检测器（L-ECD）质谱检测器质谱检测器（MS）蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器（ELSD）第35页，共53页，编辑于2022年，星期日紫外可见检测器原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收定量基础：定量基础：定量基础：定量基础：Lambert-BeerLambert-Beer定律，定律，定律，定律，A AKCLKCL优点：优点：优点：优点：1 1 1 1）对温度和流速变化不敏感）对温度和流速变化不敏感）对温度和流速变化不敏感）对温度和流速变化不敏感 2 2 2 2）可用于梯度分析）可用于梯度分析）可用于梯度分析）可用于梯度分析缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质紫外可见检测器紫外可见检测器第36页，共53页，编辑于2022年，星期日样样品池品池参比池参比池光光电电管管光光电电管管EinEinEin光光栅栅D2/W 灯灯l lEout紫外可见检测器紫外可见检测器第37页，共53页，编辑于2022年，星期日岛津岛津VPVP系列紫外检测器功能系列紫外检测器功能1 1）设定时间程序（）设定时间程序（波长切换波长切换等）等）2 2）双波长检测双波长检测3 3）比例色谱比例色谱，初步判断峰的纯度，初步判断峰的纯度4 4）停泵扫描停泵扫描，确定组分最大吸收波，确定组分最大吸收波长长NEXT第38页，共53页，编辑于2022年，星期日波长切换波长切换波长切换波长切换返回第39页，共53页，编辑于2022年，星期日双波长检测双波长检测双波长检测双波长检测返回第40页，共53页，编辑于2022年，星期日比例色谱比例色谱比例色谱比例色谱280nm220 nmratio280/220返回第41页，共53页，编辑于2022年，星期日波长扫描波长扫描波长扫描波长扫描返回第42页，共53页，编辑于2022年，星期日二极管阵列检测器（二极管阵列检测器（SPDM10AVP）二十一世纪标准紫外检测器二十一世纪标准紫外检测器色谱信息：色谱信息：保留时间保留时间 常规紫外检测器常规紫外检测器 紫外光谱紫外光谱 二极管阵列检测器二极管阵列检测器第43页，共53页，编辑于2022年，星期日样样品池品池二极管二极管阵阵列（列（512个个单单元）元）光光栅栅D2/W灯灯每一每一单单元可元可检测检测一个一个波波长长下的吸光度下的吸光度二极管阵列检测器二极管阵列检测器二极管阵列检测器二极管阵列检测器第44页，共53页，编辑于2022年，星期日三维谱图三维谱图三维谱图三维谱图时间波长吸光度色色谱谱光光谱谱第45页，共53页，编辑于2022年，星期日二极管阵列检测器的优点1）采集三维谱图采集三维谱图2 2）峰纯度检验峰纯度检验3 3）光谱库检索光谱库检索NEXT第46页，共53页，编辑于2022年，星期日峰纯度检验（峰纯度检验（3 3点光谱图比较）点光谱图比较）Initial detection Initial detection pointpointFinal detection Final detection pointpointT1T3T2peak toppeak topup slopeup slopedown slopedown slope1/21/3第47页，共53页，编辑于2022年，星期日乙酰水杨酸乙酰水杨酸下降点下降点上升点上升点,顶点顶点峰纯度检验（峰纯度检验（峰纯度检验（峰纯度检验（3 3点光谱图比较）点光谱图比较）点光谱图比较）点光谱图比较）返回第48页，共53页，编辑于2022年，星期日光谱库检索光谱库检索光谱库检索光谱库检索返回第49页，共53页，编辑于2022年，星期日检测器原理：连续测定流通池中溶液折射率变化以测定原理：连续测定流通池中溶液折射率变化以测定 试样各组分浓度。试样各组分浓度。优点：通用型检测器优点：通用型检测器缺点：缺点：1 1）对温度和压力变化敏感）对温度和压力变化敏感 2 2）不能用于梯度分析）不能用于梯度分析示差折光检测器示差折光检测器返回第50页，共53页，编辑于2022年，星期日糖的色谱图Analytical ConditionsAnalytical ConditionsColumn:Shim-pack CLC-NH2Column:Shim-pack CLC-NH2Mobile phase:Acetonitrile/Mobile phase:Acetonitrile/water =7/3water =7/3Flow rate:1.0 mL/minFlow rate:1.0 mL/minTemperature:AmbientTemperature:AmbientPeaksPeaks 1.1.甘油甘油甘油甘油 2.2.木糖木糖木糖木糖 3.3.果糖果糖果糖果糖 4.4.葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖 5.5.蔗糖蔗糖蔗糖蔗糖 6.6.甘露糖甘露糖甘露糖甘露糖 7.7.乳糖乳糖乳糖乳糖第51页，共53页，编辑于2022年，星期日数据处理岛津液相色谱数据处理单元：岛津液相色谱数据处理单元：CLASSVP色谱工作站色谱工作站CR6A色谱数据处理机色谱数据处理机CR7A色谱数据处理机色谱数据处理机CR8A色谱数据处理机色谱数据处理机返回第52页，共53页，编辑于2022年，星期日液相色谱流程图液相色谱流程图输输液液泵泵进样进样器器色色谱谱柱柱柱温箱柱温箱检测检测器器溶溶剂剂数据数据处处理理第53页，共53页，编辑于2022年，星期日