凝胶层析分离技术.pptx
会计学1凝胶层析分离技术凝胶层析分离技术第十章第十章第十章第十章 凝胶层析法凝胶层析法凝胶层析法凝胶层析法第一节凝胶的条件和类型第一节凝胶的条件和类型第一节凝胶的条件和类型第一节凝胶的条件和类型第二节基本原理第二节基本原理第二节基本原理第二节基本原理第三节第三节第三节第三节 凝胶层析的实验技术凝胶层析的实验技术凝胶层析的实验技术凝胶层析的实验技术 第四节第四节第四节第四节 凝胶层析的应用凝胶层析的应用凝胶层析的应用凝胶层析的应用第1页/共43页第一节第一节 凝胶的条件凝胶的条件和类型和类型n n层析凝胶必须具备下列条件：层析凝胶必须具备下列条件：层析凝胶必须具备下列条件：层析凝胶必须具备下列条件：n n凝胶层析中常用凝胶类型凝胶层析中常用凝胶类型凝胶层析中常用凝胶类型凝胶层析中常用凝胶类型第2页/共43页层析凝胶必须具备下列条件层析凝胶必须具备下列条件1.1.1.1.凝胶必须是化学惰性的凝胶必须是化学惰性的 2.2.2.2.凝胶的化学性质必须是稳定凝胶的化学性质必须是稳定的的 3.3.3.3.凝胶上没有或只有极少量的凝胶上没有或只有极少量的离子基团离子基团4.4.4.4.凝胶必须具有足够的机械强凝胶必须具有足够的机械强度度 第3页/共43页凝胶层析中常用凝胶凝胶层析中常用凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶(dextran geldextran geldextran geldextran gel，SephadexSephadexSephadexSephadex)聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gelpolyacrylamide gelpolyacrylamide gelpolyacrylamide gel，Bio-Gel PBio-Gel PBio-Gel PBio-Gel P)琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶(agarose gelagarose gelagarose gelagarose gel，SepharoseSepharoseSepharoseSepharose)琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶(SuperdexSuperdexSuperdexSuperdex)第4页/共43页葡聚糖凝胶部分结构葡聚糖凝胶部分结构葡聚糖凝胶部分结构葡聚糖凝胶部分结构葡葡葡葡聚聚聚聚糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶部部部部分分分分结结结结构构构构(Sephadex)第5页/共43页聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶的的部部分分结结构构(Bio-Gel P)第6页/共43页琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶(Sepharose)(Sepharose)(Sepharose)(Sepharose)(Sepharose)琼脂糖凝胶的部分结构第7页/共43页第二节第二节第二节第二节 基基基基 本本本本 原原原原 理理理理 一、凝胶的结构与分子筛效应一、凝胶的结构与分子筛效应一、凝胶的结构与分子筛效应一、凝胶的结构与分子筛效应 二、凝胶床总体积二、凝胶床总体积二、凝胶床总体积二、凝胶床总体积三、分配系数（三、分配系数（三、分配系数（三、分配系数（KdKdKdKd）四、有效分配系数（四、有效分配系数（四、有效分配系数（四、有效分配系数（KavKavKavKav）五、分子量与五、分子量与五、分子量与五、分子量与Ve Ve Ve Ve 的关系的关系的关系的关系第8页/共43页 一、凝胶的结构与分子筛效应一、凝胶的结构与分子筛效应一、凝胶的结构与分子筛效应一、凝胶的结构与分子筛效应 动画演示第9页/共43页二、凝胶床总体积二、凝胶床总体积二、凝胶床总体积二、凝胶床总体积 Vt Vt ：柱床柱床“总容积总容积”，VoVo：即存在于柱床内凝：即存在于柱床内凝 胶颗粒外面空隙之间的胶颗粒外面空隙之间的 水相容积水相容积 ViVi：即凝胶颗粒内部所：即凝胶颗粒内部所 含水相的容积。含水相的容积。VgVg：凝胶本身的容积；：凝胶本身的容积；VtVo十十Vi十十Vg 或或 Vt-Vo=Vi十十Vg，第10页/共43页三、分配系数（三、分配系数（三、分配系数（三、分配系数（K K K Kd d d d）0Kd1，Ve在在Vo与与Vo十十Vi之间变化之间变化VeVe：为实际测得的洗：为实际测得的洗脱容积，自样品加入脱容积，自样品加入到组分最大浓度到组分最大浓度(峰峰)出出现时所流出的容积；现时所流出的容积；VeVo十十KdVi第11页/共43页四、有效分配系数（四、有效分配系数（四、有效分配系数（四、有效分配系数（K K K Keffeffeffeff）将将Vt-VoVt-Vo代替代替ViVi，则：，则：即：即：VeVeVoVo十十K Keffeff(Vt-Vo)(Vt-Vo)实际上，实际上，KKeff是是将以水作为固定相将以水作为固定相(Vi)(Vi)改为水与凝胶颗粒改为水与凝胶颗粒(Vt-Vo)(Vt-Vo)作为固定相，作为固定相，而洗脱剂而洗脱剂(Ve-Vo)(Ve-Vo)为流动相。为流动相。KavKav与与KdKd对交联度小的凝胶差别较小，而对对交联度小的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。交联度大的凝胶差别大。在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过VtVt体积体积后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析法的特点，后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析法的特点，第12页/共43页五、五、五、五、VeVeVeVe与相对分子量的关系与相对分子量的关系与相对分子量的关系与相对分子量的关系 Ve=KVe=K1 1-K-K2 2lgM lgM K K K K1 1 1 1、K K K K2 2 2 2为常数，为常数，为常数，为常数，VeVeVeVe可用如下表可用如下表可用如下表可用如下表达式代替，达式代替，达式代替，达式代替，Ve-VoVe-VoVe-VoVe-Vo（分离体积），（分离体积），（分离体积），（分离体积），Ve/VoVe/VoVe/VoVe/Vo（相对保留体积），（相对保留体积），（相对保留体积），（相对保留体积），Ve/VtVe/VtVe/VtVe/Vt（简化洗脱体积），（简化洗脱体积），（简化洗脱体积），（简化洗脱体积），K K K Keffeffeffeff（相对洗脱体积）（相对洗脱体积）（相对洗脱体积）（相对洗脱体积）在不同型号凝胶上蛋在不同型号凝胶上蛋在不同型号凝胶上蛋在不同型号凝胶上蛋白质的选择曲线的白质的选择曲线的白质的选择曲线的白质的选择曲线的差异差异差异差异第13页/共43页第三节第三节 凝胶层析的操凝胶层析的操作技术作技术一、凝胶的选择与处理一、凝胶的选择与处理一、凝胶的选择与处理一、凝胶的选择与处理二、凝胶装拄制备二、凝胶装拄制备二、凝胶装拄制备二、凝胶装拄制备三、样品上柱及洗脱三、样品上柱及洗脱三、样品上柱及洗脱三、样品上柱及洗脱 四、实验操作四、实验操作四、实验操作四、实验操作五、凝胶柱的保养和凝胶的保存五、凝胶柱的保养和凝胶的保存五、凝胶柱的保养和凝胶的保存五、凝胶柱的保养和凝胶的保存 第14页/共43页一、凝胶的选择一、凝胶的选择 n n排阻范围与粒度的选排阻范围与粒度的选择择n n凝胶用量的计算凝胶用量的计算第15页/共43页排阻范围的选择排阻范围的选择第16页/共43页粒度的选择粒度的选择粒粒度度的的选选择择第17页/共43页凝胶用量的计算凝胶用量的计算凝胶用量的计算凝胶用量的计算干凝胶用量（干凝胶用量（干凝胶用量（干凝胶用量（g g g g）：）：）：）：rrrr2 2 2 2h/h/h/h/膨胀度膨胀度膨胀度膨胀度 （膨胀度：（膨胀度：（膨胀度：（膨胀度：床体积床体积床体积床体积/克干胶）克干胶）克干胶）克干胶）理论用量理论用量理论用量理论用量（1+10%1+10%1+10%1+10%）凝胶的处理）凝胶的处理）凝胶的处理）凝胶的处理SephadexSephadexG-25G-25G-75G-75G100G100G-150G-150G-200G-200（中）湿球粒度（中）湿球粒度（中）湿球粒度（中）湿球粒度 mm100-100-200200120-120-20020020-20-200200120-120-200200120-120-200200吸水值吸水值吸水值吸水值 ml/gml/g干胶干胶干胶干胶2.50.2.50.2 27.50.7.50.5 510.01.10.01.0 015.01.15.01.5 520.02.20.02.0 0床体积床体积床体积床体积 ml/gml/g干胶干胶干胶干胶4-64-612-1512-1515-2015-2020-3020-3030-4030-40球蛋白分离范围球蛋白分离范围球蛋白分离范围球蛋白分离范围 KDKD1-51-53-803-804-1504-1505-3005-3005-6005-600第18页/共43页二、凝胶装拄制备二、凝胶装拄制备1.1.1.1.柱结构（柱结构（、h h）的）的选择选择2.2.2.2.装柱装柱3.3.3.3.柱鉴定柱鉴定第19页/共43页柱结构（柱结构（柱结构（柱结构（、h h h h）的选择）的选择）的选择）的选择第20页/共43页三、样品上柱及洗脱三、样品上柱及洗脱n n加样量的控制加样量的控制 分析：分析：分析：分析：1-2ml/100ml1-2ml/100ml1-2ml/100ml1-2ml/100ml床体积床体积床体积床体积 制备：制备：制备：制备：10-30ml/100ml10-30ml/100ml10-30ml/100ml10-30ml/100ml床体积床体积床体积床体积n n洗脱液的选择洗脱液的选择 控制凝胶收缩控制凝胶收缩控制凝胶收缩控制凝胶收缩n n影响洗脱的影响洗脱的因素因素 流速对蛋白质分辨率的影响流速对蛋白质分辨率的影响流速对蛋白质分辨率的影响流速对蛋白质分辨率的影响 操作压与流速的关系操作压与流速的关系操作压与流速的关系操作压与流速的关系第21页/共43页流速对蛋白质分辨率的影响流速对蛋白质分辨率的影响流速对蛋白质分辨率的影响流速对蛋白质分辨率的影响第22页/共43页黏度对分辨率的影响黏度对分辨率的影响黏度对分辨率的影响黏度对分辨率的影响黏黏度度对对分分辨辨率率的的影影响响第23页/共43页凝胶柱层析操作压凝胶柱层析操作压凝胶柱层析操作压凝胶柱层析操作压第24页/共43页操作压与流速的关系操作压与流速的关系操作压与流速的关系操作压与流速的关系第25页/共43页加样量对分辨率的影响加样量对分辨率的影响加样量对分辨率的影响加样量对分辨率的影响 I.I.加养量少时，加养量少时，A A、B B二种物质充二种物质充全分开。全分开。II.II.加养量适当加养量适当时，时，A A、B B 二种物二种物质刚刚分开。质刚刚分开。III.III.加养量太大加养量太大时，时，A A、B B二种物二种物质只能部分分开。质只能部分分开。第26页/共43页四、四、四、四、凝胶层析的操作技术凝胶层析的操作技术凝胶层析的操作技术凝胶层析的操作技术1.1.1.1.凝胶的凝胶的凝胶的凝胶的处理处理处理处理2.2.2.2.柱层析系统的柱层析系统的柱层析系统的柱层析系统的安装安装安装安装3.3.3.3.凝胶凝胶凝胶凝胶装拄装拄装拄装拄4.4.4.4.样品样品样品样品上柱及洗脱上柱及洗脱上柱及洗脱上柱及洗脱 5.5.5.5.VoVoVoVo、ViViViVi、VtVtVtVt的的的的测定测定测定测定6.6.6.6.标准曲线的制作及标准曲线的制作及标准曲线的制作及标准曲线的制作及KdKdKdKd和和和和KavKavKavKav的的的的计算计算计算计算7.7.7.7.凝胶柱的保养和凝胶的凝胶柱的保养和凝胶的凝胶柱的保养和凝胶的凝胶柱的保养和凝胶的保存保存保存保存 第27页/共43页1 1 1 1、凝胶的处理、凝胶的处理、凝胶的处理、凝胶的处理 将称好的干粉倾人过量将称好的干粉倾人过量将称好的干粉倾人过量将称好的干粉倾人过量的洗脱液中，室温下充分溶胀。的洗脱液中，室温下充分溶胀。的洗脱液中，室温下充分溶胀。的洗脱液中，室温下充分溶胀。注意不要过分搅拌，以防颗粒破注意不要过分搅拌，以防颗粒破注意不要过分搅拌，以防颗粒破注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。碎。碎。碎。为了缩短溶胀时间，可在沸为了缩短溶胀时间，可在沸为了缩短溶胀时间，可在沸为了缩短溶胀时间，可在沸水浴中加热溶胀水浴中加热溶胀水浴中加热溶胀水浴中加热溶胀3-53-53-53-5小时，这样还小时，这样还小时，这样还小时，这样还可以杀死细菌和霉菌，并排除凝可以杀死细菌和霉菌，并排除凝可以杀死细菌和霉菌，并排除凝可以杀死细菌和霉菌，并排除凝胶内气泡。胶内气泡。胶内气泡。胶内气泡。为了保证流速稳定，获为了保证流速稳定，获为了保证流速稳定，获为了保证流速稳定，获得较好的实验结果，使用前用倾得较好的实验结果，使用前用倾得较好的实验结果，使用前用倾得较好的实验结果，使用前用倾泻法倾去不易沉下的较细颗粒，泻法倾去不易沉下的较细颗粒，泻法倾去不易沉下的较细颗粒，泻法倾去不易沉下的较细颗粒，使凝胶颗粒大小一致，。使凝胶颗粒大小一致，。使凝胶颗粒大小一致，。使凝胶颗粒大小一致，。第28页/共43页2 2 2 2、柱层析系统的组装、柱层析系统的组装、柱层析系统的组装、柱层析系统的组装柱层析系统的安装第29页/共43页3 3、凝胶装柱、凝胶装柱。将层析柱垂直装载支架上，将层析柱垂直装载支架上，将层析柱垂直装载支架上，将层析柱垂直装载支架上，将下端输液管夹紧；将下端输液管夹紧；将下端输液管夹紧；将下端输液管夹紧；向柱中加入约向柱中加入约向柱中加入约向柱中加入约1/31/31/31/3体积的体积的体积的体积的0.90.90.90.9NaClNaClNaClNaCl溶液；溶液；溶液；溶液；将一细玻棒伸入柱内，靠近将一细玻棒伸入柱内，靠近管内壁，顺着玻棒缓慢的向管内管内壁，顺着玻棒缓慢的向管内加入混匀的凝胶溶液；加入混匀的凝胶溶液；凝胶加至层析柱顶端约凝胶加至层析柱顶端约3cm3cm时，打开柱时，打开柱下端下端下端下端输液开关，使流输液开关，使流速控制在速控制在0.25-0.5ml/cm0.25-0.5ml/cm2 2nimnim。连续而缓慢的加凝胶直到稳连续而缓慢的加凝胶直到稳定在离管口约定在离管口约5cm5cm处。处。（防止空气进入凝胶床）（防止空气进入凝胶床）第30页/共43页4 4 4 4、样品上柱及洗脱、样品上柱及洗脱、样品上柱及洗脱、样品上柱及洗脱加样量的控制加样量的控制加样量的控制加样量的控制分析：分析：分析：分析：1-2ml/100ml1-2ml/100ml1-2ml/100ml1-2ml/100ml床体积，床体积，床体积，床体积，制备：制备：制备：制备：10-30ml/100ml10-30ml/100ml10-30ml/100ml10-30ml/100ml床体积床体积床体积床体积 洗脱液的选择：洗脱液的选择：洗脱液的选择：洗脱液的选择：洗脱液应与浸泡凝胶时所用的溶洗脱液应与浸泡凝胶时所用的溶洗脱液应与浸泡凝胶时所用的溶洗脱液应与浸泡凝胶时所用的溶液一致，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化液一致，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化液一致，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化液一致，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果。而影响分离效果。而影响分离效果。而影响分离效果。凝胶层析加样凝胶层析加样凝胶层析加样凝胶层析加样操作示意图操作示意图操作示意图操作示意图洗脱与自动收集洗脱与自动收集洗脱与自动收集洗脱与自动收集记录记录记录记录凝胶柱层析凝胶柱层析凝胶柱层析凝胶柱层析实物实物实物实物连接连接连接连接凝胶层析中的凝胶层析中的凝胶层析中的凝胶层析中的分离行为分离行为分离行为分离行为第31页/共43页凝胶层析加样操作示意图凝胶层析加样操作示意图凝胶层析加样操作示意图凝胶层析加样操作示意图 1、平衡好的层析柱。、平衡好的层析柱。2、沿管壁将样品溶液小心加、沿管壁将样品溶液小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起。胶冲起。3-4、打开下口夹子，使样品、打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，溶液流入柱内，同时收集流出液，5-7、当样品溶液流至与胶面、当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用操作，用1mL洗脱液冲洗管壁洗脱液冲洗管壁2次。次。8-9、最后加入、最后加入34mL洗脱液洗脱液于凝胶上。于凝胶上。10、连接柱层析系统，自动收、连接柱层析系统，自动收集记录。集记录。第32页/共43页洗脱与自动收集记录洗脱与自动收集记录洗脱与自动收集记录洗脱与自动收集记录第33页/共43页凝胶柱层析实物连接凝胶柱层析实物连接凝胶柱层析实物连接凝胶柱层析实物连接第34页/共43页凝胶层析中的分离行为凝胶层析中的分离行为凝胶层析中的分离行为凝胶层析中的分离行为蓝葡聚糖（兰色）、血红蛋白（红色）、铬酸钾蓝葡聚糖（兰色）、血红蛋白（红色）、铬酸钾蓝葡聚糖（兰色）、血红蛋白（红色）、铬酸钾蓝葡聚糖（兰色）、血红蛋白（红色）、铬酸钾(黄色黄色黄色黄色)第35页/共43页5 5 5 5、VoVoVoVo、ViViViVi、VtVtVtVt的测定的测定的测定的测定VoVoVoVo的测定的测定的测定的测定 选选选选用分子量约用分子量约用分子量约用分子量约200200200200万的蓝色葡聚糖万的蓝色葡聚糖万的蓝色葡聚糖万的蓝色葡聚糖-2000-2000-2000-2000（或一种（或一种（或一种（或一种不被凝胶滞留的有颜色的大分子物质，便于观察不被凝胶滞留的有颜色的大分子物质，便于观察不被凝胶滞留的有颜色的大分子物质，便于观察不被凝胶滞留的有颜色的大分子物质，便于观察)，测定它，测定它，测定它，测定它的洗脱曲线，洗脱峰峰顶洗出的体积（的洗脱曲线，洗脱峰峰顶洗出的体积（的洗脱曲线，洗脱峰峰顶洗出的体积（的洗脱曲线，洗脱峰峰顶洗出的体积（VeoVeoVeoVeo）就是该柱的）就是该柱的）就是该柱的）就是该柱的VoVoVoVo值。值。值。值。ViViViVi的测定的测定的测定的测定 选用一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，选用一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，选用一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，选用一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，测出其洗脱体积测出其洗脱体积测出其洗脱体积测出其洗脱体积VeiVeiVeiVei，减去，减去，减去，减去VoVoVoVo就是该柱的就是该柱的就是该柱的就是该柱的Vi Vi Vi Vi。常用铬酸钾。常用铬酸钾。常用铬酸钾。常用铬酸钾(黄色黄色黄色黄色)或有或有或有或有UVUVUVUV吸收的物质如吸收的物质如吸收的物质如吸收的物质如N-N-N-N-乙酰酪氨酸乙酯来测定乙酰酪氨酸乙酯来测定乙酰酪氨酸乙酯来测定乙酰酪氨酸乙酯来测定ViViViVi。VtVtVtVt的测定的测定的测定的测定式中，式中，为常数为常数3.143.14，D D为柱直径，为柱直径，h h为凝胶床的高度。为凝胶床的高度。第36页/共43页6 6 6 6、标准曲线的制作及、标准曲线的制作及、标准曲线的制作及、标准曲线的制作及KdKdKdKd和和和和KavKavKavKav的计算的计算的计算的计算 n n按操作技术按操作技术4 4的方法，将的方法，将1mL1mL标准蛋白质混合液上柱，标准蛋白质混合液上柱，然后用然后用0.025mol0.025molL L氯化钾氯化钾-0.2mol-0.2molL L乙酸溶液洗脱。乙酸溶液洗脱。流速流速3mL3mL10min10min，3mL3mL管。用核酸蛋白质检测仪管。用核酸蛋白质检测仪280nm280nm处检测，用部分收集器收集，记录洗脱曲线，或处检测，用部分收集器收集，记录洗脱曲线，或收集后用紫外分光光度计于收集后用紫外分光光度计于280nm280nm处测定每管光吸收值。处测定每管光吸收值。n n以管号以管号(或洗脱体积或洗脱体积)为横坐标，光吸收值为纵坐标作为横坐标，光吸收值为纵坐标作出洗脱曲线。出洗脱曲线。n n根据洗脱峰位置，量出每种蛋白质的洗脱体积根据洗脱峰位置，量出每种蛋白质的洗脱体积(Ve)(Ve)，以蛋白质分子量的对数以蛋白质分子量的对数1gMr1gMr，为纵坐标，为纵坐标，VeVe为横坐标，为横坐标，作出标准曲线。作出标准曲线。n n根据已测出的根据已测出的VoVo和和ViVi以及以及VtVt，分别求出，分别求出KdKd和和KavKav第37页/共43页7 7 7 7、未知样品分子量的测定、未知样品分子量的测定、未知样品分子量的测定、未知样品分子量的测定 完全按照标准曲线的条件操作。根据紫外检测的洗脱峰位置，量出洗脱体积，重复测定1-2次，取其平均值。也可以计算出Kav分别由标准曲线查得样品的分子量。第38页/共43页8 8、凝胶柱的保养和凝胶的保存、凝胶柱的保养和凝胶的保存凝胶的保存可采用以下两种方法：凝胶的保存可采用以下两种方法：凝胶的保存可采用以下两种方法：凝胶的保存可采用以下两种方法：（1 1 1 1）经经经经常常常常使使使使用用用用的的的的凝凝凝凝胶胶胶胶以以以以湿湿湿湿态态态态保保保保存存存存为为为为宜宜宜宜，加加加加入入入入适适适适当的抑菌剂。常用的抑菌剂当的抑菌剂。常用的抑菌剂当的抑菌剂。常用的抑菌剂当的抑菌剂。常用的抑菌剂:0.02:0.02:0.02:0.02叠氮钠叠氮钠叠氮钠叠氮钠 (2)(2)(2)(2)较长时期不使用的凝胶可采用干燥保存法。较长时期不使用的凝胶可采用干燥保存法。较长时期不使用的凝胶可采用干燥保存法。较长时期不使用的凝胶可采用干燥保存法。依依依依次次次次用用用用70707070、90909090和和和和95959595乙乙乙乙醇醇醇醇逐逐逐逐步步步步脱脱脱脱水水水水，使使使使凝凝凝凝胶胶胶胶皱皱皱皱缩缩缩缩，最最最最后后后后用用用用乙乙乙乙醚醚醚醚洗洗洗洗涤涤涤涤干干干干燥燥燥燥或或或或在在在在60-60-60-60-80808080下烘干。下烘干。下烘干。下烘干。第39页/共43页第五节第五节 凝胶层析的应用凝胶层析的应用n n脱盐和浓缩 n n分离生命物质 n n测定分子量 第40页/共43页思考题思考题 凝胶过滤分离大分子物质的机理是什么？分子量为凝胶过滤分离大分子物质的机理是什么？分子量为凝胶过滤分离大分子物质的机理是什么？分子量为凝胶过滤分离大分子物质的机理是什么？分子量为8 8 8 8万和万和万和万和10101010万的蛋白质能否在万的蛋白质能否在万的蛋白质能否在万的蛋白质能否在Sephadex G-75Sephadex G-75Sephadex G-75Sephadex G-75柱中分开？为什柱中分开？为什柱中分开？为什柱中分开？为什么？么？么？么？概述哪些因子影响凝胶过滤的分辨率？为什么？概述哪些因子影响凝胶过滤的分辨率？为什么？概述哪些因子影响凝胶过滤的分辨率？为什么？概述哪些因子影响凝胶过滤的分辨率？为什么？在在在在460cm460cm460cm460cm和和和和160cm160cm160cm160cm；140cm140cm140cm140cm和和和和180cm180cm180cm180cm两组交两组两组交两组两组交两组两组交两组交联葡聚糖交联葡聚糖交联葡聚糖交联葡聚糖G-100G-100G-100G-100柱中，当每柱中，当每柱中，当每柱中，当每cm2cm2cm2cm2截面积上流速和分级收集截面积上流速和分级收集截面积上流速和分级收集截面积上流速和分级收集体积一致时，问两组柱中那一种分辨率高？为什么？体积一致时，问两组柱中那一种分辨率高？为什么？体积一致时，问两组柱中那一种分辨率高？为什么？体积一致时，问两组柱中那一种分辨率高？为什么？在凝胶层析柱中分离某有效成分时，洗脱体积为在凝胶层析柱中分离某有效成分时，洗脱体积为在凝胶层析柱中分离某有效成分时，洗脱体积为在凝胶层析柱中分离某有效成分时，洗脱体积为140ml,140ml,140ml,140ml,其外水体积和总体积分别为其外水体积和总体积分别为其外水体积和总体积分别为其外水体积和总体积分别为60606060和和和和200ml200ml200ml200ml，求分配系，求分配系，求分配系，求分配系数是多少？数是多少？数是多少？数是多少？在在在在5.060cm5.060cm5.060cm5.060cm的凝胶柱中脱盐时，就理论值而言，最多的凝胶柱中脱盐时，就理论值而言，最多的凝胶柱中脱盐时，就理论值而言，最多的凝胶柱中脱盐时，就理论值而言，最多加样体积是多少毫升？加样体积是多少毫升？加样体积是多少毫升？加样体积是多少毫升？第41页/共43页稍息稍息第42页/共43页
