凝胶层析法分离蛋白质.pptx

凝胶层析法分离蛋白质凝胶层析法分离蛋白质【目的目的】掌握凝胶层析的基本原理掌握凝胶层析的基本原理掌握凝胶层析的基本原理掌握凝胶层析的基本原理学习利用凝胶层析法分离生物学习利用凝胶层析法分离生物学习利用凝胶层析法分离生物学习利用凝胶层析法分离生物大分子和小分子的实验技能大分子和小分子的实验技能大分子和小分子的实验技能大分子和小分子的实验技能第1页/共16页 【原理原理】凝胶层析也称分子筛层析、凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据构的凝胶的分子筛作用，根据被分离被分离物质的分子大小不同物质的分子大小不同来来进行分离的技术。进行分离的技术。第2页/共16页 凝胶层析是按照蛋凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排过滤、分子筛层析或排阻层析。阻层析。单个凝胶珠本身象单个凝胶珠本身象“筛子筛子”。不同类型凝。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。胶的筛孔的大小不同。凝胶层析凝胶层析第3页/共16页带网孔的带网孔的葡聚糖珠葡聚糖珠小分子进入小分子进入葡聚糖珠内葡聚糖珠内大分子大分子不能进不能进入珠内，入珠内，经珠之经珠之间缝隙间缝隙流出流出凝胶层析过程示意图凝胶层析过程示意图第4页/共16页凝胶层析过程示意图凝胶层析过程示意图小分小分子子大分大分子子凝胶基凝胶基质质凝胶凝胶珠珠第5页/共16页总结：总结：相对分子质量较大相对分子质量较大相对分子质量较大相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔的物质由于直径大于凝胶网孔的物质由于直径大于凝胶网孔的物质由于直径大于凝胶网孔被完全被完全被完全被完全排阻排阻排阻排阻在孔外，在孔外，在孔外，在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以流程较短，移动速度快；所以流程较短，移动速度快；所以流程较短，移动速度快；所以首先流出首先流出首先流出首先流出。相对分子质量较小相对分子质量较小相对分子质量较小相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可的物质由于直径小于凝胶网孔，可的物质由于直径小于凝胶网孔，可的物质由于直径小于凝胶网孔，可完完完完全渗透全渗透全渗透全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以流程较长，移动速率慢；所以流程较长，移动速率慢；所以流程较长，移动速率慢；所以最后流出最后流出最后流出最后流出。中等大小的分子中等大小的分子中等大小的分子中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外，它们在凝胶颗粒内外，它们在凝胶颗粒内外，它们在凝胶颗粒内外部分渗透部分渗透部分渗透部分渗透，渗透，渗透，渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样于二者之间，这样于二者之间，这样于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分分子大的组分先流出，分子小的组分分子大的组分先流出，分子小的组分分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。后流出。后流出。后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。第6页/共16页【实验器材实验器材】层析柱层析柱层析柱层析柱洗脱装置洗脱装置洗脱装置洗脱装置试管等普通玻璃器皿试管等普通玻璃器皿试管等普通玻璃器皿试管等普通玻璃器皿第7页/共16页【实验试剂实验试剂】待分离样品：待分离样品：待分离样品：待分离样品：1 1。鸡血红蛋白：取新鲜抗凝全血。鸡血红蛋白：取新鲜抗凝全血。鸡血红蛋白：取新鲜抗凝全血。鸡血红蛋白：取新鲜抗凝全血5ml5ml，于，于，于，于2000r/min2000r/min离心离心离心离心10min10min，弃血浆，用三倍于血球，弃血浆，用三倍于血球，弃血浆，用三倍于血球，弃血浆，用三倍于血球体积的体积的体积的体积的0.90.9 NaclNacl溶液洗血球（颠倒混匀）。离心弃去溶液洗血球（颠倒混匀）。离心弃去溶液洗血球（颠倒混匀）。离心弃去溶液洗血球（颠倒混匀）。离心弃去上清液，重复上清液，重复上清液，重复上清液，重复1 12 2次，至上清液清亮为止。于血球次，至上清液清亮为止。于血球次，至上清液清亮为止。于血球次，至上清液清亮为止。于血球中加入中加入中加入中加入1010倍体积的蒸馏水，混匀，使血球破碎，过倍体积的蒸馏水，混匀，使血球破碎，过倍体积的蒸馏水，混匀，使血球破碎，过倍体积的蒸馏水，混匀，使血球破碎，过滤，即得血红蛋白溶液。滤，即得血红蛋白溶液。滤，即得血红蛋白溶液。滤，即得血红蛋白溶液。2 2。1mg/ml1mg/ml溴酚蓝溶液溴酚蓝溶液溴酚蓝溶液溴酚蓝溶液 (待待待待分离样品老师已准备好分离样品老师已准备好分离样品老师已准备好分离样品老师已准备好)葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 Sephadex G-25Sephadex G-25洗脱液：洗脱液：洗脱液：洗脱液：0.2mol/L NaCl0.2mol/L NaCl缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液第8页/共16页【操作方法操作方法】一、凝胶的处理一、凝胶的处理一、凝胶的处理一、凝胶的处理Sephadex G-25干粉干粉置于置于蒸馏水中室温下溶胀蒸馏水中室温下溶胀3h，沸水，沸水浴加热，再用蒸馏水洗涤几次，浴加热，再用蒸馏水洗涤几次，将不易沉降的细小颗粒随水倾将不易沉降的细小颗粒随水倾倒（以免在装柱后产生阻塞现倒（以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速）。洗涤后将凝象，降低流速）。洗涤后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。胶浸泡在洗脱液中待用。（凝胶已处理）第9页/共16页二、装柱二、装柱A,A,将层析柱垂直固定在铁架台上，将层析柱垂直固定在铁架台上，将层析柱垂直固定在铁架台上，将层析柱垂直固定在铁架台上，关闭出口，向关闭出口，向关闭出口，向关闭出口，向柱内加入洗脱液约柱内加入洗脱液约柱内加入洗脱液约柱内加入洗脱液约1cm1cm1cm1cm高，若不漏则证明柱完好。高，若不漏则证明柱完好。高，若不漏则证明柱完好。高，若不漏则证明柱完好。B,B,将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面的水将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面的水将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面的水将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面的水层与凝胶体积相等；用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻层与凝胶体积相等；用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻层与凝胶体积相等；用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻层与凝胶体积相等；用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内，此时柱下口一边排水，上口一边璃棒灌入柱内，此时柱下口一边排水，上口一边璃棒灌入柱内，此时柱下口一边排水，上口一边璃棒灌入柱内，此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱；步形成凝胶柱；步形成凝胶柱；步形成凝胶柱；C,C,当到达所需凝胶高度时，立即关闭下口，使凝当到达所需凝胶高度时，立即关闭下口，使凝当到达所需凝胶高度时，立即关闭下口，使凝当到达所需凝胶高度时，立即关闭下口，使凝胶完全沉降；胶完全沉降；胶完全沉降；胶完全沉降；D,D,凝胶柱上始终覆盖一层溶液，凝胶柱用洗脱液凝胶柱上始终覆盖一层溶液，凝胶柱用洗脱液凝胶柱上始终覆盖一层溶液，凝胶柱用洗脱液凝胶柱上始终覆盖一层溶液，凝胶柱用洗脱液流过。流过。流过。流过。第10页/共16页装柱注意事项：（1）装柱前加入1cm洗脱液，检查柱子（2）凝胶装柱要一次完成。（3）柱中的凝胶一定要浸没在洗脱液中。（4）装凝胶的烧杯不能清洗。（看似脏的 东西都是凝胶）。第11页/共16页三、加样与洗脱三、加样与洗脱 先打开下口开关，放出凝胶柱面上的溶液（或吸取，先打开下口开关，放出凝胶柱面上的溶液（或吸取，先打开下口开关，放出凝胶柱面上的溶液（或吸取，先打开下口开关，放出凝胶柱面上的溶液（或吸取，但溶液面不能低于凝胶表面），然后加样，控制但溶液面不能低于凝胶表面），然后加样，控制但溶液面不能低于凝胶表面），然后加样，控制但溶液面不能低于凝胶表面），然后加样，控制流速，使样品渗入凝胶内。流速，使样品渗入凝胶内。流速，使样品渗入凝胶内。流速，使样品渗入凝胶内。本实验样品为：血红蛋白和溴酚蓝混合样品本实验样品为：血红蛋白和溴酚蓝混合样品本实验样品为：血红蛋白和溴酚蓝混合样品本实验样品为：血红蛋白和溴酚蓝混合样品0.75mL(0.75mL(血红蛋白：溴酚蓝血红蛋白：溴酚蓝血红蛋白：溴酚蓝血红蛋白：溴酚蓝=2:1=2:1），用移液管滴），用移液管滴），用移液管滴），用移液管滴加在液面下（不能冲起凝胶柱，也不能沿管壁流加在液面下（不能冲起凝胶柱，也不能沿管壁流加在液面下（不能冲起凝胶柱，也不能沿管壁流加在液面下（不能冲起凝胶柱，也不能沿管壁流下），样品下渗至凝胶面时，关闭下口，完成上下），样品下渗至凝胶面时，关闭下口，完成上下），样品下渗至凝胶面时，关闭下口，完成上下），样品下渗至凝胶面时，关闭下口，完成上样，再加一层洗脱液（样，再加一层洗脱液（样，再加一层洗脱液（样，再加一层洗脱液（3 35cm5cm）。）。）。）。调整洗脱装置使滴入洗脱液滴速率与流出液滴速率调整洗脱装置使滴入洗脱液滴速率与流出液滴速率调整洗脱装置使滴入洗脱液滴速率与流出液滴速率调整洗脱装置使滴入洗脱液滴速率与流出液滴速率一致。一致。一致。一致。第12页/共16页四、收集四、收集 用试管收集洗脱液。用试管收集洗脱液。用试管收集洗脱液。用试管收集洗脱液。五、凝胶柱的处理五、凝胶柱的处理 凝胶用过后，用洗脱液通过柱凝胶用过后，用洗脱液通过柱凝胶用过后，用洗脱液通过柱凝胶用过后，用洗脱液通过柱（2323倍床体积）倍床体积）倍床体积）倍床体积）即可。即可。即可。即可。注意：需回收！注意：需回收！注意：需回收！注意：需回收！第13页/共16页注意事项 始终保持柱内液面高于凝胶始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。重新装柱。第14页/共16页思考题一、为什么溴酚蓝能与血红蛋白在层析柱中能够很好的分开？二、生化实验中常用的凝胶有哪些？各有何特征？第15页/共16页