色谱分析法概论.pptx

11.11.色谱分析法概论1.概述概述2.色谱过程和术语色谱过程和术语 3.色谱分离的基本理论色谱分离的基本理论4.色谱法的发展趋势色谱法的发展趋势 5.小小 结结第1页/共78页M.Tsweet固定相：碳酸钙固定相：碳酸钙 ；流动相：石油醚；流动相：石油醚色谱法起源1.1 概述概述第2页/共78页 利用各组分物理化学性质的不同，在流动相流经固定相时，由于各组分在两相间的吸附、分配或其它亲和力的差异而产生不同速度的移动，最终达到分离的目的。chroma（色（色）graphy（图）（图）chromatographychromatography（色谱法色谱法）色谱法定义色谱法定义第3页/共78页分离基础差 速 迁 移第4页/共78页色谱法发展色谱法发展2020世纪初世纪初30-4030-40年代年代5050年代年代6060年代年代柱色谱柱色谱薄层色谱法（薄层色谱法（TLC），纸色谱法（），纸色谱法（PC）气相色谱法（气相色谱法（GC）气质联用技术（气质联用技术（GC-MS）7070年代年代8080年代年代高效液相色谱（高效液相色谱（HPLC）超临界流体色谱超临界流体色谱(SFC)毛细管电泳（毛细管电泳（CE）两次 诺贝尔奖第5页/共78页色谱法特点 分离功能为主；定性鉴别专属性好，定量分析准确灵敏快速。可分离组分性质相似混合物可分离分析存在干扰组分的复杂体系第6页/共78页2.1色谱过程色谱过程u 物质分子在相对运动的两相间，u分配“平衡”的过程。u 分离机制是差速迁移。例：顺反偶氮苯在柱中吸附解吸附，再吸附2.2.色谱法的基础知识图11-1第7页/共78页2.2基本术语2.2.1色谱流出曲线第8页/共78页(3)标准差（）：两拐点间距离之半。(4)峰宽（peak width，W 或Y）：通过色谱峰两侧的拐点作切线，在基线上的截距。如图 IJ 间的距离。峰宽第9页/共78页W=4，W1/2=2.355W=1.699 W1/2(5)半峰宽（peak width at half height，W1/2 或Y1/2）：峰高一半处的峰宽，如图GH间的距离。第10页/共78页 tR 是色谱的定性参数，同组分相同色谱条件下，tR 应相同。(1)保留时间（retention time，tR)：从进样开始到某个组分的色谱峰顶点的时间间隔。2.2.2保留值第11页/共78页(1)死时间（dead time,t0)：不被固定相滞留的组分(流动相)从进样开始、通过色谱柱，到出现最大值所需要的时间。第12页/共78页(3)调整保留时间（adjusted retention time，tR)组分由于和固定相作用，比不作用的组分在柱中多停留 的时间。第13页/共78页(4)保留体积（retention volume，VR)：组分从进样到出现峰最大值所需要的流动相体积。载气流速 恒定值 与载气流速无关 第14页/共78页(5)死体积（dead volume，V0)由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间体积。注意：死体积大，色谱峰扩张，柱效降低。第15页/共78页 VR与流动相流速无关 VR和 tR同属于色谱定性参数即：VR是定值，tR与Fc成反比注：VR与Fc无关(6)调整保留体积（adjusted retention volume，VR)其本质为组分停留在固定相时所消耗流动相的体积。第16页/共78页V0 和和 Vm、t0 和和 tm 的区别：的区别：由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间体积称为V0 ，固定相充满死体积所需的时间为t0。平衡时流动相在色谱柱中占有的体积用Vm表示，经过色谱柱所需时间用tm 表示。物理意义有区别：Vm V0，tm t0 。在多数情况下，可忽略导管和检测器内腔容积，视为近似相等。第17页/共78页(1)分配系数(partition coefficient，K)u 平衡时，组分在固定相与流动相中的浓度比u 与温度有关2.2.3 分配系数和保留因子2.2.4 相平衡常数第18页/共78页吸附系数adsorption coefficientKaKKs KpK分配系数partition coefficient渗透系数permeation coefficient选择系数selectivity coefficient第19页/共78页(2)保留因子（retention factor，k)u平衡状态下，组分在固定相与流动相中的质量之比u k 与组分、固定相和流动相的性质及温度、压力等有关第20页/共78页 k不同 tR不同 分离 u k 与 tR 关系第21页/共78页2.2.5 分离参数(1)分离因子（分配系数比、选择性系数）(2)分离度（resolution，Rs)第22页/共78页分离度（resolution，Rs)R=1.0 基本分离R=1.5 完全分离第23页/共78页例：某色谱柱的Vs=1.3 mL、V0=2.1 mL，分离A、B 两物质 KA=10.0、KB=40.0。试计算A、B的保留体积。解：设V0=Vm，则VR=V0(1+KVs/Vm)可得：VR(A)=15.1 mL VR(B)=54.1 mL 第24页/共78页例：一个气相色谱柱，由固定液的涂量及固定液在柱温下的密度计算得Vs=14.1mL，载气流速为43.75mL/min。分离一个含A、B、C三组分的样品，测得组分保留时间组分A为1.41min、组分B为2.67min、组分C为4.18min、空气为 0.24min。试计算：(1)死体积（假定检测器及柱接头等体积可忽略）(2)各组分的调整保留时间和分配系数 (3)相邻组分的分配系数比第25页/共78页解：所以：第26页/共78页相邻峰分配系数比为：第27页/共78页2.3 色谱法分类 a a 两相所处的状态b bc c分 离 机 理操 作 类 型第28页/共78页两相所处的状态流动相固定相类型液相色谱液固L-S 色谱液液L-L 色谱气相色谱气固G-S 色谱气液G-L 色谱第29页/共78页操作类型柱色谱(column chromatography):HPLC，GC etc.平板色谱(planar chromatography):TLC，PC第30页/共78页分离机理色谱法色谱法 分离机理 不同 吸附色谱吸附色谱 分子排阻分子排阻 色谱色谱 分配色谱分配色谱 离子交换离子交换色谱色谱 第31页/共78页 吸附色谱法 （adsorption chromatography）分配色谱法 （partition chromatography）离子交换色谱法（ion exchange chromatography）空间排阻色谱法（又称分子排阻色谱法）（size exclusion chromatography）第32页/共78页2.4 色谱基本类型的分离原理1.吸附色谱法吸附色谱法X:溶质分子Y:流动相分子a:吸附剂 m:流动相XaYmYa第33页/共78页 吸附色谱法（adsorption chromatography)吸附能力：用吸附平衡常数（吸附系数）K衡量。极性强，K值大，易吸附，有较大保留值。第34页/共78页主要包括柱色谱和平面色谱吸附剂：硅胶、氧化铝；流动相：不同的有机溶剂（或气体）溶质的保留和分离：溶质和流动相对吸附剂表面活性中心的竞争第35页/共78页2.分配色谱利用被分离组份在固定相或流动相的溶解度差别而实现分离固定相：固定液；流动相：气体或液体早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相，现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。第36页/共78页 分配色谱示意图 流动相(m)中的溶质分子 溶解在固定液(s)中的分子第37页/共78页正相色谱与反相色谱:正相 反相固定相极性 大 小流动相极性 小 大流出顺序 极性小的组分先 极性大的组分先第38页/共78页 3 离子交换色谱 固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。第39页/共78页固定相：离子交换树脂流动相：水溶液 分离机制：不同亲和力，差速迁移分离对象：离子型化合物离子交换树脂 具有网状结构的高分子聚合物联上酸性基团：阳离子交换树脂（联上酸性基团：阳离子交换树脂（-SO3H,-COOH等等）联上碱性基团：阴离子交换树脂（联上碱性基团：阴离子交换树脂（-NH2,-NHR等）等）第40页/共78页阳离子阳离子交换反应：交换反应：（树脂可反复使用，用（树脂可反复使用，用HClHCl浸泡，冲洗浸泡，冲洗)阴离子阴离子交换反应：交换反应：(阴离子树脂的再生阴离子树脂的再生,用适当的碱液浸泡用适当的碱液浸泡)应用应用：1 1 除去干扰离子，如制备除去干扰离子，如制备去离子水去离子水；2 2 盐类的测定盐类的测定 如乳酸钠的测定。如乳酸钠的测定。第41页/共78页4 空间排阻色谱（凝胶色谱）以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的统称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。凝胶色谱示意图Ge-凝胶 m-流动相第42页/共78页 固定相：凝胶 流动相：水 分离对象：较大分子尺寸的高聚物、蛋白质、多糖等 分离机制：按分子大小分离 大分子先流出第43页/共78页 结论：在色谱柱(或板)一定时，Vs与Vm一定；若流速、温度也一定，t0一定，tR仅取决于分配系数K，K大的组分tR长。在实验条件一定时，tR取决于组分性质定性指标。色谱过程方程：3.1 分配系数与保留行为的关系3.色谱分离的基本理论第44页/共78页3.2 等温线等温线 在一定条件下，组分在固定相和流动相间分配达到平衡时，在两相中的浓度cs和cm的比值K为常数，由此绘制出的cs和cm的关系曲线显然应为一条直线，被称为等温线。第45页/共78页 等温线对各种类型的色谱有指导意义等温线对各种类型的色谱有指导意义 线性等温线 a（理想）对称峰 非线性等温线 凸形 b 拖尾峰 凹形 c 前沿峰第46页/共78页色谱峰的对称性：色谱峰的对称性：一般使用对称性因子一般使用对称性因子(symmetry factor)，计算式为：，计算式为：完全对称(B=A)峰的对称因子为1.00。对称因子为0.951.05之间的峰看成为正常峰(对称);BA:T大于1.05的为拖尾峰。第47页/共78页中国药典中国药典20052005年版年版:拖尾因子拖尾因子第48页/共78页 3.3 塔板理论 最早由Martin等人提出，把色谱柱比作一个精馏塔 沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为 引入理论塔板数(n)作为衡量柱效率的指标第49页/共78页(1)色谱柱由若干连续、等距的水平塔板组成，每层塔板的高度用H表示，样品和流动相同时加在第 1个塔板上(2)分配瞬间达平衡,分配系数在各塔板上是常数，忽略样品沿柱方向的纵向扩散(3)载气非连续而是间歇式进入色谱柱，每次进气一个塔板体积；3.3.1 塔板理论的几个基本假设(把色谱柱看作一个分馏塔)第50页/共78页3.3.2 理论塔板高度和塔板理论数 (1)理论塔板数 n 组分流过色谱柱时，在两相间进行平衡分配的总次数 (2)理论塔板高度 H 为使组分在柱内两相间达到一次分配平衡所需要的柱长结论结论：色谱峰 W 越小，n 就越大，而 H 就越小，柱效越高 n 和 H 是描述柱效的指标第51页/共78页 n 的影响因素：的影响因素：u柱本身的性质；u 溶剂系统；u 测定组分 讨论：nL，n1/H (1)L 一定，n，柱效，分离能力 (2)一定，n，但柱压和分析时间第52页/共78页(3)有效理论塔板数、有效理论塔板高度 由于死时间 t0 包括在 tR 中，而实际的 t0 不参与柱内分配，所计算的 n 值大，H小，但与实际柱效能不同；因此常把 t0 扣除，采用有效理论塔板数 n有效 和有效塔板高 H有效评价柱效。第53页/共78页例11-2：已知气相色谱柱长2.0m，固定相为80100目白色硅藻土 上涂渍的5%OV-17，柱温125，载气(N2)流速30mL/min，记录纸速为2.0cm/min。测得萘的保留时间为2.35min，半峰宽为0.20cm。求理论塔板数和板高。若用甲烷测得死时间为0.20min，求有效理论塔板数和板高。解：扣除死时间的影响，用tR代替tR计算n有效和 H有效，tR=2.35-0.20=2.15(min)第54页/共78页3.3.3 塔板理论的特点塔板理论的特点 当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大(塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。第55页/共78页3.3.4 塔板理论的局限性塔板理论的局限性 柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。柱的塔板数多大，都无法分离。塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。出影响柱效的因素及提高柱效的途径。第56页/共78页van Deemter 方程式塔板理论优缺点1.4.3 速率理论速率理论第57页/共78页3.4 速率理论速率理论 1956 年荷兰学者 van Deemter 等在研究气液色谱时提出 色谱过程动力学理论 应用了塔板理论板高 H 的概念 充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程 从动力学角度较好地解释了影响柱效的因素van Deemter 方程的数学简化式为：第58页/共78页B/u纵向扩散项纵向扩散项A涡流扩散项涡流扩散项H式中u为流动相的线速度：A，B，C为常数A涡流扩散系数；B纵向扩散系数；C传质阻抗系数Cu传质阻抗项第59页/共78页3.4.1 涡流扩散项（多径扩散项）：涡流扩散项（多径扩散项）：A (2)涡流扩散系数 填料粒径填料粒径 填充不规则因子填充不规则因子涡流扩散动画 载气携样品进柱，遇到来自固定相颗粒的阻力 路径不同涡流扩散(1)产生原因第60页/共78页(3)影响因素：固定相颗粒越小，填充越均匀，A 项越小 填充柱（25mm）空心毛细管柱（0.1 0.5 mm），A=0，较高 n 讨论：第61页/共78页3.3.2 纵向扩散项（分子扩散项）：纵向扩散项（分子扩散项）：B/u 产生原因：组分在固定相中被流动相推动向前、展开 浓度梯度 谱带展宽分子扩散动画第62页/共78页B/u 纵向扩散项：纵向扩散项：由于流动相的扩散，溶质沿着柱长方向，存在着浓度差，产生纵向扩散，又称分子扩散相，导致色谱峰变宽，H (n)，分离变差。B=2Dg ：弯曲因子，填充柱色谱，1 Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2s-1）第63页/共78页 讨论：与填充物有关的因子（扩散阻碍因子）空心柱 =1;填充柱 1 纵向扩散与 u 成反比 u 大，B/u 可忽略;u 小，不可忽略 Dg 组分在气相中的扩散系数 M载气 大，Dg 小，如：N2 M载气 小，Dg 大，如：H2，HeB=2 Dg第64页/共78页影响因素：分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，扩散 扩散系数：Dg 和（M载气）1/2 成反比讨论：高流速/低柱温/大 M载气第65页/共78页3.4.3 传质阻抗项(Cu)(2)传质阻抗系数：Dl 组分在固定液中扩散系数传质阻抗动画(1)产生原因：样品在气液两相间分配，样品未及溶解就被带走;或未能及时解析，从而造成峰扩张第66页/共78页 注意：固定液应完全覆盖载体表面，不可以太薄，否则k太小，柱子寿命也短。(3)影响因素：第67页/共78页H u 曲线与最佳流速：曲线与最佳流速：流速对 B、C 两项相反的作用，对柱效的总影响使得存在着最佳流速值。以塔板高度 H 对应载气流速 u 作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。柱效与流速（1）柱效与流速）柱效与流速u u最佳，C项可忽略，H=A+B/u;u u最佳，B项可忽略，H=A+Cu柱效与色谱条件的关系第68页/共78页最佳流速综合优化u最佳；足够大Rs;较短 tRu一定，三个常数，H，n，峰形越窄第69页/共78页（2）填料粒径 细粒径，高柱效；高柱压（3）柱温 升高柱温，扩散系数升高；柱效降低；改善传质，柱效升高第70页/共78页u 被分离组分分子在色谱柱内运行的多路径、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。u 通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。速率理论 小 结(1)第71页/共78页u 速率理论为色谱分离和操作条件的选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。u 各因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散；综合选择最佳条件，才能提高柱效。速率理论 小 结(2)第72页/共78页3.5 影响分离度的因素？思考题：（试推导证明过程）第73页/共78页k 影响峰位n 影响峰宽窄 影响两峰间距容量因子(k)、柱效(n)及分配系数()对分离度的影响第74页/共78页提高分离度的因素提高分离度的因素（提高提高n,n,，k k）柱选择项柱容量项柱效项兼顾时间1-51-5（1-1-1010）调整流动相的组成和酸度，改变柱温和固定相第75页/共78页掌握色谱法的分类方法和基本术语；掌握色谱分离的基本理论；掌握塔板理论和速率理论的基本原理和应用方法；掌握分配系数与保留行为的关系。熟悉应用塔扳理论计算柱效、理论塔扳数、分离度、对称因子等色谱参数的方法；熟悉应用van Deemter 方程式解释塔扳高度-流速曲线。了解色谱分析法的起源和发展概况，了解影响色谱基本参数和理论塔板高度的主要因素，了解各种基本类型色谱法的分离机制。5.小 结第76页/共78页习题P2241，2，3，5，6第77页/共78页感谢您的观看！第78页/共78页