蛋白质双向电泳及质谱技术.pptx

蛋白质双向电泳技术蛋白质双向电泳技术第1页/共64页双向电泳简介双向电泳简介l2-DE是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千种蛋白质的技术种蛋白质的技术。l第一向第一向等点聚焦等点聚焦(IEF)pH梯度载体梯度载体pIl第二向第二向十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠-PAGE(SDS-PAGE)SDS作为变性剂和助溶剂作为变性剂和助溶剂分子量分子量第2页/共64页样品样品等点聚焦等点聚焦(第一向第一向)双向电泳的基本原理与流程示意双向电泳的基本原理与流程示意分子量分子量pH 梯度梯度(pI)SDS-PAGE两性电解质两性电解质pH 9 -pH 3 +聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺第二向第二向第3页/共64页双向电泳具体步骤双向电泳具体步骤样品制备样品制备缓冲液的配制缓冲液的配制IPG条重泡涨及上样条重泡涨及上样第一向：第一向：IEFIPG条平衡条平衡平衡缓冲液平衡缓冲液(还原还原)平衡缓冲液平衡缓冲液(巯烷基化巯烷基化)第二向：第二向：SDS-PAGE胶条染色胶条染色成像及图像分析成像及图像分析第4页/共64页为什么要进行样品制备为什么要进行样品制备l目前双向电泳一般只能分辨到目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白个蛋白质点质点(spot)，而样品中的蛋白种类可达到，而样品中的蛋白种类可达到10万种万种以上。以上。l待研究样本待研究样本(如临床样本如临床样本)常是各种细胞和组织混常是各种细胞和组织混杂，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型。杂，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型。？第5页/共64页1 保证样品蛋白质完全溶解，分级效果好，干扰因素少保证样品蛋白质完全溶解，分级效果好，干扰因素少尽量使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水尽量使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白）。性蛋白）。避免样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学避免样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。性降解等）。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。的可检测性。通过超离心去除所有颗粒状物质，防止其堵塞凝胶孔路。通过超离心去除所有颗粒状物质，防止其堵塞凝胶孔路。2 最大限度减少样品的损失最大限度减少样品的损失低温保存样品低温保存样品(一般需低于一般需低于-86)尽量缩短处理时间尽量缩短处理时间除盐，省略不必要的过程除盐，省略不必要的过程保证样品在聚焦时不发生蛋白的聚集和沉淀。保证样品在聚焦时不发生蛋白的聚集和沉淀。样品制备原则样品制备原则第6页/共64页样品制备流程及注意事项样品制备流程及注意事项溶解预处理(清洗等)破碎沉淀按溶解度分级按溶解度分级富集富集除杂除杂第7页/共64页样品的破碎样品的破碎l原则最小限度的减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解原则最小限度的减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解l样品的来源样品的来源l易碎的细胞易碎的细胞l坚硬的组织坚硬的组织l植物细胞植物细胞l真菌真菌方法方法温和温和剧烈剧烈第8页/共64页温和破碎法温和破碎法渗透压冲击渗透压冲击(培养的细胞培养的细胞)低渗液中的悬浮细胞低渗液中的悬浮细胞反复冻融法反复冻融法(细菌细菌)液氮冷冻液氮冷冻去污剂降解去污剂降解(酵母、霉菌酵母、霉菌)降解缓冲液降解缓冲液(含尿素和去污剂含尿素和去污剂)SDS(应在应在IEF前去除前去除)酶降解酶降解(植物、细菌、真菌植物、细菌、真菌)溶菌酶溶菌酶(细菌细菌)纤维素酶，果胶酶纤维素酶，果胶酶(植物植物)溶壁酶溶壁酶(酵母酵母)第9页/共64页剧烈破碎法剧烈破碎法超声破碎超声破碎(细胞悬浮液细胞悬浮液)需以冰冷却避免过热需以冰冷却避免过热弗式细胞压碎器弗式细胞压碎器(French pressure cell，带壁微生物，带壁微生物细胞在剪切力作用下破碎细胞在剪切力作用下破碎研磨研磨(固体组织，微生物固体组织，微生物)液氮中将固体组织磨成细粉末液氮中将固体组织磨成细粉末样品研磨器样品研磨器(用于少量样品的处理用于少量样品的处理)用于精确样品用于精确样品珠磨法珠磨法(胞悬液，微生物胞悬液，微生物)通过磨珠研磨破坏细胞壁通过磨珠研磨破坏细胞壁第10页/共64页作用作用去除杂质去除杂质浓缩样品浓缩样品抑制蛋白酶活性抑制蛋白酶活性关键关键-可溶性可溶性获得可以重新溶解的蛋白获得可以重新溶解的蛋白常用方法常用方法硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀TCA沉淀沉淀丙酮沉淀丙酮沉淀TCA/丙酮沉淀丙酮沉淀醋酸铵醋酸铵/甲醇甲醇/苯酚抽提苯酚抽提样品的沉淀样品的沉淀 对于疏水性特别强的蛋对于疏水性特别强的蛋白如膜蛋白白如膜蛋白硫脲硫脲SDS新型两性表面活性剂新型两性表面活性剂(如磺如磺基甜菜碱基甜菜碱)第11页/共64页样品中杂质的去除样品中杂质的去除去除原则去除原则尽量不丢失蛋白尽量不丢失蛋白减少蛋白的修饰减少蛋白的修饰杂质的主要种类杂质的主要种类DNA/RNA脂质脂质多糖盐多糖盐离子去污剂离子去污剂其他固体杂质其他固体杂质 第12页/共64页DNA/RNA的去除的去除样品中含核酸的不利影响样品中含核酸的不利影响能被银染色法染色能被银染色法染色在凝胶酸性部分产生水平条纹在凝胶酸性部分产生水平条纹当样品到达当样品到达IEF凝胶酸性端时，与蛋白质一同沉淀凝胶酸性端时，与蛋白质一同沉淀去除方法去除方法蛋白沉淀法蛋白沉淀法DNase/RNase处理处理超声超声(机械破坏机械破坏)、超高速离心、超高速离心DNA/RNA抽提抽提(苯酚苯酚/氯仿氯仿)第13页/共64页其他杂质的去除其他杂质的去除脂质脂质使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及pI丙酮沉淀丙酮沉淀多糖多糖阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦TCA、硫酸铵或醋酸铵、硫酸铵或醋酸铵/甲苯甲苯/苯酚沉淀；超速离心和高苯酚沉淀；超速离心和高pH盐盐使胶条导电能力增强，共聚焦不易发生使胶条导电能力增强，共聚焦不易发生透析；胶体过滤；沉淀或重新悬浮透析；胶体过滤；沉淀或重新悬浮离子去污剂离子去污剂如如SDS，使蛋白质带负电不能聚焦，使蛋白质带负电不能聚焦丙酮沉淀；将含丙酮沉淀；将含SDS的蛋白溶于含两性或非离子去污剂如的蛋白溶于含两性或非离子去污剂如CHAPS，Triton X-100，NP-40等的缓冲液中并使等的缓冲液中并使SDS终浓度终浓度0.25%固体杂质固体杂质阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦过滤过滤第14页/共64页样品的溶解样品的溶解2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一成功分离蛋白质的最关键因素之一溶解的目标溶解的目标样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）强度会下降）溶解方法必须允许可能干扰溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除酸等物质的去除溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态第15页/共64页增加样品溶解性的手段增加样品溶解性的手段变性剂变性剂改变氢键结构，使蛋白疏水中心暴露伸展改变氢键结构，使蛋白疏水中心暴露伸展尿素、硫尿尿素、硫尿表面活性剂表面活性剂溶解疏水基团溶解疏水基团离子去污剂离子去污剂SDS、非离子去污剂、非离子去污剂Triton X-100和和NP-40、两性离、两性离子去污剂子去污剂CHAPS等等还原剂还原剂使变性蛋白进一步伸展溶解使变性蛋白进一步伸展溶解含自由巯基的含自由巯基的DTT或或-巯基乙醇，不带电荷的磷酸三丁酯巯基乙醇，不带电荷的磷酸三丁酯(TPB)起载体作用的两性电解质起载体作用的两性电解质到达平衡位置形成到达平衡位置形成pH梯度，梯度，“运载运载”电流、电流、pH捕获样品中少量盐分捕获样品中少量盐分浓度应小于浓度应小于0.2（w/v，浓度过高会使，浓度过高会使IEF的速度降低的速度降低)第16页/共64页样品液的准备样品液的准备标准液标准液：2g4%CHAPS定容至50mLddH2O100uL 0.1%原液0.0002%溴酚蓝见下表0.2%两性电解质载体385mg DTT或 500uL 200mM TBP原液50mM DTT 或2mM TBP24g 尿素加入 25mL H2O8M 尿素用量试剂第17页/共64页IPG 用两亲性电解液的组成用两亲性电解液的组成250 l 25 l20%8-10125 l12.5 l40%7-97-10250 l25 l40%5-85-8125 l12.5 l40%4-6250 l25 l40%3-53-6125 l12.5 l40%5-7125 l12.5 l40%4-64-7250 l25l40%3-103-10样品溶液体积(/5ml)样品溶液体积(/5ml)两亲性电解液浓度(w/v)两亲性电解液范围IPG 胶pH 范围第18页/共64页样品制备注意事项样品制备注意事项蛋白质水解蛋白质水解低温低温Tris碱，碳酸钠或碱性载体两性电解质碱，碳酸钠或碱性载体两性电解质蛋白抑制剂蛋白抑制剂特殊样品的制备特殊样品的制备低丰度蛋白的分离低丰度蛋白的分离预分级预分级窄窄pH胶胶(2个个pH单位单位)强碱性蛋白强碱性蛋白(如核糖体如核糖体)的处理的处理预处理富集预处理富集特殊特殊pH梯度的梯度的IPG胶条（如胶条（如pH312、4-12或或10-12）进行等电）进行等电聚焦聚焦极端分子量蛋白的处理极端分子量蛋白的处理小于小于8kD 对流混合，产生绒毛状或模糊的带对流混合，产生绒毛状或模糊的带大于大于200kD的蛋白，变性为多肽的蛋白，变性为多肽第19页/共64页梯度器梯度器塑料支持膜塑料支持膜固定固定pH梯度梯度(Immobilized pH Gradient,IPG)胶条的制备胶条的制备ACBFED酸 碱 pH 3pH 10第20页/共64页固定固定pH 梯度梯度(IPG)示意图示意图聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶CH2=CH-C-NH-ROCOO-丙烯酰胺单体丙烯酰胺单体酸缓冲基团：酸缓冲基团：碱缓冲基团：碱缓冲基团：NH3+R 第21页/共64页宽宽pH梯度及窄梯度及窄pH梯度梯度宽宽pH梯度用于：梯度用于：全部蛋白全部蛋白(确定感兴趣蛋确定感兴趣蛋白的大致位置白的大致位置)窄窄pH梯度用于：梯度用于：提高分辨率提高分辨率 增加载样能力以检测、增加载样能力以检测、分析更多蛋白分析更多蛋白 第22页/共64页IPG 胶的重泡涨及上样胶的重泡涨及上样2-DE 样品样品重泡涨溶液重泡涨溶液：重泡涨溶液：8M 尿素尿素2%NP-40 或或 CHAPS2%IPG缓冲液缓冲液(两亲性电解液两亲性电解液)0.28%DTT微量微量 溴酚蓝溴酚蓝IPG 胶条支架胶条支架IPG 胶条胶条 定位定位泡涨目的：使样品能完全以可溶形式进入泡涨目的：使样品能完全以可溶形式进入IPG胶条内胶条内第23页/共64页蛋白载样量蛋白载样量IPG胶条对蛋白载样量的影响因素：胶条对蛋白载样量的影响因素：待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度样品的复杂度样品的复杂度复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。IPG胶条的胶条的pH范围范围预试验确定预试验确定先宽后窄先宽后窄先线性后非线性先线性后非线性先短后长先短后长第24页/共64页第一向：等点聚焦第一向：等点聚焦1.放置电极垫放置电极垫(?)2.200 V 维持维持 1.5h3.500 V 维持维持 1.5h 4.1000 V 梯度上升梯度上升 1500vh 5.8000 V 梯度上升梯度上升(?)36000vh时间时间电压电压支架盖支架盖IPG 胶条胶条电极电极电极垫电极垫第25页/共64页IPG 胶条的平衡胶条的平衡 平衡液平衡液6 M 尿素和尿素和30%甘油甘油减少电内渗减少电内渗第一步平衡第一步平衡加加DTT使变性的非烷基化蛋白处于还原状态使变性的非烷基化蛋白处于还原状态第二步平衡第二步平衡加碘乙酰胺加碘乙酰胺使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化第26页/共64页 使被分离的蛋白质与SDS完整结合第二向第二向:SDS-PAGE SDS 平衡平衡 SDS-PAGESDS 平衡液平衡液50 mM Tris-HCl6 M 尿素尿素30%丙三醇丙三醇2%SDS微量微量 溴酚蓝溴酚蓝SDSSDS-PAGESDS-PAGE向电泳缓冲液中加向电泳缓冲液中加 0.5%的琼脂糖的琼脂糖SDS-PAGE标记纸片标记纸片IPG 胶条胶条第27页/共64页胶体考马斯亮蓝染色胶体考马斯亮蓝染色灵敏度为灵敏度为30100ng，线性范围是，线性范围是20倍倍可实现可实现PAGE的无背景染色的无背景染色会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果胺基黑染色胺基黑染色转印至聚偏二氟乙烯（转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上的蛋白质的染色）上的蛋白质的染色转印至硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色转印至硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色银染银染可减少胶内蛋白质产量可减少胶内蛋白质产量对某些种类的蛋白质染色效果差对某些种类的蛋白质染色效果差对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响染色方法染色方法第28页/共64页银染色银染色50%甲醇甲醇25%乙酸乙酸4hddH2O 洗洗3次次30min/次次0.004%DTT 溶液溶液30min0.1%AgNO330minddH2O30 sec3%Na2CO30.0185%甲醛甲醛2.3M 柠檬酸柠檬酸5%乙酸乙酸25%甲醇甲醇第29页/共64页负染负染主要包括金属盐染料、锌咪唑染料等的使用主要包括金属盐染料、锌咪唑染料等的使用能专门提高能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率胶上蛋白质的回收率速度快（速度快（515min）且能保持蛋白质的生物活性）且能保持蛋白质的生物活性不能用于膜上染色不能用于膜上染色适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析胶体扩散染料胶体扩散染料主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质膜上的蛋白质灵敏度与灵敏度与PAGE胶内的银染类似胶内的银染类似不用于胶内染色不用于胶内染色染色方法染色方法第30页/共64页有机荧光团染料有机荧光团染料包包括括共共价价结结合合和和非非共共价价结结合合的的荧荧光光团团染染料料两两类类，后后者者最最为为常常用用，其其典典型型代代表表是是已已经经商商品品化化的的SYPRO Red、Orange、Ruby等荧光染料等荧光染料可可对对SDS-PAGE胶胶内内蛋蛋白白质质进进行行一一步步染染色色，约约3060min完完成成灵敏度为灵敏度为210ng其线性范围为其线性范围为3个数量级个数量级在在Tris/甘甘氨氨酸酸转转印印缓缓冲冲液液中中染染色色后后，蛋蛋白白质质可可被被转转印印至至膜膜上上并进行免疫染色或并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质测序来鉴定蛋白质金属螯合染料金属螯合染料与现代蛋白质组学研究相兼容的与现代蛋白质组学研究相兼容的专门与常用微量化学表征过程兼容专门与常用微量化学表征过程兼容不不包包含含戊戊二二醛醛、甲甲醛醛或或Tween-20等等，很很容容易易和和集集成成化化蛋蛋白白质质组组学学平平台台（包包括括自自动动化化凝凝胶胶染染色色仪仪、图图像像分分析析工工作作站站、机机器器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合染色方法染色方法第31页/共64页凝胶的图像处理分析凝胶的图像处理分析典型流程典型流程凝胶图像的扫描凝胶图像的扫描图像加工图像加工斑点检测和定量斑点检测和定量凝胶配比凝胶配比数据分析数据分析数据呈递和解释数据呈递和解释2-DE数据库的建立数据库的建立2-DE 分离的可溶性 E.coli 蛋白第32页/共64页目前双向电泳需解决的问题目前双向电泳需解决的问题样品的制备及溶解样品的制备及溶解不溶性蛋白不溶性蛋白(膜蛋白及核内蛋白膜蛋白及核内蛋白)难分离蛋白难分离蛋白(如毛发及皮肤中的蛋白如毛发及皮肤中的蛋白)载样量的提高载样量的提高初步分离初步分离低丰度蛋白、碱性蛋白及大分子量蛋白低丰度蛋白、碱性蛋白及大分子量蛋白定量分析定量分析灵敏度及可重复性灵敏度及可重复性第33页/共64页对于双向电泳的建议对于双向电泳的建议首先采用宽首先采用宽pH范围的胶条，确定蛋白的分布范围，通常范围的胶条，确定蛋白的分布范围，通常采用采用pH3-10的胶条的胶条如果如果pH线性分布的胶条分离效果不好，可采用非线性胶线性分布的胶条分离效果不好，可采用非线性胶条条加大蛋白上样量，提高局部蛋白的分辨率加大蛋白上样量，提高局部蛋白的分辨率采用窄采用窄pH范围的胶条，提高某范围的胶条，提高某pH范围蛋白的分辨率范围蛋白的分辨率第二向采用梯度胶进行分离第二向采用梯度胶进行分离去除高丰度蛋白，进行蛋白的分级处理，富集低丰度蛋去除高丰度蛋白，进行蛋白的分级处理，富集低丰度蛋白白第34页/共64页蛋白质质谱技术蛋白质质谱技术第35页/共64页质谱基础质谱基础样品离子源质量分析器离子检测器固体固体液体液体蒸汽蒸汽形成离子形成离子(带电分子带电分子)电离电离质量分选质量分选(过滤过滤)检测检测根据根据m/z分选离子分选离子数据处理数据处理质谱质谱检测离子检测离子基本步骤基本步骤:1.样品离子化样品离子化 2.根据质量根据质量(m/z)不同分离离子不同分离离子3.检测每种质量离子的数目检测每种质量离子的数目 4.收集、处理数据得到质谱图收集、处理数据得到质谱图 第36页/共64页质谱的评价指标质谱的评价指标质量范围质量范围速度速度灵敏度灵敏度分辨率分辨率精确度精确度第37页/共64页+自由漂移区检测器基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)样品探针激光335 nmm/z相对强度MH+MH+MH+特点：特点：灵敏度高灵敏度高准确度高准确度高分辨率高分辨率高质量范围广质量范围广图谱简明图谱简明速度快速度快第38页/共64页ESI四级杆质量分析器碰撞室反射器MCP检测器碰撞气体串联质谱法(MS/MS)ESI-Q-TOF 质谱仪步骤：步骤：1 1质量分析质量分析 2 2碰撞碰撞(离子裂解离子裂解)3 3质量分析质量分析TOF质量分析器质量分析器第39页/共64页强的抗背景干扰能力强的抗背景干扰能力极高的检测灵敏度和准确极高的检测灵敏度和准确度度可用来分析复杂混合物中的蛋白质可用来分析复杂混合物中的蛋白质丰富的检测信息丰富的检测信息，高通量鉴别蛋白质高通量鉴别蛋白质串联质谱的优点串联质谱的优点第40页/共64页1、鉴定和注释蛋白质的路线鉴定和注释蛋白质的路线 通过肽质谱指纹图（peptide mass fingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配 通过串联质谱进行单个或多个蛋白质的鉴定鸟枪法蛋白质组学第41页/共64页 1234.5396 783.9147 375.2561多肽 已测得质 谱数据或理论 质谱 数据MALDI-TOF检测的多肽指纹检测的多肽指纹 胰酶消化凝胶蛋白质数据库?123比较:?是否相同?质谱3235.2256第42页/共64页 肽质谱指纹图在数据库中匹配肽质谱指纹图在数据库中匹配不成功的可能原因不成功的可能原因样样品品量量太太少少，PMF图图信信噪噪比比太太低低，输输入入库库中搜寻的数据质量不好。中搜寻的数据质量不好。2-DE胶胶上上所所取取的的一一个个蛋蛋白白质质点点并并非非单单一一蛋蛋白白质质，所所获获PMF图图实实际际上上是是两两个个以以上上蛋蛋白白质的混合图。质的混合图。第43页/共64页 操作中角蛋白或其他蛋白质的污染操作中角蛋白或其他蛋白质的污染蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库中未有记载中未有记载所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多片段多 未知的新蛋白质未知的新蛋白质 数据库规模太小数据库规模太小 续：续：第44页/共64页氨基酸序列氨基酸序列VLDPNTVFAL蛋白质数据库蛋白质数据库？查询？查询串联质谱图串联质谱图从头测序从头测序输入输入输出输出序列片段序列片段PNT串联质谱鉴定多肽的计量方法串联质谱鉴定多肽的计量方法第45页/共64页组织切片或印片原位质谱分析技术 两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF）傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS）表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）联合技术精确鉴定蛋白质联合技术精确鉴定蛋白质 第46页/共64页2、基于生物质谱的定量蛋白质组研究策、基于生物质谱的定量蛋白质组研究策略略 原原理理：对对于于具具有有相相同同离离子子化化能能力力的的蛋蛋白白质质或或多多肽肽，可可以以通通过过比比较较质质谱谱峰的强度（或峰面积）得到待比较蛋白质的相对量。峰的强度（或峰面积）得到待比较蛋白质的相对量。第47页/共64页 3、基于质谱的蛋白质相互作用研究方、基于质谱的蛋白质相互作用研究方法法靶蛋白制备靶蛋白制备 蛋白质复合体的纯化蛋白质复合体的纯化 蛋白质蛋白质复合体复合体的质谱鉴定的质谱鉴定 基本步骤：基本步骤：第48页/共64页(1)亲和层析耦联质谱技术亲和层析耦联质谱技术 基本原理：基本原理：将某种蛋白质以共价键固定在基质将某种蛋白质以共价键固定在基质（如琼脂糖）上，含有与之相互作用的蛋白质（如琼脂糖）上，含有与之相互作用的蛋白质的细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结的细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结合的蛋白质，然后用高盐溶液或合的蛋白质，然后用高盐溶液或SDS溶液洗脱溶液洗脱结合在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱结合在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱耦联质谱技术（耦联质谱技术（MDLC-ESI-MS/MS）鉴定靶蛋）鉴定靶蛋白的结合蛋白。白的结合蛋白。第49页/共64页先决条件先决条件 得到足够多的保持生物活性的重组得到足够多的保持生物活性的重组靶蛋白作为诱饵（靶蛋白作为诱饵（baitbait）获得足够量、纯度高的与诱饵相互获得足够量、纯度高的与诱饵相互作用的蛋白质作用的蛋白质 第50页/共64页利用含靶蛋白的融合蛋白获得利用含靶蛋白的融合蛋白获得相互作用蛋白质相互作用蛋白质谷胱甘肽谷胱甘肽S转移酶（转移酶（glutathione S-transferase，GST）融合蛋白）融合蛋白蛋白蛋白A融合蛋白融合蛋白第51页/共64页主要优点主要优点 灵敏度高：高浓度靶蛋白灵敏度高：高浓度靶蛋白 候选蛋白质与靶蛋白的结合机会均等候选蛋白质与靶蛋白的结合机会均等 检测多亚基蛋白质之间的相互作用检测多亚基蛋白质之间的相互作用 第52页/共64页(2)免疫共沉淀耦联质谱技术免疫共沉淀耦联质谱技术 原理：原理：以细胞内源性靶蛋白为诱饵以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用抗靶用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀（immuno-precipitation，IP）纯化靶蛋白纯化靶蛋白免疫复合物免疫复合物，凝胶电泳分离后凝胶电泳分离后，质谱鉴定靶质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。蛋白的结合蛋白。第53页/共64页研究鼻咽癌细胞系中的研究鼻咽癌细胞系中的p53相互作用蛋白相互作用蛋白抗抗p53抗体与抗体与HNE1和和HNE2总蛋白进行免疫总蛋白进行免疫共沉淀共沉淀SDS-PAGE分离免疫沉淀复合物分离免疫沉淀复合物切取切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱（联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析，得到相应）分析，得到相应的肽序列标签的肽序列标签 搜索数据库搜索数据库 第54页/共64页特特 点点 生理条件下蛋白质之间的相互作用生理条件下蛋白质之间的相互作用所有蛋白质与靶蛋白的相互作用所有蛋白质与靶蛋白的相互作用可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用 第55页/共64页局局 限限 性性A.灵敏性不高灵敏性不高 B.假阳性假阳性C.受免疫球蛋白的干扰较大受免疫球蛋白的干扰较大 第56页/共64页Biacore基于基于表面等离子共振表面等离子共振(SPR)进行生物大分子相互作用分析进行生物大分子相互作用分析(BIA)质谱质谱(MALDI-TOF-MS或或LC-ESI-MS/MS)鉴定鉴定Biacore芯片上配体所捕芯片上配体所捕获的生物分子获的生物分子(3)生物传感器耦联质谱技术 组组 成成第57页/共64页 Biacore的基本工作原理的基本工作原理 当生物大分子结合（如蛋白质相互作用）时会引起作用表面(芯片)折射率的变化，这种光信号可被光感受器接受并转换成电信号传送到计算机，再由计算机还原为模拟的生物信号。第58页/共64页(4)串联亲和纯化耦联质谱技术串联亲和纯化耦联质谱技术 基本原理：基本原理：在靶蛋白一端或中部嵌入蛋白质标记（在靶蛋白一端或中部嵌入蛋白质标记（TAP Tag），经过特异性的），经过特异性的两步亲和纯化，在生理条件下与靶蛋白相互作用的蛋白质便可洗脱下来，然两步亲和纯化，在生理条件下与靶蛋白相互作用的蛋白质便可洗脱下来，然后用质谱技术对得到的蛋白质复合体进行鉴定。后用质谱技术对得到的蛋白质复合体进行鉴定。第59页/共64页主要流程主要流程 双重分子标签构建到靶蛋白双重分子标签构建到靶蛋白表达融合蛋白表达融合蛋白 制备细胞裂解液制备细胞裂解液 IgG柱纯化柱纯化 TEV蛋白酶的洗脱液洗脱蛋白质复合体蛋白酶的洗脱液洗脱蛋白质复合体 第60页/共64页 耦联钙调素的亲和柱纯化耦联钙调素的亲和柱纯化 洗脱洗脱 含含EGTA的洗脱液洗脱的洗脱液洗脱 质谱鉴定结合蛋白质质谱鉴定结合蛋白质 续：续：第61页/共64页特特 点点获得生理条件下与靶蛋白相互作用获得生理条件下与靶蛋白相互作用的蛋白质的蛋白质 鉴定出在空间上非直接物理相互作鉴定出在空间上非直接物理相互作用的蛋白质用的蛋白质适用于大规模蛋白质相互作用研究适用于大规模蛋白质相互作用研究 第62页/共64页第63页/共64页感谢您的观看！第64页/共64页