实验七酶联免疫吸附试验幻灯片.ppt

实验七酶联免疫吸附试验第1页，共11页，编辑于2022年，星期五一、实验目的l掌握酶联免疫吸附实验的操作过程和原理。第2页，共11页，编辑于2022年，星期五二、实验原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。第3页，共11页，编辑于2022年，星期五第4页，共11页，编辑于2022年，星期五三、实验材料l聚乙烯塑料酶标板（PH9.6时可吸附蛋白Ag）l抗原：伤寒杆菌O901煮沸或超声波粉碎抗原l待测血清l冻干酶联葡萄球菌A蛋白（HRDproteinA）纯品l邻苯二胺（OPD）l包被液：0.05M碳酸钠碳酸氢钠溶液PH9.6l稀释液：10%免疫血清PBS吐温20，防止非特异性吸附l洗涤液：0.02MTrisTWeen20,Ph7.4防止非特异性吸附l底物溶液：0.02M磷酸氢二钠25.7毫升，0.1M柠檬酸24.3毫升，蒸馏水50毫升。临用前新鲜配制，在上述缓冲液中溶解40毫克邻苯二胺，然后加入30%双氧水0.15毫升，底物对光敏感，需要避光并立即使用。l终止液；2M硫酸第5页，共11页，编辑于2022年，星期五四、实验步骤1抗原包被抗原包被取洁净的聚苯乙烯微量反应板，于每孔内加伤寒抗原0.1毫升（用包被缓冲液稀释，蛋白含量10微克/毫升），置371小时，弃抗原液，用洗涤液3次每次3分钟。第6页，共11页，编辑于2022年，星期五2加待测血清加待测血清于每孔内分别加不同稀释度（如1：5，1：10，1：201：80）的待测血清，PBS空白对照，阴性对照血清，阳性对照血清各0.1毫升。置3730分钟，洗涤3次。第7页，共11页，编辑于2022年，星期五3加酶联加酶联A蛋白蛋白于每孔加酶联A蛋白各0.1毫升，置3720分钟，洗涤3次。第8页，共11页，编辑于2022年，星期五4加底物溶液加底物溶液加临时配制的底物溶液各0.1毫升，置暗处15分钟。加2M碳酸1滴终止反应。第9页，共11页，编辑于2022年，星期五5测定光吸收测定光吸收以酶标仪测定492nm处的光吸收。第10页，共11页，编辑于2022年，星期五五、实验报告l总结ELISA的实验过程。l分析实验结果。第11页，共11页，编辑于2022年，星期五