实验九底物浓度对酶促反应速度的影响幻灯片.ppt

实验九底物浓度对酶促反应速度的影响第1页，共13页，编辑于2022年，星期五 实验目的实验目的 1 1 了解底物浓度对酶促反应速度的影响。了解底物浓度对酶促反应速度的影响。2 2 学习测定米氏常数的原理和方法。学习测定米氏常数的原理和方法。第2页，共13页，编辑于2022年，星期五 实验原理实验原理19131913年，年，MichaelisMichaelis和和MentenMenten提出了酶促反应速度和底物浓度的关提出了酶促反应速度和底物浓度的关系式，即米氏方程。系式，即米氏方程。VS/(Km+S)VS/(Km+S)式中：式中：为反应初速度为反应初速度 V V为最大反应速度为最大反应速度 S S为底物浓度为底物浓度 Km Km为米氏常数为米氏常数 Km Km值是酶的一个特征性常数，可近似表示酶与底物的亲和力。值是酶的一个特征性常数，可近似表示酶与底物的亲和力。Lineweaver-Burk Lineweaver-Burk作图法是用实验方法测定作图法是用实验方法测定KmKm值的最常用的方值的最常用的方法。法。第3页，共13页，编辑于2022年，星期五LineweaverLineweaverLineweaverLineweaverBurkBurkBurkBurk的作图法的作图法的作图法的作图法 双倒数作图法双倒数作图法双倒数作图法双倒数作图法。1 Km 1 1 =+V Vmax S Vmax取米氏方程式的倒数形式：取米氏方程式的倒数形式：取米氏方程式的倒数形式：取米氏方程式的倒数形式：1/Vmax斜率斜率=Km/Vmax-1/Km米氏常数米氏常数KmKm的测定的测定第4页，共13页，编辑于2022年，星期五n 实实验验时时选选择择不不同同的的SS，测测定定相相对对应应的的。求求出出两两者者的的倒倒数数，以以1/1/对对1/S1/S作作图图，则则得得到到一一个个斜斜率率为为K Km m/V/V的的直直线线。将将直直线线外外推推与与横横轴轴相相交交，其其横横轴轴截截矩矩为为：1/S1/S1/1/K Km m，由由此此求求出出K Km m值值。该法比较简便。该法比较简便。n 本本实实验验以以胰胰蛋蛋白白酶酶消消化化酪酪蛋蛋白白为为例例，采采用用Lineweaver-BurkLineweaver-Burk双倒数作图法测定双倒数作图法测定K Km m值。值。n 胰胰蛋蛋白白酶酶能能催催化化蛋蛋白白质质中中碱碱性性氨氨基基酸酸（L L精精氨氨酸酸和和L L赖赖氨氨酸酸）的的羧羧基基所所形形成成的的肽肽键键水水解解。水水解解时时生生成成自自由由氨氨基基酸酸，故故可可用用甲甲醛醛滴滴定定法法判判断断自自由氨基增加的数量来追踪反应。由氨基增加的数量来追踪反应。第5页，共13页，编辑于2022年，星期五n甲甲醛醛滴滴定定法法 由由于于氨氨基基酸酸分分子子在在溶溶液液中中主主要要是是两两性性离离子子，故故不不能能用用酸酸、碱碱滴滴定定其其含含量量。但但氨氨基基酸酸的的氨氨基基可可与与甲甲醛醛反反应应生生成成羟羟甲甲基基和和二二羟羟甲甲基基氨氨基基酸酸，使使上上述述平平衡衡向向右右移移动动，促促使使氨氨基基酸酸分分子子上上的的一一NH3NH3十十基基解解离释放出离释放出 H+H+，从而使溶液酸性增加，就可以酚酞作指示剂用，从而使溶液酸性增加，就可以酚酞作指示剂用 NaOH NaOH来滴定。来滴定。第6页，共13页，编辑于2022年，星期五n小知识点：小知识点：n酚酞是碱性指示剂（变色范围是碱性），酸滴酚酞是碱性指示剂（变色范围是碱性），酸滴碱时用碱性指示剂；反之碱滴酸时用酸性指示碱时用碱性指示剂；反之碱滴酸时用酸性指示剂比如甲基橙甲基红。剂比如甲基橙甲基红。第7页，共13页，编辑于2022年，星期五n三、器材三、器材 n 锥形瓶锥形瓶 滴定管滴定管 移液管移液管 水浴锅水浴锅 量筒量筒等等n四、试剂与材料四、试剂与材料n 1.1.酪蛋白酪蛋白n 2.2.胰蛋白酶胰蛋白酶n 3.3.甲醛甲醛n 4.4.酚酞酚酞n 5.5.氢氧化钠氢氧化钠第8页，共13页，编辑于2022年，星期五 五、操作五、操作 分分别别向向6 6个个小小锥锥形形瓶瓶中中加加入入5 5 mLmL甲甲醛醛溶溶液液和和1 1滴滴酚酚酞酞，并并滴滴加加0.1 0.1 mol/Lmol/L标标准准氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液，直直至至混混合合物物呈呈微微粉红色。注意：每个锥形瓶中的颜色应一致。粉红色。注意：每个锥形瓶中的颜色应一致。取取100 100 mLmL酪酪蛋蛋白白溶溶液液，加加入入另另一一锥锥形形瓶瓶中中，在在3737水水浴浴中中保保温温1010分分钟钟。将将胰胰蛋蛋白白酶酶也也在在37 37 水水浴浴中中保保温温1010分分钟钟。然后精确量取然后精确量取10 mL10 mL酶液加到酪蛋白溶液中（同时计时）。酶液加到酪蛋白溶液中（同时计时）。第9页，共13页，编辑于2022年，星期五 充充分分混混合合后后，随随即即取取出出10 10 mLmL反反应应混混合合物物（作作为为零零时时的的样样品品）吹吹至至一一含含甲甲醛醛的的锥锥形形瓶瓶中中。用用0.1 0.1 mol/LNaOHmol/LNaOH溶溶液液滴滴定定，直直至至混混合合物物呈呈微微粉粉红色，红色，记下所用记下所用0.1 mol/LNaOH0.1 mol/LNaOH溶液的溶液的mLmL数。数。第10页，共13页，编辑于2022年，星期五 在在2 2、4 4、6 6、8 8和和1010分钟时，分别取出分钟时，分别取出10 mL10 mL消化样消化样品，准确照上法操作。注意：在每个样品中滴定终点的品，准确照上法操作。注意：在每个样品中滴定终点的颜色应当一致。用增加的滴定度对时间作图，测定初速颜色应当一致。用增加的滴定度对时间作图，测定初速度。度。配制不同浓度的酪蛋白溶液（配制不同浓度的酪蛋白溶液（7.57.5、1010、1515、2020、30 30 g/Lg/L）测定不同底物浓度时的活力。）测定不同底物浓度时的活力。用实验测得的结果，以以用实验测得的结果，以以1/1/对对1/S1/S作图，求出作图，求出V V和和KmKm的数值。的数值。第11页，共13页，编辑于2022年，星期五n【注意事项】【注意事项】n1 1实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反应的进行，酶在一定作用并加速逆反应的进行，酶在一定pHpH及温度下部分失及温度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。活等。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。n2 2本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。因此配制各种底物应尽量减少实验操作中带来的误差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。各种试剂的加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应各种试剂的加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时间。时间。第12页，共13页，编辑于2022年，星期五n【实验结果】【实验结果】n1 1测定并计算酶促反应速度。测定并计算酶促反应速度。n2 2用实验所得的反应速度，对相应的底物浓用实验所得的反应速度，对相应的底物浓度作图。度作图。第13页，共13页，编辑于2022年，星期五