第十二章基因工程育种.ppt

第十二章基因工程育种第一节第一节概述概述广义的基因工程育种概念：广义的基因工程育种概念：包括所有利用包括所有利用DNA重组技术将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得前者的某些优良性重组技术将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得前者的某些优良性状或者利用后者作为表达场所来生产目的产物。状或者利用后者作为表达场所来生产目的产物。真正意义的微生物基因工程育种：真正意义的微生物基因工程育种：指的是哪些以微生物本身为出发菌株，利用基因工程方法进行改造而获得的工程菌，或是指的是哪些以微生物本身为出发菌株，利用基因工程方法进行改造而获得的工程菌，或是将微生物甲的某种基因导入到微生物乙中，使后者具有前者的某些性状或表达前者的基因产物将微生物甲的某种基因导入到微生物乙中，使后者具有前者的某些性状或表达前者的基因产物而获得的新菌种。而获得的新菌种。基因工程基因工程(geneengineering)常和以下名称混用常和以下名称混用遗传工程遗传工程(genetic engineering);基因克隆基因克隆(gene cloning);分子克隆分子克隆(molecular cloning);基因操作基因操作(gene manipulation);重组重组DNA技术技术(recombination DNA technique)克隆克隆(clone):作名词时，指含有某目的作名词时，指含有某目的DNA片段的重组片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无分子或含有该重组分子的无性繁殖系。作动词时，是指基因的分离与重组过程。性繁殖系。作动词时，是指基因的分离与重组过程。一、基因工程在微生物育种中的应用一、基因工程在微生物育种中的应用（一）通过基因工程方法生产药物（一）通过基因工程方法生产药物1.治疗用药物：如干扰素、胰岛素、白细胞介素等；治疗用药物：如干扰素、胰岛素、白细胞介素等；2.疫苗：甲肝疫苗、乙肝疫苗等；疫苗：甲肝疫苗、乙肝疫苗等；3.单克隆抗体及诊断试剂：前列腺磷酸酶等；单克隆抗体及诊断试剂：前列腺磷酸酶等；（二）通过基因工程方法提高菌种的生产能力（二）通过基因工程方法提高菌种的生产能力（三）通过基因工程方法改进传统发酵工艺（三）通过基因工程方法改进传统发酵工艺（四）通过基因工程方法提高菌种抗性（四）通过基因工程方法提高菌种抗性（五）构建超级工程菌应用与环境保护（五）构建超级工程菌应用与环境保护二、基因工程原理和步骤二、基因工程原理和步骤 基因工程是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质基因工程是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNADNA分子提取出来，在离体条分子提取出来，在离体条件下进行件下进行“切割切割”，获得代表某一性状的目的基因，把该目的基因与作为载体的，获得代表某一性状的目的基因，把该目的基因与作为载体的DNADNA分子连接分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的目的基因在受体细胞中进行正常的复制和表达，起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的目的基因在受体细胞中进行正常的复制和表达，从而获得目的产物或改变物种特性。从而获得目的产物或改变物种特性。主要步骤包括：主要步骤包括：1、目的基因的获得（、目的基因的获得（DNA片段的取得）片段的取得）2、重组体、重组体DNA（DNA片段和载体的连接）片段和载体的连接）3、外源、外源DNA片段引入受体细胞片段引入受体细胞基因克隆和基因文库基因克隆和基因文库4、目的基因的表达和重组体的筛选、目的基因的表达和重组体的筛选切切接接转转检检三、基因工程的研究意义三、基因工程的研究意义概括地讲，其意义体现在以下三个方面：概括地讲，其意义体现在以下三个方面：1.1.大规模生产生物分子；大规模生产生物分子；2.2.设计构建新物种；设计构建新物种；3.搜集、分离、鉴定生物信息资源。搜集、分离、鉴定生物信息资源。（一）第四次工业大革命：（一）第四次工业大革命：1980年年11月月15日，美国纽约证券交易所开盘的日，美国纽约证券交易所开盘的20分钟内，分钟内，Genentech公司的新上市股要从公司的新上市股要从3.5$上至上至89$，胰岛素基因表达，胰岛素基因表达.1.1.轻工食品：氨基酸、助鲜剂、甜味剂、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶蛋白酶、生物拆分混旋体轻工食品：氨基酸、助鲜剂、甜味剂、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶蛋白酶、生物拆分混旋体.2.2.能源：石油二次开采、纤维素分解、太阳能转换能源：石油二次开采、纤维素分解、太阳能转换.3.3.环保：微生物生态种群环保：微生物生态种群.4.信息：蛋白芯片、基因芯片信息：蛋白芯片、基因芯片.（二）第二次农业大革命（二）第二次农业大革命1.生物农药：蛋白类杀虫剂、抗广谱虫害植物；生物农药：蛋白类杀虫剂、抗广谱虫害植物；2.农作物品种改良；高营养、长保存、抗环境压力、花卉颜色与型状；农作物品种改良；高营养、长保存、抗环境压力、花卉颜色与型状；3.畜牧业；高蛋白乳汁、鱼生长激素、饲料利用率畜牧业；高蛋白乳汁、鱼生长激素、饲料利用率;4.生物肥料：生物固氮生物肥料：生物固氮。全球商业化转基因作物的概况全球商业化转基因作物的概况 种植面积：全球转基因作物的种植总面积为种植面积：全球转基因作物的种植总面积为44204420万公顷万公顷 地地区区分分布布：全全球球主主要要的的种种植植大大国国美美国国、阿阿根根廷廷、加加拿拿大大、澳澳大大利利亚亚的的种种植植面面积积占占全全球球总总面面积积的的9999，其其中中美美国国6868、阿阿根根廷廷2323、加加拿拿大大7 7、澳澳大大利利亚亚1 1，余余下下的的1 1为为墨墨西西哥哥、西班牙、法国和南非等国家西班牙、法国和南非等国家 品种分布比例：大豆约占品种分布比例：大豆约占5858，玉米约占，玉米约占2323，棉花约，棉花约 占占1212，油菜籽约占，油菜籽约占6 6，其它为，其它为1 1（三）（三）第二次医学大革命：第二次医学大革命：1.分子病：基因治疗遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆症、分子病：基因治疗遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆症、骨质疏松症骨质疏松症。2.抗衰老：端粒酶编码基因抗衰老：端粒酶编码基因，基因疗法，补充突变基因原始产物、更换突变基因，基因疗法，补充突变基因原始产物、更换突变基因医学方面的应用前景医学方面的应用前景基因制药基因制药基因治疗基因治疗基因诊断基因诊断基因克隆基因克隆基因芯片基因芯片基因工程药物的高回报基因工程药物的高回报碱性成纤维细胞生长因子碱性成纤维细胞生长因子231元元/g红细胞生成素红细胞生成素1072元元/g白细胞介素白细胞介素-2410元元/g巨细胞粒细胞集落刺激因子巨细胞粒细胞集落刺激因子1960元元/g胰岛素胰岛素10.2元元/g四、基因工程的负面影响四、基因工程的负面影响现代战争狂人、恐怖主义者利用转基因技术制造难以制服的病原体和生物毒剂。现代战争狂人、恐怖主义者利用转基因技术制造难以制服的病原体和生物毒剂。转基因的超级细菌、病毒一旦从实验室逃逸。转基因的超级细菌、病毒一旦从实验室逃逸。给人类带来难以预测的危害。给人类带来难以预测的危害。第二节第二节基因工程载体基因工程载体载体：是携带目的基因并将其转移至受体细胞内复制和表达的运载工具。作为载体载体：是携带目的基因并将其转移至受体细胞内复制和表达的运载工具。作为载体DNA分子，分子，应该具备以下一些基本性质：应该具备以下一些基本性质：1.在宿主细胞中具有自主复制和表达的能力；在宿主细胞中具有自主复制和表达的能力；2.能与外来能与外来DNA分子片段结合而又不影响本身的复制能力；分子片段结合而又不影响本身的复制能力；3.载体本身的分子量要尽可能地小，便于多拷贝，便于与较大的目的基因结合。载体本身的分子量要尽可能地小，便于多拷贝，便于与较大的目的基因结合。4.载体上最好有两个以上容易检测的遗传标记；载体上最好有两个以上容易检测的遗传标记；5.载体上应具有载体上应具有2个以上的限制性内切酶的单一切点。个以上的限制性内切酶的单一切点。一、质粒载体一、质粒载体（一）质粒载体的选择标记（一）质粒载体的选择标记四环素四环素(tetr)；氨苄青霉素；氨苄青霉素(ampr)；氯霉素；氯霉素(catr)；卡那霉素（；卡那霉素（kanr）。）。（二）质粒载体的发展（二）质粒载体的发展质粒构建的发展趋势主要是调整载体的结构，提高载体的效率。质粒构建的发展趋势主要是调整载体的结构，提高载体的效率。（1）将载体的长度减至最小；）将载体的长度减至最小；（2）增加质粒载体内有用的限制酶切点的数目，而且使分布更加合理；）增加质粒载体内有用的限制酶切点的数目，而且使分布更加合理；（3）在质粒中引入多种用途的辅助序列，使它们可以用于以下目的：）在质粒中引入多种用途的辅助序列，使它们可以用于以下目的：1.可用组织化学方法鉴定重组体的质粒载体可用组织化学方法鉴定重组体的质粒载体如如pUC质粒，可以编码质粒，可以编码-半乳糖苷酶氨基端的一个片段。半乳糖苷酶氨基端的一个片段。2.带有单链噬菌体复制起点的质粒载体带有单链噬菌体复制起点的质粒载体如如M13噬菌体。噬菌体。3.带有噬菌体启动子的质粒载体带有噬菌体启动子的质粒载体4.可对重组体进行正选择的质粒载体可对重组体进行正选择的质粒载体如编码如编码tetr的质粒载体。的质粒载体。（三）常用质粒载体（三）常用质粒载体1.pBR322：应用最多。：应用最多。2.pUC18、pUC193.pUC118、pUC1194.pSP64、pSP65、pGEM-3Z、pGEM-3Zf(-)、pGEM-4、pGEM-4Z5.AN136.BluescriptM13+、M13二、二、噬菌体载体噬菌体载体噬菌体载体只适合作外源噬菌体载体只适合作外源DNA小片段的载体。小片段的载体。（一）（一）噬菌体载体的特点噬菌体载体的特点（二）（二）常用常用噬菌体载体噬菌体载体1.gt112.Charon系列载体系列载体三、柯斯质粒载体三、柯斯质粒载体专门用来克隆大专门用来克隆大DNA片段的人工构建的新载体。片段的人工构建的新载体。第三节第三节基因工程所用的酶基因工程所用的酶一、限制性内切核酸酶一、限制性内切核酸酶能识别能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其附近切割双链的特异序列，并在识别位点或其附近切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。如如EcoRI的切割方式：的切割方式：5GAATTC33CTTAAG5二、二、DNA聚合酶聚合酶 1.大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 2.大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶大片段（大片段（Klenow片段）片段）3.T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶 4.T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶 5.Taq噬菌体噬菌体DNA聚合酶及聚合酶及Ampil TaqTM DNA聚合酶聚合酶 6.反转录酶反转录酶 7.末端转移酶末端转移酶三、依赖于三、依赖于DNA的的RNA聚合酶聚合酶 1.SP6噬菌体噬菌体RNA聚合酶聚合酶 2.T3和和T7噬菌体噬菌体RNA聚合酶聚合酶四、连接酶、激酶及磷酸酶四、连接酶、激酶及磷酸酶五、核酸酶五、核酸酶 1.BAL31核酸酶核酸酶 2.S1核酸酶核酸酶 3.核糖核酸酶核糖核酸酶A 4.核糖核酸酶核糖核酸酶T1 5.脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶 6.外切核酸酶外切核酸酶 7.噬菌体外切核酸酶噬菌体外切核酸酶第四节第四节基因工程的主要步骤基因工程的主要步骤一、一、DNA的制备的制备（一）质粒（一）质粒DNA的制备的制备1.细菌培养物的生长细菌培养物的生长2.质粒质粒DNA的纯化的纯化3.细菌染色体细菌染色体DNA的制备的制备二、目的基因的产生与分离二、目的基因的产生与分离1.聚合酶链式反应：聚合酶链式反应：PCR法法2.逆转录法：建立逆转录法：建立cDNA文库文库3.从基因所在的生物体直接取得：限制性内切核酸酶从基因所在的生物体直接取得：限制性内切核酸酶。4.化学合成法：化学合成法：DNA合成仪。合成仪。（一）（一）PCR类似于类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变由变性性-退火退火-延伸三个基本反应步骤构成：延伸三个基本反应步骤构成：模板模板DNA引物引物4种种dNTPTaqDNA聚合酶聚合酶含含Mg2+的缓冲液。的缓冲液。PCR的反应体系的反应体系（1）变性：加热至）变性：加热至95，使模板，使模板DNA解开成单链；解开成单链；（2）退火：温度降至适宜，使引物与模板互补结合；）退火：温度降至适宜，使引物与模板互补结合；（3）延伸：温度升至）延伸：温度升至72，DNA聚合酶以聚合酶以4种种dNTP为底物，在引物的为底物，在引物的3-OH上，合成与模板互补上，合成与模板互补的的DNA新链。新链。PCR的基本反应步骤及原理的基本反应步骤及原理PCR反应的基本原理反应的基本原理（三）逆转录法（三）逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成互补，再反转录成互补DNA，然后进行，然后进行互补互补DNA的克隆表达。的克隆表达。逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T1、mRNA的纯化的纯化：可以用亲和层析法将可以用亲和层析法将mRNA从细胞总从细胞总RNA上分离出来，可得到纯度较高的上分离出来，可得到纯度较高的mRNA。2、互补、互补DNA第一链的合成第一链的合成mRNA的的3末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡聚脱氧胸苷酸为引物，在逆转录酶的末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡聚脱氧胸苷酸为引物，在逆转录酶的催化下，开始互补催化下，开始互补DNA的合成。的合成。3、互补、互补DNA第二条链的合成第二条链的合成 先用碱解或核酸酶酶解的方法除去互补先用碱解或核酸酶酶解的方法除去互补DNA-mRNA杂交链中的杂交链中的mRNA链，然后以互补链，然后以互补DNA第一链为模板合成第二链，并用核酸酶第一链为模板合成第二链，并用核酸酶S1专一性切除单链专一性切除单链DNA。4 4、互补、互补DNADNA克隆克隆 根据重组后插入的互补根据重组后插入的互补DNA是否能够表达、能否经转录和翻译合成蛋白质，又将载体是否能够表达、能否经转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为表达型载体和非表达型载体。分为表达型载体和非表达型载体。（三）从基因所在的生物体直接取得（三）从基因所在的生物体直接取得鸟鸟枪枪法法（四）（四）化学合成法化学合成法 其先决条件是已知目的基因的核苷酸序列，或已知蛋白质的氨基酸序列，按相应的密码子推其先决条件是已知目的基因的核苷酸序列，或已知蛋白质的氨基酸序列，按相应的密码子推导出导出DNA的碱基序列。用化学方法合成目的基因不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成的碱基序列。用化学方法合成目的基因不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘末端的为两端形成粘末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。片段，再用连接酶连接成完整的基因。由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列人工化学合成的限制人工化学合成的限制1、不能合成太长的基因，、不能合成太长的基因，50-60个碱基对；个碱基对；2、人工合成碱基对时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大的困难；、人工合成碱基对时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大的困难；3、费用较高。、费用较高。三、外源基因与载体的连接三、外源基因与载体的连接1.1.粘性末端连接粘性末端连接方式：方式：(1)(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接二、克隆载体的选择和构建二、克隆载体的选择和构建Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同同一一限限制制酶酶切切位位点点连连接接不同限制酶切位点的连接不同限制酶切位点的连接Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+EcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的连接情况和同配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。一限制酶切位点连接相似。2.平端连接平端连接适用于：（适用于：（1）限制性内切酶切割产生的平端）限制性内切酶切割产生的平端（2）粘端补齐或切平形成的平端）粘端补齐或切平形成的平端目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连3.3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接 在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)(terminal transferase)的作用下，在的作用下，在DNADNA片段末端加上同聚物序列、制片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。造出粘性末端，再进行粘端连接。5335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3355 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+dATP末端转移酶末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体4.4.人工接头人工接头(linker)(linker)连接连接 由平端加上带有新的酶切位点的接头，再用限制性酶切产生粘性末端，而进行粘端连由平端加上带有新的酶切位点的接头，再用限制性酶切产生粘性末端，而进行粘端连接。接。Eco REco REco R人人工工接接头头及及其其应应用用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco R1.1.受体菌条件受体菌条件 （1 1）安全宿主菌）安全宿主菌 （2 2）限制酶和重组酶缺陷）限制酶和重组酶缺陷 （3 3）处于感受态）处于感受态(competent)(competent)四、重组四、重组DNADNA导入受体菌导入受体菌2.导入方式导入方式（1）大肠杆菌感受态细胞的制备和转化大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（2）高压电穿孔转化大肠杆菌（电转化法）高压电穿孔转化大肠杆菌（电转化法）五、重组体的筛选五、重组体的筛选1.1.直接选择法直接选择法(1)(1)小规模制备质粒小规模制备质粒DNADNA进行限制性酶切分析进行限制性酶切分析(2)(2)插入失活法插入失活法(3)(3)互补法互补法(4)(4)菌落原位杂交法菌落原位杂交法2.2.免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等(1)小规模制备质粒小规模制备质粒DNA进行限制性酶切分析进行限制性酶切分析(插插入入失失活活法法)（2 2）、抗抗药药性性标标记记选选择择（3 3）互补的互补的检测检测X-gal：(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)原位杂原位杂交交重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交表达体系的建立表达体系的建立1.表达载体的构建表达载体的构建2.受体细胞的建立受体细胞的建立3.表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化六、目的基因的表达六、目的基因的表达1.原核表达体系原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）表达体系最为常用）标准：选择标志标准：选择标志强启动子强启动子翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点E.coli表达体系的不足：表达体系的不足：A.不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNAB.不能加工表达的真核蛋白质不能加工表达的真核蛋白质C.表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体D.很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白优点：可表达克隆的优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、费钱缺点：操作技术难、费时、费钱转染转染将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：磷酸钙转染方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔脂质体转染脂质体转染显微注射显微注射2.真核表达体系真核表达体系酵母、昆虫、哺乳类动物细胞酵母、昆虫、哺乳类动物细胞七、基因重组菌的培养七、基因重组菌的培养(一）工业使用的基因工程菌应具备的条件一）工业使用的基因工程菌应具备的条件一）工业使用的基因工程菌应具备的条件一）工业使用的基因工程菌应具备的条件1 1、重组的工程菌最好是分泌型菌株。、重组的工程菌最好是分泌型菌株。、重组的工程菌最好是分泌型菌株。、重组的工程菌最好是分泌型菌株。2 2、菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。、菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。、菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。、菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。3 3、菌株必须是不致病的，也不产生内毒素。、菌株必须是不致病的，也不产生内毒素。、菌株必须是不致病的，也不产生内毒素。、菌株必须是不致病的，也不产生内毒素。4 4、发酵所产生的热量和需氧量都低，发酵温度是适当。、发酵所产生的热量和需氧量都低，发酵温度是适当。、发酵所产生的热量和需氧量都低，发酵温度是适当。、发酵所产生的热量和需氧量都低，发酵温度是适当。5 5、代谢控制容易进行。、代谢控制容易进行。、代谢控制容易进行。、代谢控制容易进行。6 6、重组菌形状稳定。、重组菌形状稳定。、重组菌形状稳定。、重组菌形状稳定。（二）重组（二）重组（二）重组（二）重组DNADNA实验准则实验准则实验准则实验准则19741974年，有人提出了年，有人提出了年，有人提出了年，有人提出了DNADNA重组实验具有潜在生物危险性时问题。后来，美、日等都制定重组实验具有潜在生物危险性时问题。后来，美、日等都制定重组实验具有潜在生物危险性时问题。后来，美、日等都制定重组实验具有潜在生物危险性时问题。后来，美、日等都制定了有关了有关了有关了有关DNADNA重组实验的准则，这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据对实验重组实验的准则，这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据对实验重组实验的准则，这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据对实验重组实验的准则，这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据对实验安全度的评定采用物理密封安全度的评定采用物理密封安全度的评定采用物理密封安全度的评定采用物理密封(P1(P1P4)P4)和生物学密封和生物学密封和生物学密封和生物学密封(BI(BI和和和和B2)B2)两种方法。两种方法。两种方法。两种方法。1、物理密封、物理密封物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。实验规模在实验规模在实验规模在实验规模在20L20L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封程度分为程度分为程度分为程度分为P1P1、P2P2、P3P3和和和和P4P4级，数字越大，密封水平越高。级，数字越大，密封水平越高。级，数字越大，密封水平越高。级，数字越大，密封水平越高。2、生物学密封、生物学密封生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的裁体，通过这样组合的宿主裁体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分裁体，通过这样组合的宿主裁体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分裁体，通过这样组合的宿主裁体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分裁体，通过这样组合的宿主裁体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分BIBI和和和和B2B2级，级，级，级，B2B2级的密封要求最严格。级的密封要求最严格。级的密封要求最严格。级的密封要求最严格。进行重组菌培养时的设备标准有进行重组菌培养时的设备标准有进行重组菌培养时的设备标准有进行重组菌培养时的设备标准有LS-1LS-1和和和和LS-2LS-2。LS-2LS-2相当严格，工业生产起码应在相当严格，工业生产起码应在相当严格，工业生产起码应在相当严格，工业生产起码应在LS-1LS-1的设备标准下培养。的设备标准下培养。的设备标准下培养。的设备标准下培养。LS-lLS-l标准要点是：标准要点是：标准要点是：标准要点是：(1)(1)使用防止重组菌体外漏，能在密闭状态下进行内部灭菌的培养装置使用防止重组菌体外漏，能在密闭状态下进行内部灭菌的培养装置使用防止重组菌体外漏，能在密闭状态下进行内部灭菌的培养装置使用防止重组菌体外漏，能在密闭状态下进行内部灭菌的培养装置(2)(2)培养装置的排气由除菌器排出培养装置的排气由除菌器排出培养装置的排气由除菌器排出培养装置的排气由除菌器排出(3)(3)使用易产气溶胶的设备时，要安装可收集气溶胶的安全箱等。使用易产气溶胶的设备时，要安装可收集气溶胶的安全箱等。使用易产气溶胶的设备时，要安装可收集气溶胶的安全箱等。使用易产气溶胶的设备时，要安装可收集气溶胶的安全箱等。第五节第五节基因定位诱变基因定位诱变基因体外定向诱变的基本方法是先克隆待诱变的目的基因体外定向诱变的基本方法是先克隆待诱变的目的DNA片段，并将它与载体重组，然后在片段，并将它与载体重组，然后在体外对环状重组体进行定位诱变，再将诱变后的体外对环状重组体进行定位诱变，再将诱变后的DNA片段导入受体细胞使其表达目标产物。片段导入受体细胞使其表达目标产物。基因定位诱变的应用基因定位诱变的应用（1）改造酶促反应的）改造酶促反应的Km和和Vmax进而改变酶的催化效率。进而改变酶的催化效率。（2）改造蛋白质的最适）改造蛋白质的最适pH值和温度稳定范围，进而改变酶的作用条件；值和温度稳定范围，进而改变酶的作用条件；（3）改变酶的非水溶剂中的反应性，使酶在非水条件下能起催化作用；）改变酶的非水溶剂中的反应性，使酶在非水条件下能起催化作用；（4）增强酶的专一性，减少不必要的副反应；）增强酶的专一性，减少不必要的副反应；（5）增强酶对胞内蛋白酶的抗性，延长半衰期，使酶的产率得到提高；）增强酶对胞内蛋白酶的抗性，延长半衰期，使酶的产率得到提高；（6）改变酶的别构调节部位，减少反馈抑制，提高产物产率；）改变酶的别构调节部位，减少反馈抑制，提高产物产率；（7）提高酶的抗氧化能力和改变酶的底物专一性等。）提高酶的抗氧化能力和改变酶的底物专一性等。一、定位诱变方法一、定位诱变方法（一）删除法（一）删除法（二）（二）插入法插入法（三）取代法（三）取代法1.特定的特定的G:C变变A:T法法（1）开创）开创DNA单链区单链区先形成单链，再利用先形成单链，再利用DNA聚合酶的降解作用。聚合酶的降解作用。（2）G:C变变A:T单链单链DNA胞嘧啶被胞嘧啶被酸式亚硫酸离子酸式亚硫酸离子作用后反应脱氮基变成尿嘧啶，单链区修补成双链时，作用后反应脱氮基变成尿嘧啶，单链区修补成双链时，A将于将于U配对，此时的配对，此时的U相应于相应于T。2.错配取代错配取代（四）低聚核苷酸诱导法（四）低聚核苷酸诱导法二、将变异基因送回染色体二、将变异基因送回染色体1.体内自发的同源重组体内自发的同源重组将诱变后的将诱变后的DNA分子重新导入细胞后，分子重新导入细胞后，DNA片段会与染色体的同源序列自发重组。缺点是片段会与染色体的同源序列自发重组。缺点是重组的频率低。重组的频率低。2.定位整合作用定位整合作用思考题思考题1.微生物基因工程育种、微生物基因工程育种、cDNA文库文库2.基因克隆载体的基本性质有哪些？基因克隆载体的基本性质有哪些？3.简述基因工程的主要步骤。简述基因工程的主要步骤。